《课给同学》PPT课件.ppt

导论 人类基因组计划引起全世界的关注 它被誉为是与阿波罗计划 曼哈顿计划并列人类历史三大计划 在1999年度美国 科学 杂志评选的1999年度世界十大科学突破中仅排位第二 而干细胞生物学被1999年美国 科学 推举为二十一世纪最重要的十项科学领域之首 使浩大的 人类基因组计划 测序图位居其后 2000年干细胞研究成果再度入选 科学 评选的当年十大科技成就 干细胞生物学 导论 早在1896年E B Wilson第一次使用这个名词 描述寄生虫生殖系的祖细胞 1861年Till首先描述造血干细胞的特性 脾集落 1981年英国剑桥大学MartinEvans首次从小鼠胚囊中分离出小鼠胚胎干细胞 小鼠胚胎干细胞就可以成功地在体外进行培养 1998年11月 威斯康星大学的汤姆生和约翰 霍普金斯大学的吉尔哈特教授分别在 科学 Science 1998 Vol282 1145 1147 和 美国科学院论文集 PNAS 1998 Vol95 13726 13731 上报道 他们用不同的方法获得了具有无限增殖和全能分化潜力的人胚胎干细胞 干细胞生物学 一 干细胞研究的意义 1 作为细胞治疗与组织器官替代治疗的种子细胞2 探讨胚胎发育的调控机制3 作为疾病基因治疗的载体4 利用胚胎干细胞体外整合外源基因 研究基因功能5 药物筛选平台的建立 药理研究与新药开发 干细胞生物学 干细胞生物学 二 干细胞的定义 干细胞是一类具有无限的或永生的自我更新和分化潜能的细胞 能够产生至少一种类型的 高度分化的子代细胞 它的功能是控制和维持细胞的再生 干细胞生物学 三 干细胞的分类 按发生学来源 分为胚胎干细胞和成体干细胞干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响 目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养 最新研究发现 成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织 为干细胞的广泛应用提供了基础 干细胞生物学 三 干细胞的分类 按分化潜能 分为1 全能干细胞 如胚胎干细胞2 多能干细胞 如造血干细胞和骨髓间充质干细胞 3 单能干细胞 如上皮组织基底层的干细胞 肌肉中的卫星细胞 干细胞生物学 四 干细胞的生物学特点 1 属非终末分化细胞 终生保持未分化或低分化特征2 在机体的数目和位置相对恒定 3 干细胞能无限的增殖分裂 4 干细胞可连续分裂几代 也可在较长时间内处于静止状态 5 多向分化潜能6 分裂的慢周期性 绝大多数干细胞处于G0期7 干细胞通过两种方式生长 一种是对称分裂 另一种是非对称分裂 干细胞生物学 四 干细胞的鉴别方法 干细胞表面有许多特殊的标记 以造血系统为例 干细胞的表面标志有Sca 1和c kit等 另外各种成体干细胞还有各自独特的标记物 如人造血干细胞表现为CD34 和Thylo而CD10 CD14 CD15 CD16 CD19 CD20皆为阴性 8 这些特异的标记物可能与其分化调控有关 如上皮干细胞有 1整合素的高表达 而 1整合素可介导干细胞与细胞外基质粘附从而抑制其分化的发生 另外干细胞还有不同于一般分化细胞的物理特性 比如干细胞不被染料Hoechst33324和Rhodamine123染色 干细胞生物学 四 干细胞的鉴别方法 1 抗体 补体介导细胞溶解法2 流式细胞仪细胞分选法3 平面黏附分离法4 免疫磁珠分离法5 特异性基因检测6 绿色荧光蛋白 干细胞生物学 干细胞的相关概念和术语 1 DNA 构成基因的脱氧核糖核酸 deoxyribonucleicacid 的缩写 2 Gene 基因 位于染色体上一个特定位置的DNA片段 是一种遗传功能单位 一个基因可直接指导功能酶和蛋白质的合成 3 Somaticcell 体细胞 除卵子或精子之外的细胞 4 Somaticcellnucleartransfer 体细胞核转移 将体细胞的细胞核转移到去核卵细胞的过程 5 Stemcells 干细胞 一种经培养可进行不定期分化并产生特化细胞的细胞 6 Pluripotent 多能性的 可分化出一种器官的多种组织的潜能 干细胞生物学 干细胞的相关概念和术语 7 Totipotent 全能性的 具有无限的分化潜能 全能细胞能够专门化外胚膜和组织 胚胎和所有胚后期组织和器官 8 Multipotent 专能干细胞 多能干细胞进一步分化成专能干细胞 专能干细胞只能分化成某一类型的细胞 比如神经干细胞 可以分化成各类神经细胞 9 celldifferentiation 细胞分化 同一来源的细胞 通过细胞分裂在细胞间产生形态结构 生化特征和生理功能有稳定性差异的过程 10 Embryonalcarcinomacells ECC 胚胎癌细胞 来源于恶性畸胎瘤的一种多能的干细胞 11 Feedercelllayer 饲养层细胞 共培养中用来维持多能干细胞为分化特性的细胞 通常指胎鼠的成纤维细胞 干细胞生物学 胚胎干细胞 1 什么是胚胎干细胞胚胎干细胞是在人胚胎发育早期 囊胚 受精后约5 7天 中未分化的细胞 囊胚含有约140个细胞 外表是一层扁平细胞 称滋养层 可发育成胚胎的支持组织如胎盘等 中心的腔称囊胚腔 腔内一侧的细胞群 称内细胞群 这些未分化的细胞可进一步分裂 分化 发育成个体 内细胞群在形成内 中 外三个胚层时开始分化 每个胚层将分别分化形成人体的各种组织和器官 如外胚层将分化为皮肤 