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引物设计保护碱基表 克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。 有研究者使用了15种限制酶，分别比较了各种限制酶在其酶切位点旁边分别加0、1、2、3个保护碱基后的切断情况。结果显示，基本上所有限制酶，在其酶切位点旁边加上3个以上的保护碱基后，可以对其酶切位点进行有效切断。一般来讲，在酶切位点前加入两个GC碱基，因为如果保护碱基为AT的话,保护碱基在PCR产物的末端,AT之间只有两个氢键,结合力差,容易在末端产生单链,这样的话限制性内切酶就无法作用。其实加保护碱基的多少，是具体情况具体讨论，比如HindIII、BamHI等就得有三个保护碱基。少了一个就无法切动。 ApaI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5GGGCCC 3BamHI（类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5 GGATCC 3BglII （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5 AGATCT 3EcoRI（类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5 GAATTC 3HindIII （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5 AAGCTT 3KpnI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5 GGTACC 3NcoI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5 CCATGG 3NdeI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5 CATATG 3NheI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5 GCTAGC 3NotI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5 GCGGCCGC 3SacI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5 GAGCTC 3SalI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5 GTCGAC 3 SphI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5 GCATGC 3XbaI （类型：Type II restriction enzyme ） 识别序列： 5 TCT
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