藻类叶绿素荧光技术.docx

藻类叶绿素荧光测量技术Measuring Algae自从上世纪六十年代Carl Lorenzen（1966）首次将海水泵入安装在考察船上的叶绿素荧光仪进行藻类研究以来，叶绿素荧光技术很快成为海洋湖泊藻类研究的重要技术手段。特别是上世纪九十年代以来，Kolber等（1993,1998）、Trtilek等（1997）、Nedbal等（1999）、Dijkman等（1999）、Koblizek等（1999）等科学家采用P&P技术“pump-and-probe”、双调制技术（Dual-modulation）、FRR技术（fast repetition rate）等对海洋湖泊藻类进行了大量研究，奠定了叶绿素荧光技术在藻类研究监测中的重要地位。下面就一系列国际先进的用于藻类研究监测的叶绿素荧光仪器技术做一简单介绍，进一步的信息及参考文献等可咨询Ecolab实验室（, ）。栅藻（Scenedesmus）FKM叶绿素荧光成像及不同栅藻的叶绿素荧光动态曲线1. FL3500叶绿素荧光仪1995年Trtilek等研制生产了世界上首款FL100双调制叶绿素荧光仪（Trtilek等，1997；Koblizek等，1997；Nedbal等，1999），时间分辨率可达1s。FL3500历经FL100、FL200等几次升级换代，是世界上时间分辨率最高、功能最为强大、配置灵活多样的叶绿素荧光技术仪器，由控制单元（主机）和功能多样化的测量单元组成，其主要功能特点为：1) 通用455nm和625nm蓝光和橙红光双色光源，满足所有藻类叶绿素荧光激发测量；2) 双色调制测量光、双色调制光化学光和双色持续光化学光；3) 除通用蓝光和橙红光双激发光测量单元外，还可选配其它波长的测量单元，组成2个以上多激发光叶绿素荧光系统；4) 既可进行PAM（脉冲调制）测量，还可进行STF单周转光闪、TTF双周转光闪、MTF多周转光闪及FRR程序测量，测量程序（protocols）包括单光闪荧光诱导、OJIP-test、QA再氧化动力学、放氧复合体S状态转换等；5) 可选配时间分辨率为4s的标配测量单元或时间分辨率达1s的快速测量单元，还可选配水下原位叶绿素荧光测量单元及叶夹式测量单元，从而组成功能强大多样化的叶绿素荧光测量系统，既可测量水体微藻叶绿素荧光，还可原位测量水下大型藻类及珊瑚礁藻类叶绿素荧光，及高等植物叶片叶绿素荧光动态；6) 双通道主机系统（控制单元），可选配双检测器，同时测量藻类叶绿素及细菌叶绿素荧光动态；或选配溶解氧测量探头，同步测量溶解氧动态；7) 可客户定制高灵敏度测量单元，检测极限达1ngChl/L；8) 可对温度进行070C调控，精度达0.1C。2. FL5000双通道超高灵敏度叶绿素荧光仪FL5000为双通道双检测器，可同时测量藻类叶绿素和细菌叶绿素，是目前世界上灵敏度最高的叶绿素荧光测量仪，测量极限可达0.1ng Chl/L，适于藻类浓度很低的海洋、泉水等进行就地（in situ）测量监测，可自动运行PAM测量、叶绿素荧光诱导、OJIP-test、QA再氧化动力学、放氧复合体S状态转换、荧光淬灭分析等。仪器内置以太网网络服务器，可进行远程控制和数据浏览下载等。其主要功能特点如下：1) 超高灵敏度，可用于海洋及自然水体浮游植物包括藻类及光氧细菌的对比研究分析；2) 便携性强、使用方便，控制单元、测量单元等集成在一个机箱内，水样可通过蠕动泵自动控制抽样测量，既可用于实验室测量研究，又可用于野外或在考察船上进行测量或监测；3) 双通道双检测器，可同时测量藻类叶绿素荧光动态和细菌叶绿素荧光动态（如蓝藻细菌与藻类），内置精密时钟测量数据带时间戳；4) 内置以太网接口和WIFI，可实现远程遥控和数据采集，具触摸屏5) 具备FL3500的光源双调制功能，双色调制测量光、双色调制光化学光及持续光化学光6) 具备PC遥控模式和触摸屏在线模式，触摸屏界面有图表（Graph）、数据（Numerics）、设置（Settings）、WiFi、记录（Record）及分析（Analysis）等菜单或按键，用于设置光源等参数、实施在线测量、无线网络连接、蠕动泵控制、即时显示数据或图及记录分析等功能3. Aquapen手持式藻类荧光仪Aquapen水体藻类荧光仪是目前世界上便携性最强（仅手机大小）、功能最强大、灵敏度最高的手持式水体藻类荧光测量设备，有探头式和试管式两种，探头式可直接将测量探头插入水体中原位测量，试管式可采样在试管（比色皿）中测量。Aquapen不仅具备PAM测量技术的所有功能，还可进行OJIP-test测量并自动分析出26个OJIP测量参数，其中OJIP固定面积与藻类浓度相关。