眼睛和神经系统等 中胚层将形成骨骼 血液和肌肉等组织 内胚层将分化为肝 肺和肠等 由于内细胞群可以发育成完整的个体 因而这些细胞被认为具有全能性 当内细胞群在培养皿中培养时 我们称之为胚胎干细胞 干细胞生物学 1 人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的极早期事件的良好材料和方法 这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题 2 采用基因芯片等技术 比较胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达 可以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制 发现新的人类基因 3 结合基因打靶技术 可发现不同基因在生命活动中的功能等 4 另一个令人兴奋的应用在于新药的发现及筛选 胚胎干细胞提供了新药的药理 药效 毒理及药代等研究的细胞水平的研究手段 大大减少了药物实验所需动物的数量 目前上述实验使用的细胞系或来自其他种属的细胞系 很多时候并不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应 5 胚胎干细胞还可用来研究人类疾病的发生机制和发展过程 以便找到有效和持久的治疗方法 胚胎干细胞的应用 干细胞生物学 胚胎干细胞的标志及建系 人们不断寻找各种各样的标记 但没有人找到绝对特异的干细胞标记 St Jude儿童研究医院实验血液学部主任BrianSorrentino博士领导的研究人员找到了他们认为是世界上第一个 通用的 干细胞标记 ABCG2 Bcrp1 这个基因在不同来源的干细胞中都有表达 而在大多数成熟细胞中不表达 它将成为干细胞标记 这项发现公布在9月出版的 自然医学 上 暗示新发现的ABCG2 Bcrp1基因将为科学家提供确定真正干细胞的更精确方法 研究人员发现在骨髓 骨骼肌以及早期小鼠胚胎干细胞中ABCG2 Bcrp1基因都以一种高度特异性形式表达 小鼠ES细胞系 mES 1无滋养层小鼠ES集落 A 5天ESCB HSC 干细胞生物学 胚胎干细胞的标志及建系 1 从人类胚胎的囊胚期内细胞群中直接分离多能干细胞 Dr Thomson从IVF 体外受精 临床实验室得到胚胎 这些胚胎是不育症临床治疗不需要的 用于繁殖 而非研究目的 从捐献者夫妇处获得知情同意书后 Dr Thomson分离了内细胞群 图III 将这些细胞进行培养 产生一个多能性干细胞系 2 从终止妊娠的胎儿组织中分离出多能性干细胞 捐献者自行决定了终止妊娠 从他们那儿获得了知情同意书后 Dr Gearheart从原本要发育成睾丸或卵巢的胎儿部位取得细胞 尽管Dr Thomson实验室和Dr Gearheart实验室使用的细胞系来源不同 但发育成熟的细胞看起来非常相似 干细胞生物学 建立稳定的永生化的胚胎干细胞细胞系方法 体细胞核转移 SCNT 在SCNT的动物研究中 研究者将一个正常的动物卵细胞去除细胞核 含染色体的细胞结构 存留在卵细胞内的物质含营养成分和对胚胎发育非常重要的能量物质 而后 在非常精细调控的实验室条件下 将单个体细胞 除卵细胞或精子细胞之外的任一种细胞 与除去核卵细胞放在一起 使两者相融合 融合细胞以及其子细胞具有发育成一个完整个体的潜能 因此是全能性的 干细胞生物学 建立稳定的永生化的胚胎干细胞细胞系方法 1 应用克隆技术 用人成熟细胞核置换人卵细胞的遗传物质 然后在体外将其培养至胚泡期 分离胚胎干细胞 用于研究和治疗 此时胚胎尚未开始分化 各系统也未开始发育 故不能称之为 人 因此这一技术与 克隆人 有明显区别 这一策略具有很大的诱惑力 如将正常细胞核置入受体无核卵细胞中 培养和分离胚胎干细胞 在将其体外定向诱导分化为各种特定的功能细胞 用于治疗因这些细胞损伤而引起的多种严重疾病 例如分化为多巴胺神经元治疗帕金森病 分化为胰岛细胞治疗糖尿病 分化为肝细胞和肌细胞治疗肝纤维化和肌萎缩 甚至还可以分化为CD4 细胞治疗艾滋病 目前利用核移植技术获取胚胎干细胞已在羊和小鼠实验中得到验证 但距其应用于人类疾病的治疗还需较长时间 干细胞生物学 建立稳定的永生化的胚胎干细胞细胞系方法 2 将人类的细胞核置入到其它哺乳动物的无核卵细胞以获取胚胎干细胞 通过对牛 羊 鼠的研究已经证实 克隆的后代看起来都与提供起源细胞核的供核动物的后代相象 而不象供卵者的后代 因此 这一策略可以用来获取胚胎干细胞 并已开始在牛和鼠身上进行实验 如果可行 那么便可以避免应用人的卵细胞 目前异种核移植尚未得到令人鼓舞的结果 此外在伦理学上 这种通过其它动物的卵细胞获得的胚胎能否被称为人的胚胎也将成为一个新的课题 干细胞生物学 建立稳定的永生化的胚胎干细胞细胞系方法 3 将成人的细胞核植入胚胎干细胞的胞浆内 通过胚胎干细胞的胞浆与供体细胞核的作用 诱导表达胚胎干细胞特异性的基因已有研究发现 将成纤维细胞核植入肝细胞的胞浆中 结果可以表达一个肝细胞特异性的基因 但这一技术目前还不成熟 干细胞生物学 胚胎干细胞研究的技术和伦理问题 1 胚胎干细胞极易分化为其他细胞 如何维持体外扩增时不分化 虽然在防止体外培养时干细胞分化方面已取得了很大成绩 如在培养基中加入白血病抑制因子等可抑制干细胞分化 但仍需进一步研究干细胞的培养条件 干细胞生物学 胚胎干细胞研究的技术和伦理问题 2 如何定向诱导干细胞分化 