实验性猕猴2型糖尿病模型的建立及评价.doc

www.CRTER.org宋巧巧，等. 实验性猕猴2型糖尿病模型的建立及评价实验性猕猴2型糖尿病模型的建立及评价宋巧巧1，周慧良2，镇海涛1，王 娜1，邓 晶1，王金祥3，潘兴华3 (1湖北科技学院内科教研室，湖北省咸宁市 437100；2咸宁市中心医院，湖北省咸宁市 437100；3解放军昆明总医院干细胞与组织器官工程研究中心，云南省干细胞工程实验室，云南省昆明市 650032)引用本文：宋巧巧，周慧良，镇海涛，王娜，邓晶，王金祥，潘兴华. 实验性猕猴2型糖尿病模型的建立及评价J.中国组织工程研究，2016，20(40):6048-6053.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.40.018 ORCID: 0000-0003-2669-2546(宋巧巧)文章快速阅读：高糖高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素诱导猕猴2型糖尿病模型宋巧巧，女，1987年生，湖北省咸宁市人，汉族，2013年昆明医科大学毕业，硕士，助教，主要从事干细胞移植治疗糖尿病研究。 通讯作者：潘兴华，博士，教授，解放军昆明总医院干细胞与组织器官工程研究中心，云南省干细胞工程实验室，云南省昆明市 650032中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)40-06048-06稿件接受：2016-07-05C-肽释放试验静脉葡萄糖耐量试验 空腹血糖健康猕猴(n=12)实验组(n=9)，高糖高脂饮食喂养4周后，一次性腹腔注射30 mg/kg链脲佐菌素，建立2型糖尿病模型对照组(n=3)，注射等量生理盐水病理检查高糖高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素诱导猕猴2型糖尿病模型成功，是一种简单安全、有效的方法文题释义：2型糖尿病动物模型：关于2型糖尿病动物模型的研究，国内外均主要集中于兔、大鼠、小鼠，其方法涉及自发性动物模型、转基因、高脂饲料诱导和化学诱导等，这些动物模型对2型糖尿病的基础研究和防治具有重要意义，但这些非灵长类种属的动物模型与人类糖尿病的发病改变存在一定差异。非人灵长类动物和人类更为接近，其模型能更好地模拟人类糖尿病病理生理及发病过程，可靠性更高。目前国内外关于2型糖尿病非人灵长类动物模型的研究报道很少，尚缺乏标准化制作方法和评价标准。链脲佐菌素诱导糖尿病模型：链脲佐菌素可选择性破坏一定种属动物的胰岛细胞，能诱发许多动物产生糖尿病，采用一次大剂量静脉注射链脲佐菌素，可导致大部分胰岛细胞出现损伤，出现稳定的高血糖，但这种高血糖状态更为接近于人类的1型糖尿病，与2型糖尿病的胰岛素抵抗具有一定的差距，而小剂量链脲佐菌素对机体的损伤较小，可提高其药物的生物安全性，减少对动物的不良反应，同时还可缩短单纯高热量饮食诱导糖尿病的造模周期。摘要背景：目前国内外关于2型糖尿病的非人灵长类动物模型研究报道很少，缺乏标准化制作方法和评价标准。目的：建立一种安全、有效的猕猴2型糖尿病模型及评价方法。 方法：将12只猕猴随机分为实验组(n=9)与对照组(n=3)，实验组高糖高脂饮食喂养4周后，一次性腹腔注射30 mg/kg链脲佐菌素，建立2型糖尿病模型；对照组注射等量生理盐水。注射第12周，采集外周血血清，测定空腹血糖、血脂、胰岛素、C-肽水平，通过静脉葡萄糖耐量试验、C-肽释放试验检测胰腺胰岛功能，取胰腺、肾脏、肝脏组织行病理组织学检查。结果与结论：注射第12周时，实验组空腹血糖、三酰甘油、总胆固醇均显著高于对照组(P 0.05)，C-肽及胰岛素显著低于对照组(P 0.05)；实验组静脉葡萄糖耐量试验曲线下面积较对照组增大(P 0.05)，C-肽释放试验曲线下面积明显减小(P 0.05)；实验组胰腺、肝脏、肾脏组织切片显示均发生了典型糖尿病病理改变；因此认为高糖高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素诱导猕猴2型糖尿病模型成功，是一种简单安全、有效的方法。关键词：实验动物；内分泌系统损伤与修复动物模型；2型糖尿病；猕猴；链脲佐菌素；高糖高脂饮食；国家自然科学基金主题词：猕猴属；糖尿病，2型；模型，动物；组织工程6049 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 基金资助：国家自然科学基金资助项目(31172170)；湖北科技学院校级课题(KY13065)Establishment and evaluation of a rhesus monkey model of experimental type 2 diabetes mellitusSong Qiao-qiao1, Zhou Hui-liang2, Zhen Hai-tao1, Wang Na1, Deng Jing1, Wang Jin-xiang3, Pan Xing-hua3 (1Department of