rDNA_ITS序列分析在真菌鉴定中的应用_燕勇.pdf

基金项目 浙江省档案局科研项目 2007 9 作者简介 燕勇 1974 男 学士 主管技师 主要从事微生 物检验工作 论著 r D N A I T S 序列分析在真菌鉴定中的应用 燕勇 李卫平 高雯洁 沈志英 王恒辉 陈黎霞 浙江省嘉兴市疾病预防控制中心 浙江嘉兴 314050 摘要 目的 通过对 3株真菌的 r D N A I T S 序列进行分析 以探讨 说明基于核糖体 R N A基因 即 r D N A 内转录间隔 区 I n t e r n a l T r a n s c r i b e dS p a c e r I T S 的多态性的序列分析 r D N A I T S 序列分析 在真菌鉴定中的应用 方法 通过 P C R 扩增与测序的方法测得待检真菌菌株的 r D N A I T S 序列 从 G E N B A N K获取相似序列 使用 B L A S T和 D N A M A N工具对 r D N A I T S 序列进行比对分析 结果 1号真菌菌株与 X y l a r i a l e s s p L M40 属炭角菌目 同源性高 但尚不能鉴定到具体 的属 种 2号真菌菌株可鉴定到种 为草酸青霉 P e n i c i l l i u mo x a l i c u m 3号真菌菌株可鉴定到种内组水平 为近平滑假丝 酵母 I I I 组 最新命名为 C a n d i d ame t a p s i l o s i s 结论 相对于传统的真菌形态学鉴定方法 r D N A I T S 序列分析用于真菌 鉴定更客观 省时 简便 快速 但目前也存在一定的应用限制 受基因库的完善程度 高度同源性序列的多少以及具体物 种 I T S 区的可变程度等影响 并不能鉴定出所有真菌 宜与传统的形态学鉴定方法相结合用于真菌鉴定 关键词 r D N A 内转录间隔区 I T S P C R 测序 真菌 鉴定 中图分类号 R446 5 文献标识码 A 文章编号 1004 8685 2008 10 1958 04 A p p l i c a t i o no f r D N AI T Ss e q u e n c ea n a l y s i s i nf u n g u s i d e n t i f i c a t i o n Y a nY o n g L i We i p i n g G a oWe i ji e S h e nZ h i y i n g Wa n gH e n g h u i C h e nL i x i a o J i a x i n gC e n t e r f o rD i s e a s eC o n t r o l a n dP r e v e n t i o n J i a x i n g314050 C h i n a A b s t r a c t Ob j e c t i v e T oi n t r o d u c ea n di l l u m i n a t et h ea p p l i c a t i o no f r D N AI T Ss e q u e n c ea n a l y s i si nf u n g u si d e n t i f i c a t i o no n b a s i so f s e q u e n c ea n dl e n g t hp o l y m o r p h i s ms o f i n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r I T S i nr i b o s o m a l R N Ag e n e r D N A Me t h o d s T h e t h r e ep e n d i n gf u n g u ss t r a i n s r D N AI T Ss e q u e n c e s t e s t e db yP C Ra mp l i f i c a t i o na n ds e q u e n c i n gm e t h o d sw e r ea n a l y z e da n dc o m p a r e dw i t hs i mi l a rs e q u e n c e s f r o mG E N B A N Kb yN C B IB L A S To n l i n et o o l a n dD N A MA Ns o f t w a r e R e s u l t s N o 1 f u n g u ss t r a i n h a dah i g hh o mo l o g yw i t hX y l a r i a l e ss p L M40 b u t w a sn o ty e ti d e n t i f i a b l eo ng e n u so rs p e c i e sl e v e l o ft a x o n o m i cc l a s s i f i c a t i o n N o 2 s t r a i nw a si d e n