细胞分化是多种细胞因子相互作用引起细胞一系列复杂的生理生化反应的过程 因而要诱导产生某种特异类型的组织 需要了解各种因子在何时何地开始作用 以及何时何地停止作用 令人高兴的是 科学家相信只要将胚胎干细胞诱导分化为所需组织细胞的前体 祖细胞 将祖细胞移植到适当的环境中就能够产生所需的组织 因为机体能够分泌所有指导细胞正确分化的因子 并且不必在体外形成结构精确的多细胞组织后再移植 只需要将已诱导的分散的胚胎细胞或细胞悬液注射到发病部位就可发挥作用 这些移植的细胞与周围细胞及胞外基质相互作用便可有机地整合至受体组织中 干细胞生物学 胚胎干细胞研究的技术和伦理问题 3 由胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心 肝 肾 肺等大型精细复杂的器官这一目标还需要技术上的突破 因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程 很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的 例如 肺中的肌组织 血管和结缔组织来源于中胚层 而上皮组织源自内胚层 每个细胞要获得营养和排泄代谢废物 分化的组织中需要产生血管 组织血管化目前还处于起步研究阶段 退一步讲 即便是一发育完整的来自自然机体的器官 要离体培养并维持其正常的生理功能目前还无法做到 器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题 一种可能的方法是将干细胞注射到重度免疫缺陷动物的脏器中 让移植的人干细胞逐步替代动物细胞 使其脏器人源化 成为可供移植的器官 干细胞生物学 胚胎干细胞研究的技术和伦理问题 4 如何克服移植排斥反应 前面提到的改变基因创建 万能供者细胞 的方法是否可行还不清楚 核移植后的卵细胞能否激活沉默基因 启动DNA的合成 会不会改变染色体的结构等等问题 还有待进一步研究 而且 胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向 必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的移植的安全性做一全面 客观 深入的评价 干细胞生物学 胚胎干细胞研究的技术和伦理问题 争论的焦点在于干细胞的来源 即是否可以从胚胎中获取干细胞进行研究 如果可以 是从治疗生育疾病所多余的或流产的胚胎中选取 还是从通过 克隆 等技术制造出的专门用于干细胞研究的胚胎中选取 说到底就是人胚胎干细胞的来源是否合乎法律及道德 应用过程中所产生的伦理及法律问题如何处理 干细胞生物学 胚胎干细胞研究的技术和伦理问题 赞成胚胎干细胞研究的人认为 科学家并没有杀死胚胎 而只是改变了其命运 尤其是那些治疗生育疾病过程中剩余的胚胎 与将其抛弃相比 利用它进行研究以利于科学发展和人类健康是更可取的做法 此外 由于胚胎干细胞只是胚泡中的内细胞群 没有滋养层得支持 不可能独立发育成胎儿 所以他们不是胚胎 因此胚胎干细胞研究并不违反伦理道德 也有一些科学家用体细胞核转移的方法生成胚泡 然后分离培养多能干细胞系 他们认为既然实验用的卵细胞是去核和未受精的 无不同个体的遗传物质融合 从而未发生受精过程 所以用这种方法制造的干细胞并不违反道德和伦理准则 干细胞生物学 胚胎干细胞研究的技术和伦理问题 反对者则认为 从胚胎中收集胚胎干细胞是不道德的 因为人的胚胎也是生命的一种形式 无论目的如何高尚 破坏胚胎是对生命的不珍重 是无法容忍的 有些人担心 为获得更多的细胞系 公司会资助体外受精获得囊胚及人工流产获得胎儿组织 可能导致人工流产的泛滥 有人认为 如果胚胎干细胞和胚胎生殖细胞可以作为细胞系通过买卖获取 将会对传统伦理道德产生巨大冲击 有人认为应该鼓励成体干细胞研究而应放弃胚胎干细胞研究 对于用体细胞核转移生成胚泡的方法 反对者认为把这样的胚泡移植到妇女子宫中也有可能克隆出人 尝试此类研究当然与现行道德准相驳 也是违法行为 干细胞生物学 为什么一定要进行胚胎干细胞研究 有一种观点认为胚胎干细胞研究是没有必要的 因为成体干细胞完全可以取代胚胎干细胞 最近一些研究报告表明人体脂肪 胎盘等组织中的干细胞 具有惊人的可塑性 和胚胎干细胞一样 可以分化成各种各样的组织细胞 可以通过诱导使成体干细胞进行特化发育 然后将其移植回病人体内 这样既可以避免发生排斥现象 也可以避免使用来源于人体胚胎或人体胎儿的干细胞 干细胞生物学 尽管成体干细胞具有一定的优越性 但仍有一些因素限制了它的利用 主要包括 1 人们尚未从人体的全部组织中分离出成体干细胞 例如人们尚未发现人类的成体心脏干细胞 2 成体干细胞含量极微 很难分离和纯化 且数量随年龄增长而降低 3 在一些遗传缺陷疾病中 遗传错误很可能也会出现于病人的干细胞中 这样的干细胞不适于移植 4 成人身上获得的干细胞可能没有年轻人的干细胞那样的增殖能力 5 由于日常生活中人是暴露在各种环境之下的 日光和毒素等都有可能造成基因突变 成体干细胞可能包含更多的DNA异常等等 为什么一定要进行胚胎干细胞研究 ESC的形态学特征及核型 各种哺乳动物包括人 无论是动物还是人源 的ESC都具有与早期胚胎细胞相似的形态结构特征 胞体体积小 核大 有一个或多个核仁 核仁清晰 ESC在超微结构 组织化学 福斯曼抗原 Forssmanantigen 及蛋白合成方式等方面的研究表明 ESC与卵圆柱期胚胎外胚层和胎儿生殖嵴的原始生殖细胞类似 细胞中多为常染色质 