固原地区结核分子流行病学的特点3.pdf

文章编号 1001 5949 2002 06 0323 03 论 著 固原地区结核分子流行病学的特点 3 裴秀英1 唐永瑞2 王 丽1 摘要 目的 探讨宁夏固原地区结核分子流行病学的特点 方法 提取结核分枝杆菌基因组DNA 经限 制性内切酶Pvu 切割 琼脂糖凝胶电泳和Southern转印后 用荧光标记的IS6110 DNA序列中245bp探针杂交 以核酸化学发光试剂盒探测荧光信号 比较各菌株指纹的IS6110拷贝数和带型 分析流行菌株的特点 结果 固 原地区流行结核分枝杆菌临床分离株DNA指纹图谱带型相似 IS6110拷贝数较多 结论 固原地区流行的结核 分枝杆菌多态性程度较低 在基因上具较近的亲缘关系 关键词 分枝杆菌 结核 DNA指纹法 分子流行病学 中图分类号 R52 文献标识码 A Moleculer epidemiology of the strains of mycobacterium tuberculosis isolated fromguyuan PEI Xiu ying et al Ningxia Med Coll Yinchuan 750004 China Abstract Objectives To study moleculer epidemiology of the strains of mycobacterium tuberculosis MTB isolated from Guyuan Methods Chromosomal DNA of MTB was digested with endonuclease PvuII then electrophresed on agarose gel plate and transferred capillarilly to a nylon filter and hybridized with 245bp fragment of IS6110 which labeled using random primer fluorescein la2 beling kit The RFLPpatternsof Southern hybridization were inspected autofluorographically and the chromosomal DNAsof MTB were thereby typed Results The strains of MTB isolated from Guyuan carry 10 22 copies which are present in a less variety of chromoso2 mal site Conclusions There is low genotypic variability in Guyuan isolates Key words Mycobacterium tuberculosis DNA f ingerprinting Moleculer epidemiology 随着HIV感染人数的增加及多耐药 Multiple drug resistant MDR 菌株的出现 结核对人类健康的 威胁越来越受到人们的重视 结核分枝杆菌分离株 鉴定与分型的研究 对结核病的快速诊断 流行病学 调查和监控具有重要的意义 发达国家如荷兰 美 国 加拿大等已开展常规化的结核分枝杆菌DNA指 纹鉴定 我国为结核病高发区 病例多 资金少 技术 设备缺乏 根据我国实际 选择有代表性的地理区域 有重点地开展指纹研究是很有必要的 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 菌种 由固原结防所分离的结核分枝杆菌临 床分离株17株 经鉴定均为结核分枝杆菌 其中敏感 株11株 耐药株6株 5 株为MDR株 人类免疫缺 陷病毒 HIV 感染状态不详 样本来自临床诊断为 肺结核患者的痰 北京 上海结核分枝杆菌临床分离 株分别为15 16株 分别由北京市结核病胸部肿瘤研 究所和上海疾病预防控制中心结核病研究室提供 3 宁夏教委基金项目 990903 作者单位 1 宁夏医学院 宁夏 银川750004 2 宁夏固原县结核病防治所 宁夏 固原756000 作者简介 裴秀英 女 1965 甘肃籍 汉族 副教授 硕士学位 从 事生物化学研究 结核分枝杆菌标准株H37 Rv 菌株号 ATCC27294 和 减毒株H37 Ra 菌株号 ATCC35835 由北京市结核 病胸部肿瘤研究所参比室提供 1 1 2 主要试剂 Pvu 为MBI