细胞培养实验指导.doc

基础实验动物细胞培养常用试剂配制及无菌操作技术一、实验目的1、了解动物细胞培养用培养基及主要试剂的配制方法；2、掌握动物细胞培养无菌操作技术及CO2培养箱、倒置显微镜、恒温干燥箱等主要仪器的原理及使用方法。二、实验原理1、除某些厂商能提供高压灭菌的部分培养基外，大部分常用的干粉培养基如DMEM等加热后成份不稳定或被破坏（如维生素分解），故不能采用高压灭菌而必须使用0.22 m滤膜过滤除菌。以Sigema生产的DMEM干粉培养基为例，配制后在过滤除菌的过程中会造成CO2的丢失，从而导致pH值略微升高0.10.3，因而在配制时要考虑这一偏差。动物细胞培养涉及的多种试剂如胰蛋白酶、抗生素等均为不耐热试剂，必须采用过滤除菌进行制备。2、CO2培养箱可以自动控制CO2分压、温度及湿度（通过装有灭菌蒸馏水的湿盘调节箱内的空气湿度）。首次使用需校准CO2零点，定期对箱体内部进行清洁、除菌。3、无菌操作原理及基本要求：体外培养细胞没有抗感染能力，防止污染是决定培养成功与否的首要条件，若技术操作不规范，极易导致污染。在操作中要尽最大可能的保证无菌。实验前根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所（培养室、超净台）内，然后开始消毒。这样可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。无菌培养室每天用0.2%的新洁尔灭拖洗地面一次（拖布要专用），紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前后均要用75%酒精擦洗，紫外线消毒30min。勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，台面上用品不宜过多或重叠放置，否则会遮挡射线，降低消毒效果。移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。操作前原则上须彻底清洁手和前臂，擦干，戴一次性手套及口罩，手套可事先置于超净台消毒或戴上后喷75%酒精除菌。实验前点燃酒精灯，一切操作如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都应在火焰近处并经过烧灼进行，尽量使用镊子开关瓶盖等。开启和关闭有细胞生长的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止因温度过高烧死细胞。已吸过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管内的培养液如蛋白质等烧焦后会产生有害细胞的物质。瓶盖及塑料细胞瓶口过火焰时间不宜过长，以免烧焦产生有毒的气体，危害培养细胞。 工作台面上的用品要放置有序、布局合理。分别使用不同吸管吸取培养液、细胞悬液及其它各种用液，不能混用。培养瓶、培养液瓶不要过早打开，已开口者要尽量避免垂直放置以防止下落细菌的污染。进行培养操作时，不要用手触及已消毒的器皿，如已接触，要用火焰烧灼或取备用品更换。面向操作野时勿大声讲话或咳嗽，以免喷出的唾沫把细菌等带入工作台面发生污染。三、实验仪器、材料和试剂1、仪器及器械：高压灭菌锅、双蒸水器、冰箱、恒温干燥箱、超净工作台、CO2培养箱、pH计、容量瓶、烧杯、过滤器、倒置显微镜、培养瓶（板）、吸管、微量加样器、镊子、酒精灯、酒精棉球、试管架等。2、试剂：DMEM（Sigema）、DMEM-H、胰蛋白酶、小牛血清、青霉素、链霉素、二甲亚砜、PBS缓冲液、NaHCO3、重铬酸钾浓硫酸洗液等。四、方法与步骤1、灭菌器皿：将下列器械进行高压灭菌并经恒温干燥箱5060烘干备用。蓝盖试剂瓶、血清瓶、离心管、冻存管、枪头、50ml离心管、玻璃吸管（预先用洗液浸泡过夜，蒸馏水清洗、浸泡过夜，填塞脱脂棉花）、镊子等。2、试剂配制：（1）、血清小牛血清于56水浴30 min进行灭活，分装至已灭菌的50 ml塑料离心管中，一支于4保存备用，其余于-20-80保存。（2）、DMEM或DMEM-H培养基（非完全培养基）每瓶干粉配制成1 L，用NaHCO2调pH至6.97.0，定容，0.22 m滤膜过滤，记号笔标注“DMEM或 DMEM-H及配制时间”，4保存备用。（3）、DMEM或DMEM-H培养基（完全培养基）在配制好的DMEM或DMEM-H非完全培养基中加入灭活的血清（终浓度10% v/v）及无菌双抗（终浓度50100u/ml），记号笔标注“DMEM或DMEM-H完全培养基及配制时间”，4保存备用。（4）、双抗青霉素（80万u/支）及链霉素（100万u/支）共同溶解于100 ml灭菌PBS缓冲液或去离子水、超纯水中，0.22 um滤膜过滤除菌，-20保存备用。（5）、胰蛋白酶用灭菌PBS配制成0.250.5%（m/v），0.22 um滤膜过滤除菌，4或-20保存备用。（6）、二甲亚砜0.22 um滤膜过滤除菌，保存备用。3、无菌操作步骤：（1）、用75%酒精清洁超净台面，按实验要求合理摆放各种物品（不能紫外照射的培养基等试剂除外），紫外灭菌30min； （2）、清洁手和前臂，穿戴一次性手套及口罩；（3）、点燃酒精灯；（4）、尽量使用镊子练习开关瓶盖、夹取吸管、吸头等操作；（5）、练习使用吸管或微量移液器吸、放溶液。（6）、整理、清洁台面，紫外照射30min。4、倒置显微镜CO2培养箱使用：（1）、使用倒置显微镜观察悬浮细胞；