胞质结构简单 散布着大量核糖体和线粒体 核型正常 具有稳定的整倍体核型 如Thomson等 1998 分离的5个人的ESC系中H1 H13和H14具有正常的XY核型 H7和H9具有正常的XX核型 H9培养6个月后仍具有正常的XX核型 正常ESC染色体正常 如发生异常则很难发育形成动物个体 干细胞生物学 干细胞生物学 ESC的生长特性 ESC在体外分化抑制培养时 呈克隆状生长 细胞紧密地聚集在一起 圆形或卵圆形细胞均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或巢状的群体细胞克隆 细胞界限不清 克隆周围有时可见单个ESC和分化的扁平状上皮细胞 ESC增殖迅速 每18 24h增殖1次 ESC不同于其他细胞系的两个特征在于 具有多向分化潜能即具有像早期胚胎组织细胞那样的全能 多能 性 能够被诱导生成机体各种类型的细胞 具有体外培养细胞系的特征 可以在体外不断扩增 并能连续无限地保持未分化状态传代 已证实近年建系的人ESC具有较强的端粒酶活性 在体外培养体系中连续培养4 5个月而不分化 具有比一般体细胞更长的寿命和更高的增殖活性 另外 ESC有在遗传操作 选择 冻存及复苏后不失其多能性的特点 并且来自同一克隆的细胞具有同样的特征 其在不同的生长条件下可具有不同的功能状态 ESC的生长特性 干细胞生物学 ESC的端粒酶活性 端粒酶是增加染色体末端端粒序列的一种核糖核蛋白 参与维持端粒长度 端粒长度对细胞复制的寿命有很重要的作用 因此细胞生理年龄可以通过测定端粒序列的长度来判定 端粒酶的表达与人细胞的永生化高度相关 对一些人二倍体细胞引入端粒酶活性 会延长其复制的寿命 人二倍体细胞缺乏端粒酶活性 随年龄增长 其端粒变短 在组织培养中经过有限增殖期后 进入复制衰老状态 相反 在生殖系细胞和胚胎组织 端粒酶高水平表达 因此ESC端粒酶活性的高度表达表明其复制的寿命长于体细胞复制的寿命 Thomson等 1998 研究证明ESC具有很高的端粒酶活性 这也揭示ESC和PGC比体细胞核移植具有更现实的应用前景 碱性磷酸酶的表达 在早期胚胎如小鼠 大鼠的桑葚胚和囊胚细胞均有碱性磷酸酶 alkalinephosphatase AKP 表达 小鼠的ESC中也含有丰富的AKP 活性较高 而在已分化的ESC中AKP呈弱阳性或阴性 猪 兔的桑葚胚和早期囊胚AKP呈阳性 因此 AKP常用来作为鉴定ESC分化与否的标志之一 ESC的体外分化潜能 在体内这些细胞处于快速增殖和有序分化状态 对动物而言 其实质是个体产生稳定性组织差异的过程 从分子生物学角度讲 从全能或多能胚胎干细胞分化为具有独特功能的体细胞是细胞特异基因在时间和空间上差次表达的结果 组织细胞间的差异主要取决于哪些基因被激活和在什么时间与位点被激活 ESC的体外分化潜能 ESC的分离培养首先需要解决的问题是阻止引起分化的基因的激活与表达 以实现分化抑制 保证细胞的全能性 ESC在体外需在饲养层 feederlayer 细胞上培养才能维持其未分化状态 一旦脱离饲养层就自发地进行分化 大鼠肝细胞等条件培养基和细胞分化抑制因子 白血病抑制因子 differentiationinhibitoryactivity leukemiainhibitoryfactor DIA I IF 的应用 也可使培养的ESC处于不分化状态 除去这些分化抑制物 在单层培养时细胞自发分化成多种细胞 悬浮培养可形成 简单类胚体 进一步培养可形成 囊状胚体 使简单类胚体重新附着于培养皿上生长 可形成不同种类复杂的细胞分化物 ESC的体外分化潜能 ESC在体外某些物质的诱导下可以发生定向分化如在对造血系统的研究中发现 ESC不仅可以向各系细胞分化 还可以分化为造血干细胞 而且分化过程与在体内发育过程类似 将转化生长因子 transforminggrowthfactor p1 TGF p1 或MyoD基因导入ESC 可以发育为血管样结构或骨骼肌和肌管二甲基亚砜可诱导ESC向各类肌细胞分化维甲酸可诱导其向神经细胞分化对聚集培养的ESC进行诱导则可分化为节律性收缩的心肌细胞 这些发现为ESC基础研究提供了重要依据 杜伟忠和丛笑倩1998 SatoandNakano2001 ESC的体内分化潜能 将ESC注射到同源动物皮下则形成复杂的混合组织瘤 其细胞组成可代表3个胚层细胞 如在Balb c nu裸鼠腋下接种ESC 小鼠产生畸胎瘤 除大量的干细胞巢和间质细胞外 还包括神经管 腺管 上皮细胞 软骨和肌肉等多种类型的分化细胞 Thomson等 1998 将来自囊胚分离的5个ESC系分别注射给重症联合免疫缺陷的棕色小鼠 每个小鼠都产生胚胎组织瘤 每个胚胎组织瘤包括胃上皮 内胚层 软骨骨髓 平滑肌 横纹肌 中胚层 和多层鳞片状上皮细胞 外胚层 嵌合体动物 试验 参与宿主胚胎发育 并形成嵌合体动物包括生殖系嵌合体后代是ESC和EGC的最基本特征 嵌合体试验是传统验证ESC全能性的重要实验和最有说服力的途径 即ESC与正常胚胎嵌合 如能产生包括生殖系在内的各个组织器官且能产生功能性配子的嵌合体 种系嵌合体 即可证实的确分离到具发育全能性的ESC系 嵌合体动物 试验 胚胎聚集法 将两个宿主的8细胞期桑葚胚置入在培养皿中铺的琼脂层上打的小洞穴内 然后 3 5个ESC或EGC组成的细胞团块置入这两个桑葚胚之间 确保ESC与桑葚胚黏附在一起 体外培养聚合体使其发育至胚泡期 选择发育良好的胚泡转移至假孕母鼠的子宫内使其着床和进一步发育 嵌合体动物 试验 纤维注射法 