焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性的Meta分析.pdf

虫堡捡墅医堂銎壹垫 笙 旦筮 鲞筮 塑竺堕 k 丛型 垒四 些 坠 焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌 异烟肼耐药性的M e t a 分析 郭琪李觉 胡忠义郑瑞娟 摘要 目的采用M e t a 分析方法综合定量评价国内外焦磷酸测序技术快速诊断异烟肼耐药 的诊断价值 方法检索P u b M e d w e bo fs c i e n c e E 1 s e v i e r 中国知识资源总库 c N K I 万方和维普 制定文献纳入排除标准 对纳入文献进行质量评分 提取纳入研究的特征信息 检验异质性并根据其 结果选择相应的效应模型 采用M e t a D i s c l 4 和S t a t a l 0 O 软件进行综合定量分析 最后进行敏感性 分析 结果检索相关文献1 1 4 篇 最后纳入9 篇 将焦磷酸测序与常规测序相比 其结果一致率 1 0 0 以细菌学药敏为金标准 焦磷酸测序检测k a t G 基因时标本总数9 4 5 份 加权敏感度 特异度 及9 5 可信区间分别是o 7 7 0 7 3 0 8 0 1 0 0 0 9 9 1 0 0 s R 0 c 曲线下面积为9 8 8 2 纳入文 献稳定性好 只检测i n h A 基因时的加权敏感度为0 1 9 0 1 5 0 2 4 特异度为1 0 0 o 9 8 1 0 0 结论焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药性有很高的特异度 在异烟肼耐药初筛时具有 很高的临床价值 是药敏检测的有效辅助手段 r 中华检验医学桑 言 2 0 J 3 拍 3 2 9 0 3 2 关键词 序列分析 D N A 分枝杆菌 结核 异烟肼 抗药性 细菌 M e t a 分析 M e t a a n a l y s i so fp y r o s e q u e n c i n gf o r t h er a p i dd e t e c t i o n0 fi s o n i 配i d r 幅i s t a n c ei l I 勿c 0 6 n c 招 妇m 胁6 B r c 比正D 睹G U Dq U w H Uz b 增一y i z H E G 尺撕乒口n P r 咖s s o m Z 矿印i 如m 捌o g yo 删 S 魄如S M e 如8 C o g e T o R 醯U n 泌r s 拓y S h a 粥k i2 0 0 0 9 2 C k M c o r 郡p o 蒯i 昭o b r Z 日E GR u i i 如n E m n 以 z r H 驰 n 9 2 3 J6 3 c o m A b S t m c t O b j e c t i v e T oe v a l u a t e h ea c c u r a c yo fp y r o s e q u e n c i n gf o rt h em u t a t i o nd e t e c t i o no f k a t Gg e n ei ni s o n i a z i dr e s i s t a n c ei n 肘y c 0 6 0 c 把一 mf 如e r c u Z 西u s i n gM e t a a n a l v s i s M e t h o I l s S e a r c h i n g P u b M e d W e bo fS c i e n c e E l s e v i e r a n dC h i n aN a t i o n a lK n o w l e d g eI n f r a s t m c t u r e C N K I W e i p ua n d W A N F A N GD A T At oo b t a i n t h er e l e v a n tE n g l i s ha n dC h i n e s e l a n g u a g ea r t i c l e s r e s p e c t i v e l y Aw d t t e n p r o t o c o la n de x D l i c i ts t u d vs e l e c o nc r i t e r i aw a sf o U o w e d Q u a l i t vo fi n c l u d e dt r i a l sw a sa s s e s s e db yQ U A