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毕业论文题目论证书拟定学位论文题目：军牧1号白猪促卵泡激素（FSH-）亚基基因多态性及其与产仔数、泌乳率的关联性分析 学 院：动物科学学院姓 名：方启云年级专业：10级动物科学专业学 号：81100616指导老师：邢沈阳开题论证时间：2013年11月18日文献阅读序号作者文章题目（书目）期刊名称（出版单位）、时间、页码(1) 李千军，王立刚，穆淑琴，等ESR、FSH 及 OPN 基因多态性与母猪繁殖性状的关联分析J中国畜牧兽医，2010，37(10) : 139-143(2) 褚维伟，高颖，闫雷，等3 个繁殖主效基因与糯谷猪繁殖性状的关联性J 贵州农业科学，2011，39( 9) : 152-155(3) 陈 来华 , 王 立贤 , 季 跃光 , 等 . 大 白猪 BF 基因多态性与繁殖性状及胎盘效率关联研究J, 遗传, 2009, 31(6): 615-619. (4) Apostolov A, Sabeva I. Breeding value estimation on some selection traits of performance productivity of small pig populations from the Danube White breed J. Bulgar J Agri Sci,2009, 15(3): 276-280. (5) 吴飞,田兴贵,杨正梅,王家鹏,杨云,朱红刚,欧德渊,罗终菊,唐静,刘若余.贵州小香羊FSH基因第2外显子SSCP多态性分析J. 贵州农业科学. 2010(12) (6) 鲁绍雄,胡晓湘,连林生,吴常信,严达伟,李宁,任文辉,赵中保. 撒坝猪ESR和FSH-基因多态性及其与产仔数的关联分析J. 云南农业大学学报. 2009(03) (7) 林家栋,张蓝艺,闫雷. 糯谷猪FSH基因多态性与部分繁殖性能的关系J. 四川动物. 2010(05) (8) 吴飞，田兴贵，杨正梅，等贵州小香羊基因第外显子多态性分析贵州农业科学，（）：(9) 马君，邵洪侠，杨玉平.抗生素替代品的研究与发展J. 兽药， 2013， 163(10) 陈来华 , 王立贤 , 季跃光 , 等 . FSH 亚基基因与繁殖性能及胎 盘 性 状 的 关 联 分 析 J. 畜 牧 兽 医 学 报 , 2010, 41 (11):1365-1370. (11) Zhang D J, Liu D, Yang G W. Polymorphism of FSH subunit gene in six pig breeds J. J Northeast Agricultural University(English Edition), 2010, 17(1): 62-64. (12) An X P, Han D, Hou J X, et al. Polymorphism of exon 2 of FSH beta gene and its relationship with reproduction performance in two goat BreedsJ. Agricultural Sciences in China, 2010, 9(6): 880-886. (13) Zhang C Y, Wu C J, Zeng W B, et al. Polymorphism in exon 3 of follicle stimulating hormone beta (FSHB)subunit gene and its association with litter traits and superovulation in the goat J. Small Ruminant Research, 2011, 96(1): 53-57. (14) 严隆盛，孙敬礼，王永庆，等.FSH 和 PRLR 基因多态性对长白猪繁殖性能的影响J.安徽农业科学，2009，37（30）：15082-15083. 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(19) 吴飞，田兴贵，杨正梅，等贵州小香羊基因第外显子多态性分析贵州农业科学，（）：(20) 甘乾福，任播扬，乔 慧，等. 猪 FSH 基因多态性及其与产仔性能的相关性分析. 畜牧与饲料科学，2011 ，32 （12 ）:109-111. 文献综述报告主要内容（对文献进行了归纳总结/分类评价/拟选题范围及选题意义等）军牧 1 号是原解放军军需大学以三江白猪和施格猪为基础育种材料，采用杂交合成、闭锁群继代选育和多性状综合指数等育种方法，经过 8 年 5 个世代选育成的国家新品种。