将8 10个ESC或EGC直接注入宿主发育4d的胚泡 待胚泡复形后转移至假孕母鼠子宫内继续发育 当ESC被异位移植至皮下时 仍保持着旺盛的细胞增殖特性 虽然其具有发育全能性或多能性 但其发育的遗传程序失控 表现为无序的细胞分化 成为排列杂乱的 由多种类型分化细胞组成的瘤性组织 当ESC与正常桑葚胚或胚泡的ICM黏附在一起被移入母体子宫内 可被调整并参与胚胎的正常发育 最终成为组织结构完全正常的嵌合体个体 这也同样体现了包括人类在内的正常胚胎发育过程是按严格的时空程序进行一系列细胞之间 核质之间相互作用的结果 但由于伦理道德和实际原因不可能用人的ESC制作嵌合体 造血干细胞 造血干细胞 hematopoieticstemcell HSC 是具有高度自我更新能力和多向分化潜能的造血前体细胞 近20年来 随着外周血移植治疗的开展 对造血干细胞的研究日益深入 现已知道 造血干细胞是不均一的细胞群体 由不同年龄等级的干细胞组成 在细胞大小 比重 形状 行为特征 表面抗原标志 细胞周期及调控机制等方面均存在较大差异 另一方面 造血干细胞有不同的来源 如骨髓 外周血和脐血等 这些不同来源的造血干细胞也有不同的特点 造血干细胞的发生 发育与调控 在胚胎形成胎儿造血系统的发育过程中 最先出现的是来自胚胎干细胞的成血 血管内皮细胞 hemangioblast 已有研究证实该细胞的存在 但目前尚未建立起完善的分离纯化技术 成血 血管内皮细胞可向造血干细胞和成血管细胞分化 分化为成血管细胞以后继续分化为血管内皮细胞 造血干细胞具有向各种髓系和淋巴系细胞发育的潜能 也具有自我更新能力 可通过移植来重建造血和免疫系统 被称为多能造血干细胞 原始造血 在胚胎发育过程中 造血发生经由卵黄囊 胎肝 胸腺 脾最后到骨髓 在成体 造血发生主要在骨髓 脾和胸腺 在造血发育起始阶段起重要作用的基因如GATA J Scl tall和rbtn 2 以生成红细胞为主 而且红细胞的生成为非红细胞生成素依赖性 没有脱核现象 胞质中的血红蛋白为胚胎珠蛋白结构 即由 样的 珠蛋白和p样的s珠蛋白相结合或其中之一与 或丁链相结合而形成 所有红细胞几乎同步成熟 且一旦成熟 这些红细胞即从血岛中同时释放入血循环 永久造血 至少有两个部位与永久造血有关 即卵黄囊和主动脉旁胚脏壁 主动脉一陛腺 中肾区 paraaorticsplanchnopleura PAS aorta gonad mesonephros AGM AGM的所有部分都是由胚脏壁发育而来 被认为是成熟的重建造血干细胞生成的最早位点 PAS可能是哺乳类造血干细胞形成的惟一位点 这一区域产生的造血千细胞再移到卵黄囊 而卵黄囊的原始造血细胞可能发生程序性死亡 programmedcelldeath PCD 只有迁移而来的永久造血于细胞被传递到肝 再向胸腺 脾及骨髓迁移定位 造血发育过程中的基因调控 TALl T cellacuteleukaemia 1 SCL sterncellleukaemia 基因的突变体对原始和永久造血都有抑制作用AMLl acutemyelogenousleukemia 1 基因只对卵黄囊中的原始造血有影响 这表明对原始和永久造血的调控既有相同途径也有不同途径 在发育早期 许多因子在中胚层细胞发育为成血 血管内皮细胞的过程中起重要作用 其中包括TGF p家族 FGF家族和血管内皮细胞生长因子受体 2 以及flk 1 螺旋 环 螺旋转录因子TALl SCI LIM决定簇蛋白RBRN 2等 造血发育过程中的基因调控 TGF B家族的骨骼形态形成蛋白4能诱导胚胎干细胞向造血细胞分化 Kellereta1 1998 此后各类细胞的发育又受到不同调控因子的作用 而且 这些因子中有些是对造血的全过程起作用 如PUl RBTN 2 GATAl GATA2等 而有些则只对某些阶段的细胞起作用 如AMI 1 cbfa2 cbfb p integrin c mybt等只影响确定的造血于 祖细胞 红细胞生成素 Eklf EpoR只影响胎肝的成熟造血 Bonife et 1 1998 造血分化是受若干个随机细胞因子的调控 造血干细胞的表面标志 针对这些表面抗原的双荧光或多荧光标记的单克隆抗体在流式细胞仪上检测体液 如骨髓 外周血 脐带血等 中的造血干 祖细胞含量 或者应用这些单抗进行免疫组化染色来检测组织中造血干 祖细胞的分布 依据一些表型标志也可分选富集造血干细胞 造血干细胞的表面标志 1 CD34抗原CD34是与造血干 祖细胞相关的一个阶段特异性抗原 它可调节造血细胞与微环境基质细胞间的黏附 CD34抗原是造血干 祖细胞分离纯化的主要标志 主要存在于幼稚的造血干 祖细胞 部分骨髓基质细胞和少量的内皮细胞表面 CD34表面标志从无到有 又从有到无 是造血干 祖细胞产生 发育 分化和成熟的过程 造血干细胞的表面标志 2 胸腺抗原 1 Thyl CD90 表型为Thyl Lin 的细胞群能够完全重建受致死量照射宿主的淋巴造血系统 证明其具有造血干细胞性质 3 干细胞抗原 1 Scal Scal抗原是小鼠Ly 6抗原家族的一员 除表达在干细胞表面外 在淋巴细胞特别是激活的淋巴及其他组织如脾红髓 胸腺髓质及肾小管区也有表达 4 干细胞因子受体 SCF R 又称c kit CDll7 c kit原癌基因编码一具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体 该受体广泛分布于造血细胞群中 c kit的配体SCF在造血干细胞的生存和增殖中起重要作用 