Internal Medicine, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, Hubei Province, China; 2Xianning Central Hospital, Xianning 437100, Hubei Province, China; 3Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province, Stem Cells and Organ Tissue Engineering Research Center, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command, Kunming 650032, Yunnan Province, China)AbstractBACKGROUND: At present, there are few reports about the non-human primate models of type 2 diabetes mellitus in domestic and abroad, so it lacks of standardized production methods and evaluation criteria.OBJECTIVE: To establish a safe and effective type 2 diabetes mellitus model of rhesus monkey and evaluation method. METHODS: Twelve rhesus monkeys were randomly assigned to experimental group (n=9) and control group (n=3). Rhesus monkeys in the experimental group were fed with high-glucose and high-fat diet for 4 weeks, and intraperitoneally injected with 30 mg/kg streptozotocin to establish models of type 2 diabetes mellitus. Rhesus monkeys in the control group were fed with an equal volume of physiological saline. At 12 weeks after injection, peripheral blood serum was collected to measure fasting blood glucose, lipids, insulin, and C-peptide levels. Intravenous glucose tolerance test and C-peptide release test were used to detect pancreatic gland and pancreatic islet function. Histopathological examination was performed in pancreas, kidney and liver. Song Qiao-qiao, Master, Teaching assistant, Department of Internal Medicine, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, Hubei Province, ChinaCorresponding author: Pan Xing-hua, M.D., Professor, Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province, Stem Cells and Organ Tissue Engineering Research Center, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command, Kunming 650032, Yunnan Province, ChinaRESULTS AND CONCLUSION: (1) 12 weeks after injection, fasting blood glucose, triglycerides, and total cholesterol levels were significantly higher in the experimental group than in the control group (P 0.05). Insulin and C-peptide levels were significantly lower in the experimental group