该猪毛色全白、体长、背宽、肢蹄粗壮、臀部丰突；母猪窝产活仔数 10.85 头；生长育肥猪平均日增重 711g，170 日龄达到 90kg；每千克增重耗料 3.04kg；猪群健康状况优良；在生长速度、胴体瘦肉率等方面明显优于引进国外优良品种长白猪和约克夏猪，经鉴定该猪在日增重、产仔数、饲料报酬及瘦肉率综合性能指标达到国际先进水平。已在吉林、山东、广东、内蒙古和黑龙江省区推广应用。我国是世界猪肉第一生产大国，2004 年猪存栏数 48200 万头，出栏 61800 万头，猪肉产量 4702 万吨，占当年肉类总产量的 64.9% ，世界上近一半的猪养在中国。猪肉不仅是人们动物蛋白的主要来源，而且，养猪业亦是我国畜牧业的主要收入来源。国家农业发展纲要提出到 2010 年，肉类产量达到 7000 万吨(其中猪肉占 70%)，要在我国人均粮食产量不可能有明显增加的情况下，完成这一目标是十分艰巨的。在影响养猪业生产效率的诸多因素中，母猪繁殖性能成为制约规模化养猪生产效益的关键因素，只有选择产仔数高的母系用于配套系生产，才能在同样的饲养管理条件、相同的成本投入下，获得更大的养猪生产效益.猪的繁殖性能是一个复杂的重要经济性状，长期以来在猪遗传改良中，产仔数的选择进展不大。由于繁殖性能的遗传力低(h20.2)，利用常规育种技术获得的遗传进展有限。据著名动物数量遗传学家Haley 计算，只要将猪产仔数提高 1 头，英国养猪业每年可获得 7 亿英镑的额外利润，而整个欧洲联盟每年获得的额外利润将至少是 20 亿英镑。在我国，根据计算，母猪每胎的产仔数提高 1 头，可增加收益 100元左右，尽管目前中国工厂化养猪占的比重不高，但也将为中国养猪业每年创造 190 亿人民币的纯利。因此，如何应用现代分子育种技术提高猪产仔数、泌乳率的改良效率，是目前猪育种中的热点研究之一。长期以来，我国品种猪的繁殖率、生长速度和瘦肉率较国际优良品种低，而常规繁殖育种方法很难使之大幅度提高。1993 年分子育种中关键技术的成熟、优良性状基因诊断试剂盒的涌现，为动物的遗传改良提供了新的机会。1994 年，英国等发达国家开始利用分子育种技术改良一些核心畜禽品种。猪的分子育种进步非常迅速，一种影响猪存活率和猪肉品质的恶性高温综合症基因（又被称为猪应激综合症，PSS）通过分子育种手段将其淘汰出核心群，每年减少损失达到了 10 亿美元，这是常规育种 100 年也达不到的事情，分子育种已经受到了世界范围内的高度重视，因此有人预言：21 世纪将是分子育种的世纪，而且品种对整个畜牧生产的贡献率将达到 50%以上。随着动物基因组计划的运行，猪的遗传连锁图谱已基本构建成功，19 对染色体上已有 1800 个标记被定位，且比较均匀地分布在猪的整个基因组上。一些与猪生长发育、生殖和肉品质相关的基因被克隆，确定了其遗传多样性，建立了相应的检测手段并应用于猪的育种研究。随着基因组计划的进行，新的标记将不断出现，也将逐步应用于养猪生产，猪的生产性能将会得到进一步的提高。本研究以 FSH亚基基因作为控制猪高产仔数、泌乳率候选基因，以军牧一号猪为样本，对插入序列形成的多态性及其与产仔数、泌乳率的关联性进行分析。开题报告拟定学位论文题目军牧1号白猪促卵泡激素（FSH-）亚基基因多态性及其与产仔数、泌乳率的关联性分析 一、 选题依据（包括题目的学术价值、应用价值、国内外研究现状分析等）（一） 学术价值、应用价值猪的产仔数、泌乳率性状是制约养猪生产效益的关键因素之一, 是猪最为重要的经济性状。如果能够增加产仔数，提高泌乳率，无疑将给养猪业带来可观的经济效益。近年来，随着分子生物学技术的进展，对猪产仔数、泌乳率性状基因标记的研究十分活跃。因此，研究控制猪产仔数、泌乳率性状的基因是热点之一。（二）国内外研究现状促卵泡素（follicle-stimulating hormone，FSH）化学特性 FSH是一种糖蛋白激素，分子量约 30KU。FSH 分子是由非共价键结合的 和 两个亚单位组成的异质二聚体。 亚单位决定激素的生物学特异性，但只有与 亚单位结合才有生物学活性。 亚单位包含 12 个半胱氨酸残基，形成 6 个分子内二硫键，这在不同动物种间是高度稳定的。但不同动物的同种激素或同种动物不同激素， 亚单位的 N-端长短不一。因而，FSH 的种属差异较大。猪 FSHcDNA 由杜立新等、Kato 等人克隆成功，Hirai 等克隆了 FSH 全基因。赵要风、李宁等在对几个猪品种 FSH 基因 5调控区分析表明：5调控区的差异可能会引起太湖猪与其它猪种 FSH 表达的差异；对几个猪品种 FSH 的 RFLPs的研究证明该基因存在品种间多态性，且作为促进卵泡发育和成熟的糖蛋白激素，高排卵数的猪品种如二花脸、梅山猪和其它低排卵数品种表现出对应性差异；随后又通过交叉 PCR 扩增对猪 FSH 亚基基因结构区插入片段进行了精确定位，该插入片段位于第 1 内含子靠近第 2个外显子的上游区段。