Fermentas公司生 产 聚合酶链反应 PCR 试剂盒为美国Promega产 品 随机引物荧光标记试剂盒 Random primer fluo2 rescein labeling kit 和核酸化学发光试剂盒 CDP star nucleic acid chemiluminescence reagent 由英国 NENTM Life Science Products Inc 生产 1 2 方法 1 2 1 染色体DNA的提取 1 细菌培养物约50mg 80 灭活30分钟 分别加入溶菌酶 10 SDS和 20mg ml蛋白酶K使终浓度分别为5mg ml 1 和 2mg ml 37 孵育过夜 加入等体积酚 氯仿 异戊 醇 25 24 1 轻轻混匀 重复抽提2 3次至液体清 亮 加等体积氯仿 异戊醇 24 1 抽提 加3M NaAC 和无水乙醇沉淀 以70 乙醇和无水乙醇洗涤 自然 干燥 重悬于TE中 于紫外分光光度计上测量其 A260的值以确定DNA的含量 1 2 2 Southern转印和杂交 2 染色体DNA 2 g经 限制性内切酶Pvu 消化后 于含0 5mg ml溴乙锭 EB 的1 琼脂糖凝胶上电泳 以Supercoiled DNA 323 宁夏医学杂志2002年6月第24卷第6期 Ningxia Med J Jun 2002 Vol 24 No 6 ladder Pvu x174 Hae 混合物为分子量标志物 DNA经凝胶分离后 经毛细管转印法转印至尼龙膜 上 紫外线固定 以INS 1 5 CGTGAGGGCATC2 GAGGTGGC 和INS 2 5 GGTAGGCGTCGGT2 GACAAA 为引物 以H37Rv染色体DNA 为模板合 成IS6110序列中245bp片段 经纯化后用荧光素标 记的dNTP随机引物试剂盒进行标记 尼龙膜于 60 以变性的245bp探针杂交过夜 杂交后在同样 温度下洗涤探测杂交信号 1 2 3 DNA指纹分析和带型比较 统计各株IS6110 指纹的拷贝数 比较相同拷贝数株的带型分布 找出 位置相同的带进行带型匹配 带型完全匹配的株为同 型株 具有相同带型的临床分离株为一簇 Lane 1 12为MTB固原分离株 Lane 13 19为MTB上海分离株 Lane 20为H37Rv 附图 MTB DNA指纹图谱 2 结果 17株固原分离株 经Pvu 切割 southern印迹 245bp探针杂交后 其DNA指纹图谱呈现出17种带 型 各株的DNA指纹图谱均含有较高的IS6110拷贝 数 见附图 其中4株为中拷贝菌株 拷贝数为6 15 其余均为高拷贝菌株 拷贝数 16 且高拷贝 菌株之间变异程度较小 有些菌株只相差一条带 但 无同型株出现 从带型分布上看 固原分离株的带型 分布与本实验室研究的北京分离株的带型分布相似 而与上海分离株的带型分布相差较大 但来自固原 的分离株在1 0 1 3kb之间多为5条带 而北京家 族多为3 4条带 由于其大部分带出现的位置与北 京分离株相同 主要出现在6 5kb 5 5kb 4 4kb 3 2 kb 2 8kb 2 2kb 1 9kb位置 说明其与北京分离株 亲缘关系较近 这些特点与Embden报道的 北京家 族 Beijing family 带型相似 3 在传播上属同一来 源 3 讨论 我国是发展中国家 属于结核病高发区 结核病 至今仍是危害我国国民健康的重要慢性传染病之一 由于HIV感染 流动人口的增多以及耐药菌株的增 加 使得结核的发病率又有上升的趋势 因此 对于 疾病的起源和传播 分布以及消长和流行规律的研 究 有助于了解全球结核病传播的状况 揭示其传播 的关系 预防和控制结核病 插入序列 insertion se2 qunse IS 在细菌染色体中是一些可移动的成份 往往 会引起基因重排如转位 缺失 倒置和重复而造成多 型性 利用这种性质进行结核分枝杆菌分离株的分 型 在结核的流行病学研究中是非常有意义的 结核 分枝杆菌的DNA指纹研究是利用结核分枝杆菌中插 入序列的数目和位置不同 采用限制性内切酶和核酸 杂交技术进行分析的方法 本研究选择的是只存在 于结核分枝杆菌复合群基因组中的插入序列IS6110 选择在IS6110序列中只有一个酶切位点的限制性内 切酶Pvu 进行切割 并选择只与Pvu 位点右侧核 苷酸结合的245bp探针进行杂交 使其出现8 25条 带 便于分析 具有相似杂交带型的菌株在某一地理区域成群 分布 在流行病学上往往预示着结核的高度传播 在 发展中国家的研究报告均显示了这一特点 4 6 我 们的研究结果也证实了这一点 地处宁夏较偏僻的 山区的固原 结核流行程度很高 