than in the control group (P 0.05). (2) The area under the curve for intravenous glucose tolerance test was increased in the experimental group than in the control group (P 0.05). The area under the curve for C-peptide response test was significantly reduced in the experimental group than in the control group (P 0.05). (3) The pathological sections of pancreas, kidney and liver showed typical pathological changes of diabetes in the experimental group. (4) It is confirmed that we got high achievement about rhesus monkey models of type 2 diabetes mellitus made by high-glucose and high-fat diet combined with low-dose streptozotocin. It is a feasible, safe and effective method. Subject headings: Macaca; Diabetes Mellitus, Type 2; Models, Animal; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 31172170; a grant from Hubei University of Science and Technology, No. KY13065Cite this article: Song QQ, Zhou HL, Zhen HT, Wang N, Deng J, Wang JX, Pan XH. Establishment and evaluation of a rhesus monkey model of experimental type 2 diabetes mellitus. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(40):6048-6053.6051ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一种以高血糖为主要标志的具有多病因的复杂和异质代谢性疾病，发病的主要原因是胰岛素抵抗或胰岛素分泌相对不足。随着人们生活水平的提高，糖尿病发病率呈逐年上升趋势1，但目前的治疗主要为药物治疗，只能控制血糖，而不能防止并发症的发生和根治糖尿病，因此急需建立相应的动物模型，以创建新的有效防治措施。非人灵长类动物在基因、病理生理上与人类非常接近，是理想的模型动物。实验利用高糖高脂饲料饲喂联合化学诱导法构建糖尿病的猕猴模型并探讨其评价标准，为糖尿病新药的开发及其作为临床前期实验提供依据。1 材料和方法 Materials and methods1.1 造模动物及材料 实验动物：5岁龄健康猕猴12只，体质量6-10 kg，雌雄各半，由中国科学院昆明动物研究所提供，许可证号：SYXK(滇)K2013-0012。饲养观察30 d，经空腹血糖、血脂、C-肽检测未见异常，将其随机分为实验组9只和对照组3只。实验试剂：超顺磁性氧化铁颗粒、链脲佐菌素(美国Sigma公司)；DMEM/F12培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)；DAPI(美国Invitrogen公司)；500 g/L葡萄糖注射液(天津药业集团生产)；蛋黄粉(大连绿雪蛋制品发展有限公司)。实验器材：微量血糖仪(强生公司)。1.2 造模方法 实验组猕猴饲喂高糖高脂饲料4周(高糖高脂饲料配方为：蔗糖15%、蛋黄粉20%、猪油20%、玉米粉15%、小麦粉15%、基础饲料15%)，禁食16 h后称体质量，将新鲜配置的链脲佐菌素，用柠檬酸缓冲液(pH=4.3)稀释溶解，过滤除菌，按剂量为30 mg/kg一次性静脉注射，对照组给予注射同等剂量的生理盐水。1.3 主要观察指标 注射链脲佐菌素后12周内，每日观察并记录精神、食欲、饮水量、尿量。注射链脲佐菌素后，每周检测体质量1次、采末梢血测空腹血糖2次，成模标准为：空腹血糖 11.1 mmol/L持续4周。注射链脲佐菌素后，每4周测定总胆固醇、三酰甘油1次；注射链脲佐菌素后第12周，检测胰岛素、C-肽、静脉葡萄糖耐量试验、C-肽释放试验，送医院核医学科放免法检测。注射链脲佐菌素12周后，取对照组、实验组各1只猕猴，采取空气栓塞法处死，均取胰腺、肾脏和肝脏组织行病理组织学检查。