D A S q u a l i t va s s e s s m e n to fd i a g n o s i ca c c u r a c vs t u d i e s S u b s e q u e n t l y t h ec h a r a c t e s t i c so fc h ei n c l u d e da r t j c l e s w e r ea p p m i s e da n de x t m c t e d H e t e m g e n e i t yo ft h ei n c l u d e da r t i c l e sw a st e s t e db yu s i n gS T A T A1 0 0 w h i c h w a su s e dt os e l e c t p r o p e re f k c tm o d e l T h ef i x e de f f e c t sm o d e lw a sa d o p t e du s i n gM e t a D j s c s o f t w a r e F i n a l l v s e n s i t i v i t ya n a l y s i sw a sp e 0 n n e d R 鼯u I t sT o t a l l v1 1 4r e s e a r c hp a p e r sw e r ec o l l e c t e d a n d9a r t i c l e sw e r es e l e c t e d T h ea c c o r d a n c eb e t w e e np y r o s e q u e n c i n ga n dc o n v e n t i o n a ls e q u e n c i n gr e s u l tw a s 1 0 0 E i g h ts t u d i e sw e r ei n v o l v e di n c l u d i n g9 4 5s p e c i m e n sw b e nk a t Gg e n ew a sd e t e e c e d T h eo v e r a I I s e n s i t i v i t ya n ds p e c i n c i t yw e r e 0 7 7 O 7 3 0 8 0 a n d1 0 0 0 9 9 1 0 0 r e s p e c t i v e l y T h ea r e au n d e r t h e S R O Cw a sO 9 8 8 2 A si n h A 暂e n ew a sd e t e c t e d t h eo v e r a l ls e n s i t i v i t ya n ds p e c i 6 c i t yw e r e0 1 9 0 1 5 0 2 4 a n d1 0 0 0 9 8 1 0 0 T h et e s tw a ss t a b l e C 帅c l 吣i o 璐 0 u rm e t a a n a l y s i sr e v e a l st h a t p y r o s e q u e n c i n gi sah i g h l ys p e c i 6 ct 0 0 lf o rd e t e c t i o nm u t a t i o no fk a t Gg e n eo fi s o n i a z i dr e s i s t a n c e T h i sr e s u h s u g g e s t st h a ti ti su s e f u lf o rs c I e n i n go fi s o n i a z i dr e s i s t a n c ei nd i a g n o s t i ct e s t C i 几 L 0 6 胁d 2 0 J 3 3 6 3 2 9 3 3 2 K e yw o r d s s e q u e n c ea n a l y s i s D N A 彳弘0 6 c e r i m u 6 e r c 如s 蠡 I s o n i a z i d D n l g r e s i s t a n c e b a c t e r i a l M e t a a n a l y s i s D O I 1 0 3 7 6 0 c m aj i s s n 1 0 0 9 9 1 5 8 2 0 1 3 1 4 0 0 9 基金项目 国家十二五重大专项资助项目 2 0 1 2 z x l o 0 0 3 0 