t i f i e da sP e n i c i l l i u mo x a l i c u m ag e n u sl e v e l N o 3 s t r a i nw a si d e n t i f i e da sC a n d i d am e t a p s i l o s i s n e w d e s i g n a t i o no f C a n d i d ap a r a p s i l o s i sg r o u pI I I ag r o u pl e v e l i ns p e c i e sr e l a t i v e l y Co n c l u s i o n C o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o n a l m o r p h o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o nm e t h o d s t h er D N AI T Ss e q u e n c ea n a l y s i si s mo r e o b j e c t i v e t i m e s a v i n g c o n v e n i e n t a n df a s t f o r f u n g u si d e n t i f i c a t i o n b u t w i t hs o me a p p l i e dl i m i t s c u r r e n t l y D e p e n d e do nt h ep e r f e c t i o nd e g r e e o f g e n e d a t a b a s e t h e n u m b e r o f h i g h d e g r e eh o m o l o g ys e q u e n c e t h e v a r i a b i l i t y e x t e n t o f I T Sr e g i o no f b i o l o g i c a l i n d i v i d u a l s a n ds oo ni t c a nb e a p p l i e d T h e n i t d o e s n o t i d e n t i f ya l l f u n g i a n ds h o u l db ec o m b i n e dw i t ht h et r a d i t i o n a l mo r p h o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o nm e t h o d s f o r f u n g u s i d e n t i f i c a t i o n Ke yw o r d s r D N A I n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r I T S P C R S e q u e n c i n g F u n g u s I d e n t i f i c a t i o n 真核生物基因组中编码核糖体的基因包括 28Sr D N A 5S r D N A 18Sr D N A和 5 8Sr D N A4种 它们在染色体上头尾相 连 串联排列 相互之间由间隔区分隔 其中 18S 5 8S 和 28S r D N A基因组成一个转录单元 图 1 三者高度保守 适合于较 高等级水平的生物群体间的系统分析 1 其间的间隔区为内 转录间隔区 I n t e r n a lT r a n s c r i b e dS p a c e r I T S 包 括 I T S 1及 I T S 2两部分 由于进化相对迅速而具多态性 因而适合于等级 水平较低的系统学研究 真菌种类繁多 仅依靠形态 生化等表型特征来鉴定真菌 既需要丰富的真菌鉴定工作经验又需要较长的检验时间 尤 其对于那些生长条件特殊 形态相似的菌株要通过传统的表 型特征鉴定方法来加以鉴别显得非常困难 而基于 r D N A I T S 的多态性 包括长度多态性和序列多态性 的序列分析 由 于可以从不太长的核酸序列中获得相对足够的信息用来反映 生物亲缘关系与分类情况 因而成为真菌分类及鉴定研究的 热点 目前已广泛应用于真菌的属种间 2 3 及部分种内组群水 平 4 5 15 的系统学研究 本文通过 P C R扩增与测序的方法对 I T S 序列分析在真菌的分子生物学鉴定中的应用作初步的介 绍与分析 1 材料和方法 1 1 r D N A I T S 扩增引物 I T S 的引物选择与扩增的目标区间有关 表 1 单独分析 I T S 1区 I T S 2区序列可以研究亲缘关系较近的属种或群组之 1958中国卫生检验杂志 2008年 10月 第 18卷 第 10期 C h i n e s e J o u r n a l o f H e a l t hL a b o r a t o r y T e c h n o l o g y O c