结核分支杆菌耐药机制及应用多重PCR方法快速鉴定结核分.docx

结核分支杆菌耐药机制及应用多重PCR方法快速鉴定结核分枝杆菌的研究 邓明惠结核分枝杆菌简称结核杆菌，1882年由德国科学家Koch发现并证明是结核病的病原体。抗结核药物的相继出现、人们生活水平的提高、卫生设施的改善，使结核病的发病率持续下降，结核病的治疗情况得到了明显改善。然而，化疗方案不合理、对结核病患者的治疗缺乏管理或管理不善、药物供应渠道不畅或质量不佳和患者经济困难中断治疗等原因，使得结核杆菌耐药性的产生，结核病在沉寂一段时间后死灰复燃、再次爆发。抗结核药物是一把双刃剑，一方面可以有效的控制结核分枝杆菌，另一方面它又能产生耐药性，从而导致抗结核药物的无效。近年来，随着分子生物学理论和技术的发展，为在分子水平研究结核杆菌提供了良好的技术平台，并且取得了突出。本文以六种主要的抗结核药为例对结核杆菌耐药分子机制的研究及应用多重PCR方法，对结核分枝杆菌及非结核分枝杆菌进行鉴定作一综述。 1结核杆菌耐异烟肼的分子机制 异烟肼(HIN)通过在菌体内被过氧化氢酶过氧化物酶激活，活化后的异烟肼作用于细胞壁分枝菌酸合成途径中的酶系包括：烯酯酰ACP还原酶(InhA)、酰基携带蛋白(AcpM)及B酮酯酰ACP合成酶(KasA)的复合物，通过抑制它们的活性干扰分枝菌酸的生物合成，最终导致菌体缺壁死亡。Mdluli等发现13酰酮酰基载体蛋白合成酶(kasA)上出现了引起氨基酸改变的突变，仅发生于没有以上基因突变的INH耐药菌中。2结核杆菌耐利福平的分子机制利福平(RFP)是通过特异地与RNA聚合酶13亚基结合，抑制RNA聚合酶活性，干扰分枝杆菌RNA的转录及合成，阻碍蛋白质合成而发挥抗菌作用。研究表明，90以上结核杆菌耐RFP是由于其作用靶分子RNA多聚酶13亚单位的编码基因(RpoB)突变所致。RpoB基因全长3543个碱基，其核心区域81个碱基一耐利福平决定区(RRDR)发生突变时，使DNA依赖RNA聚合酶B亚单位酶活性改变，利福平不能与细菌RNA聚合酶13亚单位结合而表现为耐药。此外，研究现在RpoB基因的氨基酸终止区域的突变也与利福平耐受有关。3结核杆菌耐链霉素的分子机制链霉素(SM)主要作用于结核杆菌的核糖体，诱导遗传密码的错读，抑JmRNA转译的开始；干扰转译过程中的校对，从而抑制蛋白质合成。结核分枝杆菌耐SM的主要分子机制是编码小亚基的S12蛋白的rpsL基因和编码16SrRNA的rrs基因突变，抑制药物结合到核糖体上的能力，影响16SrRNA的高顺序结构，使之对SM耐药。4结核杆菌耐吡嗪酰胺的分子机制吡嗪酰胺(PZA)在细胞内酸性环境中经吡嗪酰胺酶作用转变成吡嗪酸而起杀菌作用。耐药菌株编码吡嗪酰胺酶的pncA基因突变，核苷酸转换或颠换引起氨基酸置换以及核昔酸插入或缺失突变丽产生无意义多肽链，使该酶活性丧失或降低而不能将PZA转变成活性型，导致耐药是结核分枝杆菌耐PZA的主要分子机制。研究发现一些吡嗪酰胺酶活性呈阴性，pncA基因没有发生突变的菌株，亦产生耐药，这就表明还有其他的机制导致吡嗪酰胺酶失活，进而产生对吡嗪酰胺的耐受。5结核杆菌耐乙胺丁醇的分子机制乙胺丁醇(EMB)是一种阿拉伯糖类似物，作用于分枝杆菌阿拉伯糖基转移酶，抑制阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳聚糖，影响细胞壁分枝菌酸一阿拉伯半乳聚糖一蛋白聚糖复合物形成，发挥抗分枝杆菌作用。最近的研究表明，结核分枝杆菌耐乙胺丁醇与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embABC操纵子突变或emb蛋白过度表达有关，其中embB基因突变是耐乙胺丁醇产生的主要原因。embB基因突变导致分枝杆菌阿拉伯糖基转移酶结构改变，影响了EMB与阿拉伯糖基转移酶的相互作用而耐EMB。6结核杆菌耐喹诺酮类药的分子机制喹诺酮类药物(FQ)主要作用靶位是菌体内DNA解旋酶(由gyrA和gyrB分别编码其A亚基和B亚基)，使DNA复制受阻，导致菌细胞死亡。gyrA突变导致高一中度耐FQ，gyrB突变导致低度耐FQ。研究表明，结核杆菌获得性耐喹诺酮，主要是基因gyrA的喹诺酮耐药决定区中67106位氨基酸密码子突变产生高水平耐药，但也不排除细胞壁渗透性下降引起耐喹诺酮类物的可能。近年来，非结核分枝杆菌感染人数有所增加【1】。其临床症状和X线表现与结核相似，难以鉴别，而且多数非结核分枝杆菌对抗结核药物有天然耐药性，因此正确鉴定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌对于疾病诊断和治疗至关重要【2】。然而，传统的生物学鉴定方法过于复杂费时。近年来，随着分子生物学技术的进展，已经应用一些分枝杆菌特异性的DNA片断，行分枝杆菌的鉴别【3】。应用多重PCR技术，在同一反应体系中加人分枝杆菌属共有、结核分枝杆菌复合体群特异性及结核分枝杆菌种特异性基因标志，与培养方法进行比较，了解多重PCR技术的可靠性。传统的结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的生物学鉴定方法主要依据是细菌的生长速度、色素产生、生化反应等，方法费时又复杂。近年来，国内外大量文献报道应用PCR技术进行分杆菌的快速鉴定，应用最广泛的是Is6110插入序列。多重PCR技术是在反应体系中同时加入3对引物，同时扩增表达结核分枝杆菌种的MTHo特异蛋白的396bp基因序列、表达分枝杆菌属的32kD蛋白的506bp基因序列、表达结核分枝杆菌复合体群的IS6110 【4】插入序列的984bp基因序列，可以将分枝杆菌与非分枝杆菌、结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌、结核分枝杆菌与牛分枝杆菌鉴别开：应用多重PCR法与BAcTEC培养的结果有很高的一致性，而且100的经传统方法鉴定为非结核分枝杆菌菌株均能扩增出表达分枝杆菌属的506bp片段，鉴定的敏感性为100，为临床结核病和分枝杆菌病的鉴别诊断提供了有效的手段。应用多重PCR技术时，要注意优化PCR反应条件。实验采用一管便携式PCR反应试剂盒直接加入模板和引物即可进行反应，操作方便，最大限度减少取样错误和交叉污染的机会；引物浓度、循环温度及时间是本实验成败的关键，因此在采用不同引物进行多重PCR扩增时，应首先进行预实验，确定最佳扩增条件。本实验结果显示，多重PCR技术可以在12天内快速、准确地鉴别出结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，为临床结核与非结核分枝杆菌病的快速鉴定提供了一个有效的手段，具有很好的临床应用前景。【参考文献】1 中华医学会结核病分会非结核分支杆菌病处理指南中华结核和呼吸杂志2000，23(11)：6502 Katoch VM Newer diagnostic techniques for tubeiculosis，I