DC培养.docx

1. 定义和缩写2.1.DC树突状细胞2.2.CTL细胞毒性T淋巴细胞2.3.rhIL-4人源重组白细胞介素4 2.4.rhGM-CSF人源粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子2.5.rhTNF-人源肿瘤坏死因子2.6.PE-antihCD80白细胞分化抗原802.7.FITC-antihHLA-DR人白细胞DR抗原2.8.APC-antihCD54白细胞分化抗原542.9.L-GlnL-谷氨酰胺2.10.DMSO二甲基亚砜2.11.Anti-CD3-McAb 抗CD3单克隆抗体3. 主要仪器、耗材和试剂注意：所有用于临床研究的DC细胞必须是在符合GMP条件的超净环境下制备。与细胞培养相关的材料必须是无菌、无致热原的，并严格按照操作说明书进行实验，有特殊说明的可以除外。若需要使用同等的材料和设备，对于任何改变都需要做详细的记录。3.1. 仪器3.1.1 生物安全柜3.1.2 水平低速离心机3.1.3 CO2 孵箱3.1.4 倒置显微镜3.1.5 液氮罐3.1.6 水浴锅3.1.7 移液器3.1.8 热合机3.1.9 -20冰箱3.1.10 4冰箱3.1.11 -80冰箱3.2. 耗材3.2.1 75cm2、225cm2细胞培养瓶3.2.2 细胞培养袋3.2.3 移液管3.2.4 50ml、250ml离心管3.2.5 Tip头3.2.6 细胞刮刀3.2.7 细胞冻存管3.2.8 5ml、50ml注射器3.2.9 细胞筛网3.2.10 血琼脂培养皿3.3. 试剂3.3.1 无血清培养液3.3.2 rhGM-CSF3.3.3 rhIL-43.3.4 T细胞因子3.3.5 Anti-CD3-McAb3.3.6 人血白蛋白3.3.7 生理盐水3.3.8 人淋巴细胞分离液3.3.9 0.4%苔盼蓝溶液3.3.10 DMSO3.4. 原材料3.4.1 肿瘤病人外周血单核细胞4. 操作步骤 贴壁的外周血单核细胞的制备4.1. 将血细胞分离机分离的肿瘤病人的血细胞悬液（一般50100ml）分成23份加到50ml离心管中，补生理盐水至50ml，混匀。室温，2000rpm，离心15min。4.2. 吸弃上层的血浆层，加生理盐水稀释剩余的血细胞悬液至30ml，混匀，分别加至15ml的淋巴细胞分离液上（23管）。室温，2000rpm，离心20min。4.3. 取出离心的细胞，吸去最上层的液体，收集PBMC层液体至2个50ml离心管中，并加生理盐水至50ml，混匀。室温，1800rpm，离心8min。4.4. 弃上清，用手指轻弹开沉淀的细胞，将细胞重悬于50ml的生理盐水中。室温，1800rpm，离心8min。并用生理盐水重复洗涤细胞两次。4.5. 弃上清，用无血清培养液重悬细胞沉淀。4.6. 取100l细胞悬液进行计数（具体方法详见白细胞计数和成活率计算SOP），苔盼蓝染色，计数并记录实验结果。4.7. 将细胞悬液稀释至120ml，混匀后铺6个75cm2的培养瓶，每瓶加细胞悬液20ml，置于37，5%CO2培养箱中贴壁培养30min。4.8. 30min后，取出培养瓶，小心晃下贴壁不牢的细胞，吸去上层未贴壁的细胞悬液，并用每瓶10ml无血清培养基洗涤贴壁的细胞一次，合并至未贴壁细胞悬液中。在75cm2培养瓶中添加15ml的含100ng/ml rhGM-CSF、30ng/ml rhIL-4、2%人血白蛋白及2mmol/L Gln的人DC细胞完全培养液，轻轻摇匀后，将75cm2培养瓶置于37，5%CO2的培养箱中，作为DC培养。未贴壁的细胞悬液共约180ml，取样计数，留1-2108放入包被好的225cm2培养瓶中，补入含T细胞因子的培养基至100ml，余的细胞全部转入细胞培养袋，补入含T细胞因子及50ng/ml Anti-CD3-McAb的培养基至1000ml，二者置于37，7.5%CO2的培养箱中，作为CTL培养。DC培养DC补液4.9. 第二天及第四天，给每瓶补加含100ng/ml rhGM-CSF、30ng/ml rhIL-4、2%人血白蛋白及2mmol/L Gln的人DC细胞完全培养液5ml。DC的腺病毒转导4.10. 于第六天收获未成熟DC细胞。4.11. 用细胞刮刀将一瓶DC细胞刮起，收集细胞悬液，混匀后吸出100l细胞悬液进行计数，苔盼蓝染色，计数并记录实验结果。4.12. 6瓶75cm2培养瓶中每瓶吸出10ml培养液（剩余15ml培养液），至50ml的离心管中，室温，1800rpm，离心8min。刮过的培养瓶标记后分开处理。4.13. 弃上清，用含100ng/ml rhGM-CSF、30ng/ml rhIL-4、2%人血白蛋白及2mmol/L Gln的DC细胞培养液50ml重悬沉淀的细胞，并进行腺病毒的转导，细胞悬液中加入iAPA细胞因子，加入的量为10000vp/cell。但最多转染2支iAPA因子。4.14. 细胞悬液混匀后铺回75cm2培养瓶中，每瓶约8.6ml。4.15. 培养瓶置于37，5%CO2孵箱中过夜培养。 DC细胞的成熟4.16. 第七天，取出6个75cm2细胞培养瓶，用细胞刮刀将全部细胞刮起，收集细胞悬液至50ml离心管中，并用5ml生理盐水将每个培养瓶洗一遍，合并洗液和细胞悬液，混匀，配平。室温，1800rpm，离心8min。4.17. 弃上清，用手指轻轻弹开细胞沉淀，并将全部DC合并重悬于31ml的生理盐水中，混匀，取出100l细胞悬液计数，苔盘蓝染色，使用血细胞记数器按照标准的操作程序进行计数。留1ml（细胞106以上）作表面分子CCR7、HLA-DR、CD54、CD80、CD83、CD86以及PI荧光直标抗体染色，流式细胞仪检测(具体方法详见流式检测SOP)。其余30ml平分2份，分别补生理盐水至40ml。室温，1800rpm，离心8min。4.18. 弃上清，弹匀细胞，一管细胞用生理盐水重悬至40ml，混匀。室温，1800rpm，离心8min。另一管细胞，加入1ml细胞冻存液（人血白蛋白:无血清培养基:DMSO=5:4:1），混匀后冻存于2ml的冻存管中，置于冻存盒中，放入-80冰箱，次日转入液氮保存。4.19