t 2008 V o l 18 N o10 间小范围 低水平的序列变化 若需要相对足够的序列信息用 于未知真菌的系统分类学研究或鉴定未知真菌的属种 可对 于整个 I T S 区设计引物 由于真菌全长 I T S 区序列 图 1 包含 了其两端的 18Sr D N A 28Sr D N A的部分序列和中间的 I T S 1 区 5 8Sr D N A I T S 2区的完整序列 长度 300 1000 b p 真菌 通常 600b p 左右 拥有相对丰富的信息 因而全长序列的 I T S 分析在真菌分子生物学鉴定中比较常用 表 1 真菌 r D N A I T S 通用扩增引物 P r i m e rS e q e n c e 5 t o 3 L e n g t h b p I T S 1T C C G T A G G T G A A C C T G C G G19 I T S 2G C T G C G T T C T T C A T C G A T G C20 I T S 3 G C A T C G A T G A A G A A C G C A G C20 I T S 4T C C T C C G C T T A T T G A T A T G C20 I T S 3为 I T S 2的反补序列 图 1 真菌 r D N A 转录区和相关引物 1 2 菌株来源 本文例举档案库房环境中采样所分离得到的 1号 2号 3 号菌株用于 I T S 序列分析说明 通过形态学鉴定 可以初步鉴 定为未知真菌 青霉和酵母菌 真菌形态学鉴定方法非讨论 重点 在此不作叙述 1 3 主要试剂 真菌 D N A基因组提取试剂盒 B i o s p i nF u n g u sD N AG e n o meE x t r a c t i o nK i t 杭州 B i o r C a t B S C14M1 U n i v e r s a l D N A G e n o mi cE x t r a c t i o nK i t V e r3 0 大连 T a K a R a C a t D V811A P C R扩增试剂盒 T a K a R aP C RA mp l i f i c a t i o nK i t C a t D R 011 1 4 方法与步骤 1 4 1 增菌培养 使用沙氏液体培养基对待检菌株进行振荡 培养 28 48 72 h 收获菌丝体以备核酸提取 沙氏液体培 养基配制 葡萄糖 40 g 蛋白陈 10 g 加无离子水至 1000 m l 自然 p H值 121 20 m i n 灭菌后以 3 m l 试管分装备用 1 4 2 真菌 D N A基因组提取 取真菌培养液离心后加适量 d H 2O充分研磨破碎 选用 B i o r 和 T a K a R a 的上述两种商品化 真菌核酸提取试剂盒进行 D N A提取 1 4 3 核酸纯度与浓度测定 取一定量的 D N A提取液进行 一定倍数的稀释后 在 260 280与 320n m下分别测定 O D值 以 O D260 O D320 O D 280 O D320 计算核酸纯度 自然界 核酸纯度范围为 1 6 2 0 一般以 1 8 0 2为宜 6 核酸浓 度 n g l 50 O D260 O D320 L D L 为光径长度 c m D为稀释倍数 6 根据结果将核酸浓度稀释至适合的 P C R用 模板浓度 100 300 n g l 1 4 4 r D N A I T S 扩增 以表 2所示的 P C R反应组成 按反 应条件 94 2 m i n 94 30 s 59 30 s 72 90s 35C y c l e s 72 7mi n 扩增全长序列的 I T S 将 P C R产物用 1 凝胶进 行电泳 30 m i n 100V 使用 0 5 g m lE B或 3 G e l R e d 进 行后染 30 m i n 然后在凝胶成像仪上进行显影成像 观察是否 扩增出目的条带 表 2 r D N A I T SP C R的反应组成 C o m p o n e n t sA m o u n t l P C RB u f f e r 10 M g 2 f r e e 5 M g C l 2 25 m M 4 d N T P 2 5 m Me a c h 4 P r i m e r F 20 M u s i n g I T S 10 5 P r i m e r R 20 M u s i n g I T S 40 5 T a qD N Ap o l y m e r a s e 5 U l 0 25 D N At e m p l a t e 100 300 n g l 2 d H2O U pt o 50 1 4 5 r D N A I T S 测序与分析 将扩增出来的目的核酸片段 送上海生工生物工程技术服务有限公司纯化后进行测序 将 测得的序列提交美国 N C B I 的 G E N B A N K获取对比指标靠前 的 20个相似序列 通过 B L A S T 工具和 D N A MA N软件进行比 对分析并以 N e i g h b o r J o i n i n g 方法构建系统发育树 2 