造血干细胞的表面标志 5 CD38抗原在分化过程中CD34抗原表达逐渐下调至消失 而CD38抗原是造血干细胞向多系定向分化抗原 随分化过程其表达水平增高 6 ACl33ACl33由一条长865个氨基酸的多肽链组成的分子质量为120kDa糖蛋白抗原 目前ACl33抗原尚未发现已知的配体 其功能也不清楚 但因其蛋白表达随造血细胞的分化和畸胎瘤细胞的成熟而下调至检测不到的水平 与一些生长因子受体如纤维母细胞生长因子受体的表达相似 推测ACl33可能也是作为一种生长因子的受体而起作用的 在造血干细胞增殖与分化过程中 各个相关因素作用的根本目的在于对细胞周期的精确调控 防止细胞生长失控 维持正常生理功能 近年虽对造血干细胞的扩增进行了不懈的努力 但至今尚不能在体外成功地维持 保持 造血干细胞 或者某些关键区的细胞周期因子及复杂的骨髓微环境是造血干细胞所必需的 因此 在造血干细胞生物学领域 对于促进造血干细胞扩增和维持的细胞因子 造血干细胞维持和分化的机制及参与造血干细胞进 出细胞周期的细胞周期调节因子等问题仍值得深入研究 不同来源造血干细胞的特点比较 干细胞可取材于胎肝 胎髓 脐血 成人骨髓和动员外周血 Huang等 1998 对这5种来源细胞进行分选得到CD34 CD38 HLA DR 细胞 它们的集落生成率 colonyefficiency CE 和爆式集落生成率 blastcolonyefficien BE 包括混合型和分散型 分别为 胎肝72 7 11 8 和20 1 10 4 胎髓60 9 11 1 和11 1 5 4 脐血57 0 16 5 和24 1 7 3 成人骨髓9 6 7 8 和4 6 3 2 动员外周血27 2 12 8 和9 0 4 9 在5种来源细胞中 CD34 CD38 HLA DR 细胞在胎肝中含量最高 并且在不同发育阶段胎肝中含CD34 CD38 HLA DR 细胞一度高达34 7 8 胎肝CD34 CD38 HLA DR 单个细胞应是体外肝细胞扩增和基因操作最好的靶细胞 不同来源造血干细胞的特点比较 对脐血和骨髓的CD34 细胞进行比较 发现在干细胞因子和粒细胞集落刺激因子作用下 脐血所形成的粒 巨噬细胞集落形成单位的大小和数量增长程度明显高于骨髓 在半固体集落培养中 脐血的粒 巨噬细胞集落形成单位再接种能力也高于骨髓 脐血和骨髓祖细胞对抑制因子也有不同的反应 脐血造血干 祖细胞对某些造血抑制因子如 肿瘤坏死因子及干扰素的敏感性差 不同来源造血干细胞的特点比较 一些相关研究显示可能与以下因素有关 静息期脐血造血干 祖细胞能快速脱离Co期而进入细胞周期 这可能是其高增殖 扩增潜能的机制之一 脐血造血干 祖细胞可通过自分泌形式产生细胞因子 另有报道脐血可在无外源性因子的条件下自发产生巨核细胞集落 这些资料表明自分泌产生的造血因子可赋予脐血造血干 祖细胞高的增殖 扩增能力 同时也可解释脐血CD34 HLA DR细胞 自发 脱离Go G 期的原因 端粒长度 最近的研究资料表明 脐血和骨髓来源的造血干 祖细胞功能的不同可能与端粒的长度有关 人体细胞在体外每分裂一次端粒重复序列的长度将缩短50 100bp 培养前脐血细胞端粒限制片段 telomererestrictfragment TRF 的平均长度为8kb 而骨髓细胞仅为2kb 培养后由于细胞增殖二者TRF长度平均缩短1 5kb 表明造血细胞端粒DNA随细胞增殖而逐渐丢失 造血干细胞移植 20世纪80年代起 造血干细胞移植已成为癌症 造血系统疾病 自身免疫性疾病和部分遗传性疾病的重要治疗手段 初期造血干细胞移植 尤其是异基因移植的干细胞来源只有骨髓 近年来的研究和临床试验则表明化疗十细胞因子 巨噬细胞集落生成因子和粒 巨噬细胞集落生成因子等 可使更多的干细胞进入外周血 并使移植后的粒细胞和血小板恢复速度明显快于骨髓移植 因此 外周血干细胞移植已成为造血干细胞移植的主要干细胞来源 自体外周血干细胞移植的数量已超过了自体骨髓移植 异基因外周血干细胞移植也已被广泛采用 造血干细胞移植 脐带血含有丰富的造血干 祖细胞 其免疫细胞的抗原性较弱 细胞毒性T淋巴祖细胞较少 移植相关的移植物抗宿主病的发生相对骨髓和外周血少而轻 采集保存容易 对供者无任何伤害 因此被认为是极具潜力的新的造血干细胞来源 对脐带血造血干 祖细胞的生物学性能 免疫学特征 移植潜能等方面的研究也已成为热点 造血干细胞与其他多能干细胞的不同 首先 在个体发育过程中 造血干细胞历经多次迁移 先由卵黄囊转移到胎肝 再到达骨髓 而其后的某些条件下又可出现髓外造血的情况 而其他多能干细胞多在固定的场所发育成特定的组织 其次 由于生理需要 造血干细胞始终处于较为活跃的增殖与分化状态 能从骨髓源源不断地进入外周血而到达全身各处 而成熟个体中的多能于细胞多局限于相应的组织器官中 一般情况下处于类似休眠的状态 第三 造血干细胞具有可塑性 可以分化为肝 肌肉等组织的细胞 一定条件下又可来源于肌肉干细胞 神经干细胞等 而这种分化大多在相应组织病变的情况下完成 造血干细胞与其他多能干细胞的不同 由此可推测 在某种意义上 造血干细胞是全能干细胞存在于成熟个体的一种形式 成熟个体干细胞参与组织损伤的修复可能存在两种方式 一是相应组织内固有的干细胞参与修复 二是组织损伤动员骨髓释放造血干细胞 后者通过血液循环到达该组织 在特定的环境下增殖 分化 最终转化成为该组织细胞 以完成结构与功能的重建 而后者有可能起主导作用 也就是说 这些新的认识将有助于造血干细胞研究领域的进一步拓宽 