0 2 伽8 上海市科委项目资助项目 1 0 4 1 1 9 5 5 1 0 0 l l Z R l 4 3 0 2 0 0 作者单位 2 0 0 0 9 2 上海 同济大学医学院流行病与卫生统计学专业 郭琪 同济大学医学院预防医学教研室 李觉 同济大学附属上海市肺科医院上海市结核病 肺 重点实验室 胡忠义 郑瑞娟 通信作者 郑瑞娟 电子信箱 z h n I 讪a n 9 2 3 1 6 3 c o m 3 2 9 论著 万方数据 虫堡捡坠匡堂盘查 Q 生垒旦笠 鲞筮 塑 也 堕 竖型 垒P 巫 堑 型 堡 结核病一直是全球关注的重大公共卫生问题之 一 据W H O2 0 1 1 年全球结核控制 报告显示 2 0 1 0 年结核新发病人数达8 8 0 万 患病人数达 1 2 0 0 万 其中耐多药结核病占6 5 万 耐多药结核 病是结核病中最严重的类型 快速有效的结核菌耐 药性检测能够及时提供药敏结果 指导临床医生合 理用药 对耐药结核病的防治有重要意义 目前利用耐药基因进行结核耐药性检测的方法 很多 如基因芯片 线性探针 聚合酶链反应 单链构 象多态性等 在这些方法中以测序为分子药敏检测 的金标准 焦磷酸测序技术是一种新型的依靠生物 发光进行的实时D N A 测序技术旧J 近年来 众多学 者也将这项技术用于结核耐药性检测 异烟肼作为 结核治疗的主要一线药物被广泛研究 但对于焦磷 酸测序技术进行快速诊断的敏感度和特异度 文献 报道结果不一致 因此本文采用M e t a 分析的方法 汇总国内外运用此技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐 药的研究结果 以综合定量评价焦磷酸测序技术快 速诊断异烟肼耐药的诊断价值 材料与方法 一 材料 1 资料来源与筛选 外文数据库选用P u b M e d w e bo fS c i e n c e E l s e v i e r 检索词用 t u b e r c u l o s i s 吻c 0 6 n c 把r i u m M 6 e r c f o s 括 p y r o s e q u e n c i n g 中 文数据库选用中国知识资源总库 万方数据资源系 统和维普中国科技期刊 全文库 检索词用 结 核 肺结核 焦磷酸测序 焦磷酸测序技 术 检索所有数据库从收录年份到2 0 1 2 年3 月的 所有文献 采用网上检索及手工检索相结合的方法 以避免漏查文献 并对所检索文献中提供的参考文 献进行二次检索 2 纳入标准 1 用焦磷酸测序技术进行结核 耐药基因的检测 2 对耐异烟肼样本耐药基因进 行检测 包括检测k a t G i n h A 和a h p C 等基因 3 有 对照药敏 包括细菌学药敏 绝对浓度法 比例法和 B A C T E C9 6 0 药敏检测法 或有常规测序 D N A 直 接测序法 S a n g e r 直接测序法 结果 4 文献中均 有明确数据可进行敏感度和特异度的计算 5 检 测临床分离株或临床样本都被纳人 由两位研究者 分别对所检索的文献进行筛选 不同意见时经讨论 解决 有疑问的文献与作者进行沟通以获取更详细 的数据 二 方法 1 质量评价 用诊断类文献的质量评价 Q u a l i t yA s s e s s m e n to fD i a g n o s t i cA c c u r a c yS t u d i e s Q U A D A S 标准评价文献质量 2 数据提取 提取文献信息 包括研究作者 发 表时间 研究国家 样本例数 研究方法 所采用金标 准及是否使用盲法 并计算出其敏感度和特异度 三 统计学分析 1 异质性检验 采用Q 检验 Q 服从于自由度 为k 1 的矿分布 k 为纳入的研究个数 若Q 疋 则P d 仅 o 1 表明纳人研究间的效应量 存在异质性 则选择随机效应模型进行M e t a 分析 反之 若Q 仅 表明纳入研究间的效应 量不存在异质性 即具有同质性 则选择固定效应 模型 2 M e t a 分析及建立汇总受试者工作特征曲线 s u m m a r y r e c e i v e r o p e r a t o r c h a r a c t e r i s t i c c u n r e s R O C 按照相应的效应模型 用M e t a D i s c l 4 绘制 汇总敏感度和特异度的森林图及计算阳性 阴性似 然比和诊断优势比 d i a g n o s t i co d d sm t i o D O R 绘 制s R O C 曲线并计算其曲线下面积 A u C A u c 值 越接近于l 说明该方法的诊断真实度越高 3 