1.4 统计学分析 数据以s表示，采用SPSS 17.0 统计软件，组间比较用采用单因素方差分析。P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 实验动物数量分析 实验中实验组均成功诱导成糖尿病，实验过程中无动物死亡。2.2 糖尿病模型的评价 实验组空腹血糖(图1)、血清C-肽、胰岛素(表1)水平与对照组相比差异有显著性意义(P 0.05)，静脉葡萄糖耐量试验(图2)、C-肽释放试验(图3)曲线下面积显示，实验组对葡萄糖刺激反应轻，胰岛细胞的胰岛分泌功能较对照组具有显著差别。表1 两组实验前后外周血中胰岛素、C-肽的变化 (s)Table 1 Changes in C-peptide and insulin levels in peripheral blood in both groups before and after experiment组别C-肽(mg/L)胰岛素(IU)实验前注射12周实验前注射12周对照组3.160.76 3.070.48 53.2811.7053.336.98实验组3.051.370.180.1551.9222.808.264.172.3 空腹血糖浓度检测结果 注射链脲佐菌素后1周，空腹血糖浓度均显著升高，升高至第3周，随后略有下降，保持高血糖状态至第12周。实验组第1-12周血糖水平与对照组相比差异有显著性意义(P 0.05)，见图1。2.4 静脉葡萄糖耐量试验结果 在注射链脲佐菌素第12周，两组猕猴静脉葡萄糖耐量试验血值的变化，见图2。与对照组对比，实验组猕猴第12周静脉糖耐量试验时血糖水平明显升高，其曲线下面积明显增加。实验组在各时间点血糖水平明显升高，曲线下面积明显增加，与对照组相比差异有显著性意义(P 0.05)。说明实验组猕猴出现了糖耐量受损，胰岛素抵抗。2.5 C-肽释放试验结果 在链脲佐菌素注射第12周，两组猕猴静脉葡萄糖耐量试验血清C-肽值的变化，见图3。实验组注射第12周血清C-肽水平明显降低，其曲线下面积明显减少与对照组相比差异有显著性意义(P 0.05)。说明实验组猕猴出现了糖耐量受损，胰岛素抵抗。2.6 血生化指标变化情况 与对照组相比，实验组注射链脲佐菌素12周血清胰岛素、C-肽值均显著下降(P 0.05)，见表1。实验组猕猴在高糖高脂饮食喂养4周后，血脂均有所上升，高血脂状态维持至注射链脲佐菌素12周(即给予高糖高脂饮食16周)，与对照组相比差异有显著性意义(P 0.05)，见表2。表2 两组实验前后外周血中血脂变化情况 (s，mmol/L)Table 2 Changes in blood lipid level in peripheral blood in both groups before and after experiment组别三酰甘油总胆固醇实验前注射12周实验前注射12周对照组0.500.07 0.600.30 2.490.08 2.590.18实验组0.540.221.830.742.560.33 3.710.502.7 病理学检查结果 注射链脲佐菌素12周，实验组胰腺苏木精-伊红染色可见胰岛数目少、胰岛萎缩、结构被破坏，形态不规则、边缘不整齐、形态欠完整等改变；PAS染色可见大量糖原沉积；Masson染色可见胰岛少量残留，胰岛区纤维组织增生，呈现出典型的糖尿病胰腺病变。实验组肾脏苏木精-伊红染色可见肾系膜明显增厚，肾小球肥大，肾小球囊壁有玻璃样物质沉积，肾小球毛细血管嗜酸性物质沉积，肾小球囊内见大量红染物质沉积，纤维化；肾脏PAS染色可见肾小球基质内与毛细血管内皮下有大量糖蛋白沉积；肾脏Masson染色可见小动脉壁增厚，肾小球入球小动脉与出球小动脉EDCBAIJGFHK图4 实验组不同组织病理组织检查结果(400) Figure 4 Histopathologic examination results of different tissues in the experimental group (400)图注：图中A为正常胰腺(苏木精-伊红染色)；B为正常肾脏(苏木精-伊红染色)；C为正常肝脏(苏木精-伊红染色)；D为实验组胰腺(苏木精-伊红染色)；E为实验组肾脏(苏木精-伊红染色)；F为实验组肝脏(苏木精-伊红染色)；G为实验组胰腺(PAS染色)；H为实验组肾脏(PAS染色)；I为实验组肝脏(PAS染色)；J为实验组胰腺(Masson染色)；K为实验组肾脏(Masson染色)。实验组胰腺、肝脏、肾脏组织切片显示均发生了典型糖尿病病理改变。实验组实验组对照组35302520151050空腹血糖(mmol/L)0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 时间(周)图1 实验组与对照组注射后不同时间点血糖变化情况Figure 1 Blood glucose changes in experimental and control groups at various time points after injection图注：实验组第1-12周血糖水平与对照组相比差异有显著性意义(P 0.05)。