造血干细胞生物学及其应用的一些相关问题 促进造血干细胞扩增和维持的细胞因子 造血干细胞维持和分化的机制 决定造血干细胞分裂的倾向性的因素 参与造血干细胞进 出细胞周期的细胞周期调节因子 在不同的血液细胞发育阶段和造血压力时的调节也值得研究 在造血干细胞工程方面 对不同来源 骨髓 动员外周血 脐带血 造血干细胞的分离纯化 体外扩增与定向诱导分化 造血干 祖细胞增殖分化的分子调控机制 造血干细胞移植效率与归巢 移植免疫耐受及相关的细胞治疗与基因治疗 骨髓间充质干细胞 mesenclymalstemcell MSC 骨髓中除了有造血干细胞以外 还存在一类骨髓间充质干细胞 是中胚层发育的早期细胞 这类细胞可以通过体外贴壁培养加以分离 不仅可分化为造血实质和基质细胞等 还可分化为多种造血以外的组织 特别是中胚层和神经外胚层来源组织的细胞MSC还易于外源基因的转染和表达 因而可能是细胞治疗和基因治疗的理想靶细胞 骨髓间充质干细胞的发现 1867年 德国病理学家Cohnheim在研究伤口愈合过程时 首次提出骨髓中存在MSC 在实验中给动物静脉注射一种不溶性染料analine 结果在动物损伤远端的部位发现含有染料的细胞 这些细胞包括炎症细胞和成纤维细胞 后者与细纤维的合成有关 并认为这些细胞来自骨髓 这是最早提出骨髓具有造血以外功能的报道 1869年 Goujon发现自体红骨髓异位移植后具有成骨的作用 也证实了这一点 Friendenstein等 1987 发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞 成软骨细胞 脂肪细胞和成肌细胞 而且这些细胞经过20 30个培养周期后 仍能保持其多向分化潜能 因此 骨髓中的这种多能细胞 由于能够分化成为多种中胚层来源的间质细胞 而被称为间充质干细胞 骨髓间充质干细胞的表型特征 骨髓间质来源的细胞 形态成纤维样 可聚集成均匀的集落 细胞表面蛋白如SH2 SH3 CD29 CD44 CD71 CD90 CDl06 CDl20 CDl24等呈阳性 但CDl4 CD34 CD45造血谱系标记阴性 因此这些细胞明显不同于其他CD34表面抗原阳性的骨髓成纤维细胞 培养的MSC合成细胞外基质 包括I型胶原 型胶原 纤连蛋白和层连蛋白 因为至今尚未筛选到MSC特有的标记分子 尚无鉴定MSC的直接方法 MSC目前的鉴定只能通过培养过程中出现的分化表型 然后反推得知是否为间充质干细胞 CDl4 CD34和CD45的阴性反应在筛选时可作为一定的参考依据 骨髓间充质干细胞体外分化潜能 MSC在体外培养时 表现出强的自我增殖能力和分化多潜能性 在不同诱导条件下能够向不同谱系分化这类体外研究实验均针对不同分化方向使用了各种不同的诱导剂 如地塞米松 TGF p FGF 胰岛素等 分别使用同样阶段MSC向成骨 成软骨 成脂肪 成肌细胞等方向分化 其中所使用诱导剂的种类 浓度 细胞所处的阶段及有无其他因子共同作用等 均对诱导的结果产生影响 但其作用机制还有待于进一步研究 分化方向已定的细胞 可以在一定诱导条件下 进行转分化 即具有可塑性 如已表达骨钙素OCN的成骨细胞 能被100 诱导表达成脂肪细胞 肥大的软骨细胞可以转分化而表达成骨细胞的标志物 骨髓间充质干细胞体外分化潜能 目前 MSC分化为不同类型细胞的机制尚不清楚 但是对MSC在体外的分离 扩增和分化的研究 提供了探究细胞定向分化机制的可能 从不同的分化条件分析 基础培养 细胞密度 机械力 生长因子对MSC的分化都有很大的影响 在各种分化培养条件下 MSC还可以产生对谱系发展十分重要的自分泌和旁分泌因子 骨髓间充质干细胞应用前景 通过组织工程技术体外分离和培养所需靶细胞用于体内相关疾病的细胞替代治疗为多种疾病的治疗提供了新的途径骨髓MSC来源广泛 可以分化为多种组织细胞 分离培养较为容易 且植入反应较弱 是一种良好的替代治疗的靶细胞 目前通过动物实验证实MSC单独应用可以较好地促进骨折愈合和软骨组织损伤修复 通过体外培养使其覆盖于陶瓷支架和碳纤维网等再植入患处效果更明显 国外还开展了将MSC用于治疗因I型胶原基因突变导致的儿童骨发育不良的临床实验 骨髓间充质干细胞应用前景 MSC移植还具有不发生免疫排斥反应或程度较低的优点 而且易于控制 MSC不仅具有多向分化潜能 还易于外源基因的导入和表达 目前已经实验性地将 型因子等多种基因导入MSC 获得很好的表达 MSC有可能成为一种新型的基因治疗的靶细胞 这样再与骨髓MSC多向分化潜能相结合 通过导入目的基因 将细胞治疗和基因治疗结合起来 对上述疾病的治疗将有更广阔的前景 探索分离有效成分的新方法 建立体外扩增和向不同细胞定向诱导分化体系 开展MSC及转基因后移植的体内效应等 MSC及其应用的一些相关问题 目前分离的MSC是一群异质性的细胞 还无法进一步提高它的纯度 事实上 MSC还从未真正分离出 还无法确定它的确切表型特征 而只是通过简单贴壁黏附的方法分离一群间质祖细胞 这群细胞里面包含着少量的真正的MSC亚群 因此 MSC体内分化的研究中还存在着一个问题 即最初所用的细胞是一群较杂的异质性的细胞群体 目前 对于MSC分化发育的研究中还有许多问题有待解决 如MSC的组成 如何确定MSC及它所参与的生物学发育的过程等 同样 MSC的临床应用也需要解决一些问题 如它的归巢能力和植入机制 植入机体后它的分化能力 它的免疫原性和调控它增殖与分化的因子等 神经干细胞 有关发育神经学的一个古老问题是神经细胞与神经胶质细胞是如何分化的 