敏感性分析 将结果差别较大的文献排除 后 重新进行M e t a 分析 所得结果与未排除前的结 果进行比较 若敏感度 特异度的结果变化不大 说 明纳入文献的稳定性好 结果较可信 反之 纳入文 献的稳定性差 在解释结果和下结论时应非常慎重 结果 一 文献检索 通过6 个数据库的检索 共检索出文献1 1 4 篇 排除重复文献5 4 篇和介绍焦磷酸测序检测方法及 未检测结核耐药基因的文献4 l 篇 剩下1 9 篇文献 是应用焦磷酸测序技术检测结核耐药基因 检测异 烟肼耐药基因的有9 篇 其中检测k a t G 基因的有 8 篇 英文文献6 篇 中文文献2 篇 二 数据提取及质量分析 9 篇研究中有8 篇研究检测k a t G 基因 检测标 本总数为1 1 1 6 份 其中耐药标本6 3 7 份 敏感标本 4 7 9 份 3 篇研究检测i n h A 基因 检测标本5 7 2 份 其中耐药3 4 5 份 敏感2 2 7 份 检测a h p C 基因只有 1 篇研究 检测总标本1 7 1 份 其中耐药4 5 份 敏感 1 2 6 份 只有2 篇文献检测标本既有临床分离株 又有临床标本 其余文献均只采用临床分离株进行 耐药检测 所纳入文献均未采用盲法 纳入文献的 万方数据 史堡捡墼匡堂盘查垫 生 旦箜堑鲞筮兰塑垦 鱼 丛堕型 垒E 型垫 坠 堑 坠兰 3 3 质量均较高 表1 为纳入文献的详细信息 三 M e t a 分析 1 与常规测序比较 以常规测序为金标准评价 焦磷酸测序技术快速检测基因突变的敏感度和特异 度时 有5 篇 9 删研究被纳入 所有用焦磷酸测 序的数据与常规测序结果均完全一致 故汇总加权 后 其检测结核分枝杆菌耐药基因突变的总敏感度 即为1 0 0 O 9 8 1 0 0 特异度为1 0 0 0 9 9 1 0 0 2 焦磷酸测序检测k a t G 耐药基因与细菌学药 敏比较 以细菌学检测为金标准时 当焦磷酸测序技 术只检测k a t G 基因突变时 有8 篇文献被纳人 对 纳入研究进行异质性检验 3 9 8 自由度 d f 7 P O 7 8 2 0 1 0 在d O 1 0 水准不拒绝同质性 假设 表明纳入研究问的效应量不存在异质性 应选 择固定效应模型进行加权定量合并 汇总加权后 焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼耐药 k a t G 基因突变的敏感度为0 7 7 0 7 3 0 8 0 特异 度为1 0 0 O 9 9 1 0 0 建立S R O C 曲线 如图l 所示 曲线下面积 A U C 为0 9 8 8 2 阳性似然比及 9 5 a 为6 2 0 4 2 2 9 8 1 6 7 5 0 阴性似然比及 9 5 C 为0 2 5 0 2 l 0 2 9 合并D O R 及9 5 c 为2 1 2 3 7 7 6 7 7 5 8 7 4 9 8 篇纳入的研究中 有1 篇 文献的敏感度 5 4 1 明显低于其他文献敏感度值 将此文献排 除后重新进行分析 见表2 文献 1 中未明确指出 有k a t G 基因突变的样本例数 故此敏感度为检测 k a t G 和i n h A 基因时的敏感度 将此文献也排除后重 新进行分析 表2 结果显示汇总敏感度和特异度 未见明显改变 说明纳入文献的稳定性好 3 焦磷酸测序检测i n h A 耐药基因与细菌学药 敏比较 有3 篇 2 9 J 钊文献采用焦磷酸测序技术检测 异烟肼耐药的i n h A 基因 汇总这3 篇研究的结果为 检测结核分枝杆菌异烟肼耐药i n h A 基因的敏感度 为0 1 9 0 1 5 0 2 4 特异度为1 0 0 0 9 8 1 0 0 注 每个黑色圆点代表每个研究数据对应的灵敏度和 l 一特异度值 A u c a r e au n d e rt h ec u r v e 为曲线下面积 A u C 越接近于l 说明诊断效果越好 图l 焦磷酸测序技术检测异烟肼耐药k a t G 基因汇总 R 0 c 曲线 讨论 本研究共纳入9 篇文献 采用M e t a 分析的方 法 综合定量评价焦磷酸测序技术检测结核分枝杆 菌异烟肼耐药性的诊断价值 焦磷酸测序技术是一项全新的短片段D N A 测 序技术 可以快速 准确地测定一段较短的D N A 片 段 其检测精确性能与传统的S a n g e r 测序法相 当 5 MJ 本研究以常规测序为金标准评价焦磷酸 测序技术快速检测基因突变的敏感度和特异度 从 研究结果来看 焦磷酸测序检测结果与常规测序结 果符合率达1 0 0 表明焦磷酸测序技术进行微测 序分析 准确性极高 可以用于结核分枝杆菌耐药相 表1 纳入文献的详细信息 注 3 