序列分析表明插入片段位于发表序列的+809 与+810 碱基之间，长度为 292bp。插入片段的 DNA 序列特征表明该插入片段为一典型的哺乳动物基因组内的逆转座子，末端具有 PolyA 结构，两端具有 AAACGTTT 正向重复序列，该重复序列呈现明显的回文结构，在插入片段中发现了一个 RNA 聚合酶启动子，A 区序列为TGGCGCAGTGG，B 区序列为 GGTTCGGTCC，区序列与由 RNA聚合酶转录的爪蟾 tRNAMet 基因启动子区同源性达 90%以上。A 区、B 区与 RNA 聚合酶启动区的保守序列表现高度的吻合性，说明该插入片段可能由某种 RNA 聚合酶转录的 RNA 经逆转录成DNA 后转座形成。从而证明 Hirai 等人发表的 FSH 基因并非是唯一的基因结构，并推断 FSH 基因是控制猪产仔数性状主效基因或与主效基因存在紧密的遗传连锁。焦淑贤等人发现太湖猪首次发情周期内血清中 FSH 浓度显著高于长白猪，说明 FSH 在不同猪种之间的表达调控区可能存在差异。这种差异是由结构区插入片段造成的，但这种插入现象是否会造成 FSH 表达的差异还需进一步研究分析。关于哺乳动物 FSH 亚基基因位点的插入缺失现象在羊中亦有发现，具体位置是第 3 个外显子下游区段。二、 研究方案（目的、内容、方法、技术路线、可行性分析、研究进度、预期成果及论文框架等）1、 研究目的、研究内容和拟解决的关键问题研究目的：利用分子生物学技术对猪的产仔数、泌乳率性状进行辅助选择以达到提高产仔数、泌乳率性状的目的。研究内容：通过对FSH-插入序列的结构的分析和研究，分析军牧1号白猪FSH-亚基因的多态性及与产仔数、泌乳率的关联性。1、材料：本实验的实验猪军牧一号，样本采自吉林大学农学部种猪场100头产仔3胎以上的母猪, 产仔数、泌乳率性状资料取自种猪场 20102013 年的繁殖记录。2、器材与试剂：（1）主要仪器设备：酸度计、电子分析天平、电热恒温水浴锅、超净工作台、紫外线透射仪、水溶震荡仪、脱色摇床、PCR仪，稳压稳流电泳仪、垂直电泳槽，制冰机、离心机、可调式恒温水浴箱、恒温振荡器，液氮罐等（2）试验药品：十二烷基硫酸钠（SDS）、Tris 饱和酚、超纯尿素、三氯甲烷、蛋白酶 K、Rnase、琼脂糖、dNTP、Taq 酶、DNA Maker、丙烯酰胺、甲叉、甲酰胺、溴酚兰、甘油、N，N，N，N 四甲基乙二胺（TEMED）、二甲苯青、溴化乙锭（EB），氯化钠、无水乙醇、三羟基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四二酸二钠（EDTA）。3、进行溶液试剂配制4、统计学分析：使用SPSS软件分析。拟解决的关键问题：PCR-SSCP 分析技术是一种有效的 DNA 多态性检测手段。从理论上说它能检测出待分析 DNA 片段内的基因突变，碱基插入或缺失等所有的 DNA 多态性位点。与其它的分子标记技术相比，PCR-SSCP 最大优点是能检测出DNA片段长度相同但碱基序列组成发生变化的所有基因突变位点。但它不能指出碱基突变的位置，而且所检测的片段不能太长，否则多态性检出率就会受影响。一般认为，当 DNA 片段在300-500bp 时，其检出率约为 89%。2、拟采取的研究方法、技术路线、可行性分析研究方法：本实验通过候选基因法，对影响猪的产仔数、泌乳率的候选基因促卵泡素 亚基基因(FSH-)进行研究。1、取样：本实验的实验猪军牧一号，样本采自吉林大学农学部种猪场100头产仔3胎以上的母猪。2、DNA 的提取：（1）血液DNA的提取（2）耳组织样 DNA 的提取（3）基因组 DNA 的纯化（4）基因组 DNA 检测3、PCR 过程：（1）进行引物设计（2）进行PCR-RFLP检测（3）对PCR产物进行检测技术路线： 可行性分析：FSH 是一种重要的生殖激素，主要刺激卵泡的生长和发育。李宁等经研究发现在猪的促卵泡素 亚基基因(FSH-)第 1 内含子靠近第 2个外显子的上游区段，位于发表序列的+809 与+810 碱基之间，有一长度为 292bp 的插入序列；并存在多态性。通过对这一位点的进一步研究表明，FSH 基因可能是是控制猪产仔数、泌乳率性状主效基因或与主效基因存在紧密的遗传连锁。所属实验室内几乎包括所有该课题需要的仪器及有可供饲养试验和取样试验的实验基地, 实验基地多年从事种猪生产，。3、本题目的创新之处和可预期的创造性成果军牧 1 号猪产仔数、泌乳率的遗传力低，用常规育种方法进行选择收效甚微，所以寻找其主效基因和遗传标记对提高猪产仔数具有重要意义。