以往认为成年哺乳类动物中枢神经系统的神经分化在出生后即停止 其神经细胞丧失了分裂能力 一旦受到损伤 则只能由胶质细胞填充 随着神经生物学的飞速发展 一系列的研究表明 神经细胞和神经胶质细胞的分化主要是通过干细胞的多次有丝分裂及细胞内遗传基因的选择性表达来实现的 M rvinandMckay1992 神经干细胞的研究工作已成为近年来脑科学研究的一个重要领域 它不仅改变了成年动物的神经细胞不能分裂的传统观点 而且在研究脑的发育和分化 以及疾病治疗上均具有重大价值 神经干细胞的基本概念及特性 根据McKay 1997 的定义 神经干细胞为具有分化为神经元细胞 星形胶状细胞 少突胶质细胞的能力 能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞 神经干细胞处于未分化状态 缺乏分化标记 自我维持和自我更新的能力 具有多种分化潜能 能分化为本系大部分类型细胞 增殖分裂能力 这种自我更新能力和多向分化潜能可以维持相当长的时间 甚至终生 对损伤和疾病具有反应能力 ReynoldsandWeiss1996 神经干细胞的基本概念及特性 另与干细胞相关的有两类细胞 祖细胞和前体细胞 相对于干细胞而言 较干细胞的分化能力更有限的细胞为祖细胞 祖细胞具有单潜能分化和双潜能分化能力或其干细胞样特性只能维持较短的时间 而神经元前体细胞 neuralprecu 则是一个不太严格的术语 即某种前体细胞是在发育过程中较另一种细胞处于更早的阶段 可统称为干细胞和祖细胞 神经干细胞的来源与分布 人们在发育的胎脑和成年个体脑区都成功地分离了符合上述定义的神经干细胞 哺乳类动物如大鼠 在胚胎的大部分脑区 包括皮层 室管膜下层 纹状体 海马 中脑等区域都存在神经干细胞 而在正常成年大鼠的纹状体 海马 皮层和室管膜下层也都证实了神经干细胞的存在 DavisandTemple1994 Svendseneta1 1997 值得注意的是 人们在研究靠近侧脑室的室管膜下层 subependymalzone SZ 的细胞时发现SZ细胞可分为两类 一类为正在增殖的祖细胞 另一类为基本处于静息状态的干细胞 祖细胞存在时间短 增殖后不断地向外迁移分化或死亡 干细胞则缓慢分裂 在维持干细胞库稳定的同时产生祖细胞以补充丢失的祖细胞 神经干细胞的表型特征 神经干细胞的特殊标志物包括巢蛋白 nestin 和 或 波形蛋白 以及RCl抗原等 巢蛋白编码了一个中等纤维骨架蛋白 巢蛋白抗原属第 类中间丝 在神经板上皮细胞即开始表达 当神经细胞的迁移基本完成后巢蛋白的表达量开始下降 并随神经细胞分化的完成而停止表达 巢蛋白系早期原始神经细胞的标志物 已被广泛用于神经干细胞的鉴定 波形蛋白的表达也比较早 起始于神经迁移完成时 分化完成后波形蛋白的表达下降 因此波形蛋白也被一些人作为祖细胞的标志物 神经干细胞的增殖 分化及其影响因素 神经板的出现 神经管的形成到胚泡的发育都经历了从神经干细胞到祖细胞的增殖 迁移与分化 而神经干细胞的分化和增殖受到多种信号的调节 如果能够明确这些神经干细胞分化和增殖的调控因子 不但可以人为控制其向某一特殊类型细胞分化 也大大丰富了神经移植供体的来源 而且在神经性蜕变疾病和神经损伤患者中 还可以通过向特定脑区移植入某种特定的调控因子 诱导干细胞分化以修复病灶 神经干细胞的增殖 分化及其影响因素 生长因子在神经干细胞和祖细胞的分化发育过程中作用已用于维持干细胞特性的丝裂原信号主要包括EGF和bFGF 无论是体外培养的干细胞还是体内的前体细胞都检测到了丝裂原信号受体 不具有丝裂原作用的其他细胞因子如神经生长因子 脑源性神经营养因子等虽然也能使前体细胞数目增多 但已有证据表明此类因子的作用是促进神经元的生长和神经营养作用 在脑中已发现许多细胞因子 如红细胞生成素 集落刺激因子 白细胞介素家族等 且证明它们能够影响神经元的发育 最近的研究表明 细胞因子骨架多型性蛋白 bonemorphogeneticprotein BMP 可以促进神经祖细胞向星形胶质细胞方向分化 在干细胞和祖细胞的诱导试验中 细胞因子的协同诱导比单一诱导的效果更佳 神经干细胞的增殖 分化及其影响因素 在神经干细胞移植试验中发现 移植后干细胞的分化结果与宿主邻近区域细胞相类似 即使是同一来源的神经干细胞移植到不同部位后其分化结果也各不相同 但都与受体细胞相似 这证明神经干细胞或祖细胞在发育过程中受到外来信号的影响 致使其分化为与移植区域相类似的细胞 Meltzeretal 1998 目前已发现多种外来信号包括细胞因子 神经营养因子 肽类物质 如神经肽 及一些化学物质 如维甲酸 有助于神经干细胞和祖细胞的分化 提示这些信号在神经发育中有着重要作用 神经干细胞的增殖 分化及其影响因素 从根本上讲 外来信号也是基因调控的 而神经干细胞和祖细胞本身也可以产生多种分化增殖调控信号 尤其是邻近的干细胞和祖细胞可以产生信号调控其分化 有证据表明神经细胞发育的多样性可能与干细胞表达多种多样的转录因子有关 不同的转录因子的表达导致不同谱系的分化 如Nurrl基因的过度表达可以诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化 TurnerandCepko1987 此外 神经发育的次序性也可能是由干细胞自身决定的 通过受体表达的次序性在特定的时间只接受特定的信号从而引起特定的生物学效应 神经干细胞的分化潜能及可塑性 成年期脑室下区 subventricularzone S