为文献只检测i n h A 基因 c c 表示病例对照研究 c s 表示横断面研究 u n k n o 一为文献未明确指出研究类型 万方数据 空堡捡鉴匿堂盘查 Q j 生堡旦笙堑鲞箜堡塑 也 生丛型 垒匝 垫 堑 盟 兰 表2 排除结果异常的研究后Q 值及异质性分析和汇总敏感度及特异度 纳入文献异质性分析 敏感度 9 5 c 特异度 9 5 c 一y 2 值J D 值 全部文献同质性 7 7 7 3 8 01 0 09 8 1 0 03 9 8 O 7 8 2 排除 3 1 同质性 7 9 7 5 8 21 0 09 9 1 0 02 9 0 o 8 2 l 排除 3 1 和 9 1 同质性 7 9 7 5 8 31 0 09 9 1 0 0 2 8 5 O 7 2 3 关基因点突变的检测 与常规测序法相比 焦磷酸 测序技术还具有操作简单 通量高 可同时进行9 6 3 8 4 个测序反应 检测成本低b 1 等优点 而且由于 结核分枝杆菌的各耐药基因具有突变位点集中 但 突变形式多样的特点 故只需对突变热点的特定短 片段进行测序即可获得结核分枝杆菌的药敏结果 无需对整个基因进行测定 焦磷酸测序技术对这种 短片段突变分析具有独特的优势 研究结果同时显示 以细菌学检测为金标准 焦 磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼k a t G 基因 的特异度为1 0 0 合并D O R 及9 5 口为2 1 2 3 7 7 6 7 7 5 8 7 4 9 s R O C 曲线综合分析显示A u c 0 9 8 8 2 阳性似然比及9 5 c 为6 2 0 4 2 2 9 8 1 6 7 5 0 检测结核分枝杆菌异烟肼耐药i n h A 基因 的特异度为1 0 0 0 9 8 1 0 0 这些结果都提示焦 磷酸测序技术检测异烟肼耐药具有很高的特异性 可以作为异烟肼耐药的初筛工具 焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌异烟肼 k a t G 基因的敏感度为7 7 阴性似然比及9 5 c 为0 2 5 0 2 l 0 2 9 即仅检测k a t G 耐药基因时测 序方法的敏感度较低 而较低的敏感度由菌株本身 耐药基因决定 随着分子生物学理论和技术的发 展 结核分枝杆菌的耐药分子机制部分已被阐明 异 烟肼耐药涉及多个基因 包括k a t G i n h A k a s A 以及 a l l p c 等 1 与k a t G 基因突变的关联最强 国内外 研究报道表明 在耐异烟肼菌株中约6 0 7 0 与 k a t G 基因突变有关 2 0 3 5 与i n h A 基因调节区 突变有关 2 本研究系统评价的敏感度与文献报 道的该基因的突变率一致 说明焦磷酸测序方法检 测基因突变的准确性极高 因此从本系统评价来 看 研究者可根据需要 进一步增加检测的耐药基因 数目如i n h A a p h c 基因来提高异烟肼耐药性检测 的敏感度 对i I l l l A 基因突变的检测由于文献数较 少 因此单篇研究结果对汇总敏感度特异度的结果 影响较大 文献 2 检测i n h A 突变率低的原因可 能是所检测临床分离株来源于结核发病率低的地 区 本文对样本来源进行分组分析 结果显示在亚 洲检测k a t G 突变敏感度低于欧洲国家 可能由于地 区不同 结核菌株突变率也不同 本系统评价纳入的研究中有2 个研究H 9 1 将该 检测方法既用于临床菌株又用于临床标本 研究结 果显示在临床标本中检测异烟肼耐药的特异度仍为 1 0 0 进一步说明焦磷酸测序技术检测异烟肼耐药 的高特异性 也提示将测序技术直接用于l 临床标本 的可行性 综上所述 焦磷酸测序技术通过检测k a t G 基因 突变检测异烟肼耐药具有较高的特异度 在异烟肼 耐药初筛时具有很高的临床价值 通过增加检测耐 药基因的数目 可进一步提高检测的敏感度 是结核 分枝杆菌快速药敏检测的有效辅助手段 参考文献 llJw H 0 G l o b a lt u b e r c u l o s i sc o n t r o l W H 0r e p o n 2 0 11 2 G a 瑚一c o n z d l e zE G 0 n z d l e zG M R e n t e r i a A e ta 1 A p y r o s 8 q u e n c i n gm e t h o df hm o e c u J a rm o n i t o r i go f 诧矛o n si nt h e i I l 1 A a l I p Ca n dr p o Bg