Aquapen具体功能特点如下：1) 高灵敏度，测量极限为0.5gChl/L2) 具备NPQ1和NPQ2双程序荧光淬灭分析和三套给光程序的光响应曲线测量3) 可设置测量程序和测量间隔后进行自动测量纪录4) 探头式标配为蓝色激发光，可选配橙红色、白色或其它波长的激发光；试管式具备蓝光和橙红光双色测量光源，红色光源适于蓝藻测量，蓝色光源适于绿藻等5) 试管式还可测量两个波段的光密度值OD680和OD7206) 可选配2个或2个以上不同激发光的Aquapen已满足多激发光测量的需求7) FluorPen数据分析软件可显示数据图表包括原始测量数据和分析数据、荧光动态曲线等8) 内置数据采集器可采集纪录100000个带时间戳的数据4. FKM多光谱荧光动态显微成像系统FKM（Fluorescence Kinetic Microscope）多光谱荧光动态显微成像系统是目前功能最为强大的藻类及植物显微荧光光谱研究仪器，由包含可扩展平台的增强型蔡司显微镜、高分辨率CCD相机、多光谱激发光源组、高解析度光谱仪、控温模块、荧光成像模块、专用藻类荧光成像观测室以及相应的控制单元和专用的工作站与分析软件组成。多光谱激发光源组包括紫外光、红光、兰光、绿光和白色光源。FKM不仅可以进行微藻、单个细胞、单个叶绿体甚至基粒-基质类囊体片段进行Fv/Fm、Kautsky诱导效应、荧光淬灭、OJIP快速荧光响应曲线、QA再氧化等各种荧光成像动力学分析，还能通过激发光源组及光谱仪系统进行任意荧光激发和荧光释放波段的测量与光谱分析。除对叶绿素荧光动态进行成像光谱分析外，还可对静态荧光如GFP荧光、DAPI荧光、DiBAC4荧光、SYTOX 绿色荧光、CTC荧光染色等荧光蛋白、荧光素进行成像分析，并可通过光谱仪对各种荧光进行光谱分析，区分各发色团（例如，PSI和PSII及各种捕光色素复合体等）并进行深入研究。目前中科院植物所、海洋所都配备了FKM多光谱荧光动态显微成像系统，详细信息请咨询Ecolab实验室。其它用于藻类研究的叶绿素荧光成像系统还有FluorCam便携式叶绿素荧光成像仪、FluorCam封闭式叶绿素荧光成像系统、FluorCam开放式叶绿素荧光成像系统等。下图为丝状鱼腥藻FKM成像分析：A为沿藻丝从左到右不同细胞的Fm成像，其中第7和第17个细胞已分化形成异形胞；B为从左到右每个细胞的Fo值，C为Fv值，D为Fv/Fm（源自Ferimazova等，2013，Photosynthesis Research，116:79-91）。5. AOM广谱藻类在线监测系统AOM（Algal On-line Monitor）为高灵敏度广谱藻类监测仪器，适于监测绿藻、蓝藻、硅藻等各种浮游生物，灵敏度达30ngChl/L（绿藻检测极限达10cell/ml；蓝藻检测极限100cell/ml），应用于自然水体如水华爆发早期监测预警等，及人工水体藻类短期或长期监测如水处理监测控制等，还可与FFL-40、MicroMac1000营养盐在线监测仪组成富营养化监测系统。AOM配置蓝色和红色（或选配590nm黄色光源）双色测量光，监测参数包括Ft、QY、OJIP等，其中Ft、OJIP固定面积可反映藻类浓度动态，QY可反映藻类生理状态如受胁迫状态、水体毒性或突发污染事件等。内置数据采集器，可存储纪录100000个数据或300次OJIP测量数据。通过蠕动泵自动抽样，可通过GPRS无线数据传输。6. FFL-40 FRRF藻类在线监测系统FFL-40为运行FRR测量程序的藻类在线监测系统，由FFL-40主机和PC操作系统组成。FRRF荧光仪广泛用于浮游植物生产力估算和模型模拟分析等。通过FRR自动测量，FFL-40可以测量PSII功能吸收截面积PSII（functional absorption cross-section of PSII）、PSII能量传递p、F0、F0、FM、FM等，并进而实时估算光合电子传递速度Pe、快速光响应曲线RLC等。FFL-40技术特点如下：1) PC操作系统具备多平台网络服务器功能，可通过GUI远程控制测量过程和数据通讯，可同时操作多台FFL-40；2) 450nm和590nm双色测量光源和光化学光源，590nm光源强度可达60000mol/m2s，450nm蓝光强度可达120000mol/m2s；3) 单周转诱导与弛豫相时间分辨率可达1.5s；4) 可通过NTP服务器程序支持与其它设备的同步化监测，如同步化GPS定位（特别适用于仪器安装在考察船进行移动式监测（参见图），可监测纪录浮游植物时空分布格局）；5) 内置光适用和暗适应室，通过泵阀自动抽样、自动清洗；6) 特别适用于浮游植物生产力评估;7) 检测灵敏度达0.5gChl/L7. FMT150藻类培养与在线监测系统（光养生物反应器）FMT150藻类培养与在线监测系统将藻类培养与在线监测仪器独特地结合在一起，用于精确地进行淡水和海水光合营养藻类和蓝绿细菌等的培养和监测。培养条件可以根据用户自定义方案而动态变化，光能、光谱组成、温度等可以精确设定并可在幅度或频率上振荡变化。仪器内置双调制荧光仪和显像密度计等，培养物的生长状态可以即时由显像密度计（OD735）测定735 nm的光散射值，叶绿素含量通过在680nm和 735 nm的光密度差值(NDVI)来连续监测，通过PS II的光量子产量(Fm-Fs)/Fm测量可以监测其瞬时生理状态。主要功能特点如下：1) 内置双调制叶绿素荧光仪，实时监测培养藻类的生理状况，测量记录荧光参数Ft，Fm，QY等2) 内置光密度计，测量OD680和OD735，经过校准可计算生物量（藻类细胞数量）、叶绿素浓度3) 可同时测量监测温度、pH值、溶解