结果 2 1 P C R扩增结果 使用两种真菌 D N A基因组提取试剂盒 图中以 a b示 提取 1 2 3号真菌菌株 D N A 其 r D N A I T SP C R产物经凝胶 电泳均能扩增出目的条带 图 2 扩增产物大小均在 500 750 b p 之间 图 2 两种提取试剂盒所得 3株真菌菌株的 r D N A I T SP C R产物 M Wi d e R a n g e D N AM a r k e r 100 6000 a U s i n g B i o e r B i o s p i nF u n g u s D N AG e n o m eE x t r a c t i o nK i t b U s i n g T a K a R a U n i v e r s a l D N AG e n o m e E x t r a c t i o nK i t 2 2 r D N A I T S 序列测序与比对结果 3株真菌与从 G E N B A N K获取的相似序列经 D N A MA N软 件进行比对分析并构建 N J 系统发育树 图 3 根据系统发 育树并结合各比对指标确定距离与同源性均具有较大鉴定意 义 I d e n t f i c a t i o n 的比对序列 表 3 5 对于 1号真菌菌株 该菌株在 G E N B A N K中的相似序列较少 具有鉴定意义的是序 列 E F 060424 1 X y l a r i a l e ss p L M40 与其同源性最高 B l a s t 的 Ma xi d e n t 为 97 D N A MA N的 H o m o l o g y 为 96 2 可认 为该菌株在分类学上与 X y l a r i a l e ss p L M40 炭角菌目 亲缘 关系最近 但尚不足以鉴定到具体的属 种 2号真菌菌株 较 有鉴定 意 义的 是序 列 E U434727 1 P e n i c i l l i u m o x a l i c u m D Q401541 1 P e n i c i l l i u mo x a l i c u ms t r a i n083135 该菌株高度 相似 序 列 较 多 与 D Q401553 1 P e n i c i l l i u m t e r r e s t r es t r a i n 094303土生青霉 D Q267827 1 P e n i c i l l i u me x p a n s u ms t r a i nF 3 1959中国卫生检验杂志 2008年 10月 第 18卷 第 10期 C h i n e s e J o u r n a l o f H e a l t hL a b o r a t o r y T e c h n o l o g y O c t 2008 V o l 18 N o10 扩 展 青 霉 E F 550979 1 P e n i c i l l i u m j a n t h i n e l l u m i s o l a t e MT C C6564微紫青霉 的同源性 H o m o l o g y均高于 95 M a x i d e n t 均大于 97 3号真菌菌株 较有鉴定意义的是序列 E U 484054 1 C a n d i d am e t a p s i l o s i ss t r a i nL 7685 A Y391844 1 C a n d i d am e t a p s i l o s i ss t r a i nC B S2916 相似序列 E F 193072 1 E F 190228 1也有助于将 3号菌株鉴定为 C a n d i d am e t a p s i l o s i s 图 3 三株真菌菌株 r D N A I T S 序列的 N J 系统发育树 A B C B l a s t Q u e r y I Do f r D N A I T Ss e q o f N o 1 2 3 f u n g u s s t r a i n w i t h536 556 a n d502 b p o f s e q u e n c el e n g t hr e s p e c t i v e l y 表 3 1号真菌菌株 r D N A I T S 序列 L C L 6347 的有意义的比对序列 A c c e s s i o nD e s c r ip ti o n M a x s c o r e T o ta l s c o r e Q u e r y c o v e r a g e E v a l u e M a x i d e n t H o m o lo g y D is ta n c e E F 060424 1X y l a r ia le s s p L M 40 90590597 097 96 2 0 038 A B 073533 1X y la r ia s p K U 41652752797 2e 14685 81 9 0 181 为 D N A M A N 软件分析结果 其它为 B l a s t 分析结果 下同 表 4 