图2 两组注射后第12周静脉葡萄糖耐量试验结果Figure 2 Results of intravenous glucose tolerance test 12 weeks after injection in both groups图注：实验组在各时间点血糖水平明显升高，曲线下面积明显增加，与对照组相比差异有显著性意义(P 0.05)。403020100时间(min)空腹血糖(mmol/L)0 5 10 20 40 60 对照组对照组6543210C-肽(g/L)0 5 10 20 40 60实验组时间(min)图3 两组注射后第12周C-肽释放试验结果Figure 3 Results of C-peptide response test 12 weeks after injection in both groups 图注：实验组血清C-肽水平明显降低，其曲线下面积明显减少，与对照组相比差异有显著性意义(P 0.05)。发生透明变性，肾小球毛细血管及系膜细胞区可见蓝色结节状物质形成，红染的纤维素样物质沉积于肾小球毛细血管腔内，肾小球肥大，呈现出典型的糖尿病肾脏改变。实验组肝脏苏木精-伊红、PAS染色可见肝索排列紊乱，窦间隙变窄，肝小叶结构破坏，肝细胞体积增大，伴有细胞坏死，可见脂肪滴及大量糖原沉积等肝细胞脂肪病变。对照组胰腺、肾脏、肝脏未见异常，见图4。3 讨论 Discussion进行2型糖尿病防治研究的前提和基础是建立合理动物模型，关于2型糖尿病动物模型的研究，国内外均主要集中于兔、大鼠、小鼠，其方法涉及自发性动物模型、转基因、高脂饲料诱导和化学诱导等2-6，这些动物模型对2型糖尿病的基础研究和防治具有重要意义，但这些非灵长类种属的动物模型与人类糖尿病的发病改变存在一定差异。非人灵长类动物和人类更为接近，其模型能更好地模拟人类糖尿病病理生理及发病过程，可靠性更高。目前国内外关于2型糖尿病非人灵长类动物模型的研究报道很少，尚缺乏标准化制作方法和评价标准7-8。猕猴是第一个被克隆的非人灵长类动物，它的基因组测序与人类基因组相似性高达93%9，且研究发现猕猴有自发糖尿病倾向10，因此猕猴模型是研究人类2型糖尿病发病机制、寻找早期预防、诊断与治疗的方法和技术、进行糖尿病新药的开发的最佳动物模型。研究显示，胰岛素抵抗与血脂紊乱密切相关，糖尿病患者存在明显的脂代谢异常，高热量饮食为其重要诱因，给予高热量饮食易致使其发生血脂紊乱，降低胰岛素的敏感性，从而导致胰岛素抵抗等代谢紊乱的发生11-12。此次实验中的高糖高脂饮食即模拟现代人的饮食结构和饮食习惯，诱导其发生血脂紊乱。链脲佐菌素可选择性破坏一定种属动物的胰岛细胞，能诱发许多动物产生糖尿病，采用一次大剂量静脉注射链脲佐菌素，可导致大部分胰岛细胞出现损伤，出现稳定的高血糖，但这种高血糖状态更为接近于人类的1型糖尿病，与2型糖尿病的胰岛素抵抗具有一定的差距13-21，而小剂量链脲佐菌素对机体的损伤较小，可提高其药物的生物安全性，减少对动物的不良反应，同时还可缩短单纯高热量饮食诱导糖尿病的造模周期。因此实验先采用高糖高脂饮食诱导，使猕猴出现血脂紊乱，再联合小剂量链脲佐菌素进行冲击，使胰岛细胞出现轻微的病理改变，进而出现血糖升高等病理生理改变。此次实验研究中在高糖高脂饲喂4周后，猕猴血脂水平明显升高，血脂升高后再注射链脲佐菌素30 mg/kg，3 d后空腹血糖开始升高，并于注射链脲佐菌素第4周趋于稳定，高血糖状态维持至注射链脲佐菌素12周，此过程中无实验动物的死亡。在注射链脲佐菌素12周，实验组猕猴血空腹血糖、三酰甘油、总胆固醇均显著升高(P 0.05)，C-肽及胰岛素均显著降低(P 0.05)，实验组静脉葡萄糖耐量试验曲线下面积较对照组增大，实验组C-肽释放试验曲线下面积明显减小，显示实验组对葡萄糖刺激反应减轻，葡萄糖耐量受损，出现胰岛素抵抗，胰岛细胞的胰岛分泌功能受到损伤。实验组第12周胰腺、肝脏、肾脏的组织切片显示均发生了显著糖尿病病理改变。因此认为高糖高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素诱导猕猴2型糖尿病模型成功，且成模率高达100%，是一种简单安全、有效的方法。高糖高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素可作为猴糖尿病模型的参考方法，其模型可作为糖尿病相关研究的可靠模型。作者贡献：宋巧巧进行实验设计，实验实施为宋巧巧，实验评估为潘兴华，资料收集为周慧良，宋巧巧成文，潘兴华审校。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验方案经解放军昆明总医院动物实验伦理委员会批准。实验动物在氯胺酮麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Yang W,Lu J,Weng J,et al.Prevalence of Diabetes among Men and Women in China. 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