e n e so f 蜘6 t e m n k r c H Z 吣讧 C l i n M i c m b i o l1 n k t 2 0 l O 1 6 6 0 7 击1 2 3 王琰 耐药结核分枝杆菌基因突变热点筛查与检测技术平台 的建立 重庆 第四军医大学 2 0 0 4 4 A m o l dc w e s t l 柚d L M o w a tG e ta 1 s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m 伽p h i s m b a s e dd i f f e r e n t i a t i o na n dd m gr e s i s t a n c ed e t e c t i o n i nM y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i sf m mi s o l a t e s0 rd i r e c t l yf m m s p u l u m C l i nM i c r o b i o l I n f t 2 0 0 5 l l 1 2 2 一1 3 0 5 z h a 0J R B a iY J w a I l gY e t a 1 D e v e l o p m e n t 0 f a p y m s e q u e n c i n ga p p m a c hf o r 阳p i ds c r e e n i g0 fr i f 抽p i n i s o n i 船i d a n de t I l 帅b u t o l r e s i s t a n t 肘 k D 曲病H m 越帅u 如矗 I n tJ7 r u b e r c L u n gD i s 2 0 0 5 9 3 2 8 3 3 2 6 B r a v oL T T u o h yM J A n gc e ta 1 P y r o s e q u e n c i n gf o rr a p i d d e t e c t i o no f 朋如6 c 把 mt 训k r c 以珊括r e s i s t a n c e t or i f 抽p i n i 涮商d 册d 凸咖l l i 蒯删惜 Ja j n c 阳b 0 J 彻9 钾 3 9 8 5 3 9 9 0 7 M 州t i l a M 如n e nJ M 商枷a k iM e ta 1 P m s p e c t i v e e v a l u a t i o n0 fp y m 8 e q u e n c i n gf o rt h er a p i dd e t e c t i o n0 fi s o n i a z i d a n dr i f 砌p i nr e s i s t 加c ei nc l i n i c a l 朋如曲n c 钯而n m l 西e r c 以珊括 i s o l a l e s E u rJC l i nM i c m b i o lI n 舭tD i s 2 0 0 9 2 8 3 3 3 8 8 郑瑞娟 秦莲花 周燕 等 焦磷酸测序技术检测结核分枝杆 菌四种药物耐药性 中华检验医学杂志 2 0 ll 3 4 11 5 一1 2 0 9 c a T c f a s i e mN L a c o m aA P r a tc e ta 1 P y m 踟q u e n c i n gf o r m p i dm o l e c I l l a rd e t e c t i o n0 fr i f a m p i na n di s o n i a z i dr e s i s t a J l c ei n 朋 妣 u ml u 6 e r c 以o s 函s t r a i n sa n dc l i n i c a ls p e c i m e n s Jc l i n M i c m b i o l 2 0 l l 4 9 3 6 8 3 3 6 8 6 1 0 E n g s t r 6 mA M o r c i u oN l m p e r i a l eB e ta 1 D e t e c t i o no f6 r s t a n ds e c o n d l i n ed gr e s i s t a n c ei n 肘扣o Gonz 1ez GM Renter a A Apyrosequencing method for molecular monitoring of regions in the inhA ahpC and rpoB genes of Mycoba