2号真菌菌株 r D N A I T S 序列 L C L 28653 的有意义的比对序列 A c c e s s i o nD e s c r ip ti o n M a x s c o r e T o ta l s c o r e Q u e r y c o v e r a g e E v a l u e M a x i d e n t H o m o lo g yD i s ta n c e E U 434727 1P e n i c il li u m o x a l ic u m 990112397 099 99 1 0 009 D Q 401541 1P e n i c il li u m o x a l ic u m s t r a in083135 94194191 099 99 8 0 002 D Q 401553 1P e n i c il li u m t e r r e s tr e s t r a in094303 94194191 099 99 8 0 002 D Q 267827 1P e n i c il li u m e x p a n s u m s t r a inF 3 97997996 099 97 1 0 029 E F 550979 1P e n i c il li u m j a n th in e l lu m M T C C6564 96696697 098 96 0 0 040 表 5 2号真菌菌株 r D N A I T S 序列 L C L 28807 的有意义的比对序列 A c c e s s io nD e s c r i p t io n Ma x s c o r e T o t a l s c o r e Q u e r y c o v e r a g e E v a l u e M a x i d e n t H o m o l o g yD is t a n c e E U 484054 1C a n d i d a m e ta p s i lo s i s s tr a i n L 7685 88388398 098 98 6 0 014 A Y 391844 1C a n d i d a m e ta p s i lo s i s s tr a i n C B S 2916 90090098 099 98 8 0 012 E F 193072 1C a n d i d a m e ta p s i lo s i s v o u c h e r M C C C 2E 00290 87887896 099 98 6 0 014 E F 190228 1C a n d i d a m e ta p s i lo s i s s tr a i n Z h u a n 112 87887896 099 97 8 0 022 3 讨论 采用分子生物学手段检测真菌 重要的前提就是能否从 待检样品中获取足量 稳定 质佳的真菌 D N A模板 对于酵母 菌 破坏相对容易且生长较快 使用次日的增菌液或直接使用 菌落可用于核酸提取 对于丝状真菌 由于真菌孢子较难破 碎 因而可选用破坏相对容易的菌丝体用于核酸提取 据文献 报道在液体培养基中培养 2 3d的菌丝体 D N A产量较高 7 对于追求时间效率的快速检测中直接使用真菌菌落时 在使 用裂解剂前应先在冰浴中对真菌组织充分地进行研磨和破坏 有条件的可使用液氮研磨或超声波破碎 加入裂解剂后给 予充分的裂解时间 65 30 60 m i n 并不时振荡次数 以此 法结合使用商品提取试剂盒可在短时间内 2 3 h 获得理想 的真菌 D N A提取效果 见图 2 而传统常用的手工提取方 法 如液氮冷冻研磨法 8 氯化苄溶解法 9 虽经实践证明有 效 可靠 但费时费力 难以在快速检测中推广使用 P C R结束后应对扩增产物进行电泳以检查目的序列 r D N A I T S 的扩增效果 真菌的全长 I T S 序列在 600b p位置附 近出现单一的电泳条带则表明扩增出目的条带 见图 2 若无 则核酸提取或扩增无效 若出现多条带表明有菌株不纯 在进行比对分析时 核酸序列数据库中较多的相似序列 会给比对分析工作带来两方面的影响 一是能提供更大的参 考意义和更丰富信息用于系统学研究 另一方面过多的相似 序列也会给鉴定工作带来一定的困难 13 14 而且随着 G E N B A N K的不断丰富 相似序列还会更多 此时 最好再使用其 它序列比对分析工具也许会有益于鉴定工作 比如与 2号真 菌菌株 r D N A I T S 序列相比较 Ma xi d e n t 最大鉴定百分比 达 到 99 以上的序列有 36个之多 利用 B L A S T 在线比对工具所 绘制的距离树 D i s t a n c et r e e 无法将 2号真菌菌株鉴定到青霉 的某个种 图 4 而文中使用 D N A MA N所绘制的系统树 P h y l o g e n e t i cT r e e 能明显地发现与待检序列的距离与同源性最近 的序列 E U 434727 D Q401541 均为 P e n i c i l l i u mo x a l i c u m草酸青 