这一地区分离出来 的结核分枝杆菌缺乏多态性 菌株IS6110指纹相似 程度很高 带型上只有微小的差别 有些菌株带型只 相差一条带 属于结核高发区 Van Soolingen用IS1081对 北京家族 型菌进行 亚区分 发现其区别于其他菌株的共同特点是含一个 特有的3 6kb的Pvu 酶切片断 用PGRS和spolig2 otyping对 北京家族 菌株进行亚区分之后 发现其 IS6110带型相似的菌株 在其他基因标记的分型中仍 为相似的带型 认为 北京家族 的菌株组成一个基因 型密切相关的细菌群 3 423 宁夏医学杂志2002年6月第24卷第6期 Ningxia Med J Jun 2002 Vol 24 No 6 本研究采用IS6110 DNA指纹分析的方法对宁 夏固原地区1997 1999年分离的结核分枝杆菌17 例菌株进行了分型 并研究了随机分离的部分北京和 上海的分离株的指纹并与之比较 证明固原分离的结 核分枝杆菌菌株带型相似程度很高 多态性程度较 低 与在北京地区流行的菌株有很大的同源性 其带 型分布特点相似 参考文献 1 Sambrook J Fritsh E F Maniatis T Molecular cloning a laborato2 ry manual M New York Cold Spring Harbor Laboratory 1989 304 325 474 489 2 Van Embden J D M Cave M D Crawford J T et al Strain iden2 tification of Mycobacterium tuberculosis by DNA Fingerprinting recommendations for a standardized methodology J J Clin Microbi2 ol 1993 31 406 409 3 Van Soolingen D Qian L de Hass PE et al Predominance of a Single Genotype of Mycobacterium tuberculosis in Countries of East Asia J J Clin Microbiol 1995 33 3234 3238 4 Gillespie S H Kennedy N Ngowi F I et al Restriction fragment length polymorphism analysis of Mycobacterium tuberculosis isolated from pateients with pulmonary tuberculosis in northern Tanzania J Trans R Soc Trop Med Hyg 1995 89 335 338 5 Yang Z H Mtoni I Chonde M et al DNA fingerprinting and phe2 notyping of Mycobacterium tuberculosis isolatesfrom human immun2 odeficiency virus HIV seropositive and HIV seronegative pa2 tients in Tanzania J J Clin Microbiol 1995 33 1064 1069 6 Hermans P W Messadi F Guebrexabher H et al Analysis of the population structur ofMycobacterium tuberculosis inEthiopia Tunisia and The Netherlands usefulness of DNA typing for global tuberculosis epdemiology J J Infect Dis 1995 171 1504 1513 收稿日期 2002 03 07 责任编辑 马兴忠 文章编号 1001 5949 2002 06 0325 01 电弧光对晶状体损伤1例 杨效群 何 敏 张俊萍 关键词 晶状体 损伤 白内障 中图分类号 R776 1 文献标识码 B 1 患者 男 25岁 电工 于2000年8月27日在工作时 不 慎头面部被电弧光击伤 35 千伏 距电弧光约50cm 当时感 头面部及右上肢皮肤疼痛 双眼畏光 流泪 当天未引起重视 1周后感右眼前黑影 视物模糊 于2000年9月5日来我科就 诊 查体 头面部 颈