1960中国卫生检验杂志 2008年 10月 第 18卷 第 10期 C h i n e s e J o u r n a l o f H e a l t hL a b o r a t o r y T e c h n o l o g y O c t 2008 V o l 18 N o10 霉 图 3 结合形态学 生化 如酵母菌 等表型方法进行 鉴定 不能过分依赖 I T S 序列分析而把它作为传统真菌形态学 方法的替代方法 如 2号真菌菌株 I T S 序列分析较难鉴定时 可观察菌落生长情况与镜下结构特征 该菌株的形态结构特 征均支持草酸青霉的定性鉴定 图 4 B l a s t 绘制的 2号真菌菌株 r D N A I T S 序列的 F M E 距离树 截图 从上述结果可看出 目前 r D N A I T S 序列分析并不是能 对所有真菌的属种或组群进行鉴别 究其原因 其一 I T S 区序 列尽管是可变的 但对于某些物种其可变的程度相对不高 并 不足以用来分析其属种或组群间的差异 10 11 其二 I T S 序列 分析结果还受到比对使用的基因库完善程度的影响 因此 在基因库中存在的 与待检真菌亲缘关系相近的已知真菌序 列缺乏时 如文中的 1号菌株 或 r D N A I T S 序列上表现为极 小的差异性时 I T S 序列分析的应用能力就受到一定的限制 此时 建议将 I T S 序列分析结果与传统的真菌形态学鉴定结果 真菌培养特征 镜检特征等 相结合才能正确地对真菌进行 鉴定 以防止误检 错检 尽管目前 r D N A I T S序列分析的应用存在一定的限制 但传统的真菌形态学鉴定方法受主观经验与实验条件的影响 而使鉴定工作较困难 除非研究机构和专业人士 在基层单位 很少具备全面的真菌形态学鉴定能力 而 r D N A I T S 序列分 析用于真菌鉴定相对更客观 简便 快速 因此以 I T S 序列分析 为代表的分子生物学方法为真菌鉴定 尤其对基层单位真菌 鉴定能力的建 立 带来了希望 随着 P C R R F L P R A P D A F L P 技术的成熟与原子探针 流动式单分子荧光检测等新技 术新方法在 I T S 序列分析上的运用 12 以及生物信息学的不断 完善 相信 r D N A I T S 序列分析的应用将会有更大的发展空 间 参考文献 1 孙广宇 彭友良 李振歧 等 核昔酸序列分析在真菌系统学研究 中的应用 J 西北农林科技大学学报 自然科学版 2003 31 6 187 192 2 I w e nP C H i n r i c h sS H R u p pM E U t i l i z a t i o no f t h ei n t e r n a l t r a n s c r i b e ds p a c e r r e g i o n s a s m o l e c u l a r t a r g e t s t o d e t e c t a n d i d e n t i f y h u m a n f u n g a l p a t h o g e n s J M e dM y c o l 2002 40 872109 3 赵国柱 张天字 张猛 核糖体基因簇在真菌系统学研究中的意义 J 生命的化学 2002 22 1 13 15 4 B e l l o c hC F e r n n d e z E s p i n a r T Q u e r o l A e t a l A n a n a l y s i s o f I n t e r a n d i n t r a s p e c i f i c g e n e t i c v a r i a b i l i t i e s i nt h e K l u y v e r o m y c e s m a r x i a n u s g r o u p o f y e a s t s p e c i e s f o r t h e r e c o n s i d e r a t i o no f t h e K l a c t i s t a x o n J Y e a s t 2002 19 257 268 5 章初龙 徐同 T r i c h o d e r m a h a r z i a n u m 及其近缘种的分子系统学研 究 J 生物多样性 2003 11 1 10 19 6 C h r i sM a t t o c k s N i c kO w e n D a nWa r d E v a l u a t i o no f a u t o m a t e dD N A e x t r a c t i o nm e t h o d o l o g i e s E B O L N a t i o n a l G e n e t i c s R e f e r e n c e L a b o r a t o r y We s s e x N o v e m b e r 2004 h t t p w w w n g r l c o u k We s s e x d o w n l o a d s h t m 7 马珦玻 两株甲真菌 r D N