结核分枝杆菌环介导恒温扩增.pdf

基金项目 北京市科技新星计划 中 法梅里埃基金会结核病防治项目 论著 结核分枝杆菌环介导恒温扩增 快速检测方法的评价 戴广明 曹以诚 杜正平 陈洵 黄曙海 逄宇 周杨 黄海荣 赵雁林 北京结核病胸部肿瘤研究所 北京 华南理工大学 广州 广西疾病预防控制中心 南宁 摘要 目的对国内建立的结核分枝杆菌 环介导恒温扩增 快速检测方法进行了介绍和评价 方法 实验菌株来源于北京结核病胸部肿瘤 研究所 以结核分枝杆菌作为研究对象 设计了 条 引物特异地识别结核分枝杆菌中 基因的 个特殊区域 所有的菌株样本提取 作为模板 加入 反应管后 恒温反应 即可 其结果可以通过肉眼观察到的颜色变化来判断 结果 实验共验证了 株临床和标 准菌株 对于菌株的培养物 实验的灵敏度为 特异度为 结论 结核分枝杆菌 快速检测方法是一种快速 可靠的结核分枝杆菌诊断方法 关键词 分枝杆菌 结核 核酸扩增技术 通讯作者 赵雁林 年 月 第 卷 第 期 细菌学检查是发现结核病传染源的主要途径和 手段 是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据 但由于敏感性低或所需时间过长等原因 致使结核 病细菌学检查一直不能满足临床诊治的需求 存在 延误诊断和误诊情况 同时也耽误了患者得到及时 治疗的时间 影响了治疗效果 也使得疾病的传播难 于控制 因此 缺乏早期 准确和廉价的诊断技术是 制约全球结核病控制的严重障碍 近 年 发 展 起 来 的 环 介 导 等 温 扩 增 技 术 完全突破了传统分子生物学检测技术需 要昂贵仪器设备以及繁杂操作的限制 给分子生物 学诊断技术的廉价普及带来了希望 该方法最初是 由 等 设计来用于病原微生物的检测 技 术的工作原理是利用 条不同的特异性引物识别靶 基因的 个特定区段 在等温条件下进行扩增反 应 基因的扩增和产物的检测可一步完成 扩增效 率高 可在 扩增 倍 所有靶 基因序列的检测可只通过扩增产物的有 无来判别 结果的判断很简单 主要有以下两种方式 反应 结束后直接在紫外灯光下判读有无扩增反应产物形 成 核酸大量合成时 从 析出的焦磷酸根 离子与反应溶液中的 结合 产生副产物焦磷 酸镁沉淀 应用浊度仪检测沉淀浊度来判定 由 于方法简单易行 即使是没有分子生物学实验经验 的技术人员也只需 周的训练就可掌握 本文对国内建立的结核分枝杆菌环介导恒温扩 增 快速检测方法进行了介绍和评价 结果 如下 材料和方法 材料 菌种 本室保存的 株分枝杆菌标准菌 株 株临床结核分枝杆菌 结核分枝杆菌 法 基因快速检测试 剂盒 以下简称 检测试剂盒 由我们和华南 理工大学共同研发 基因组 纯化试剂盒 购自 公司 方法 检测目标菌株和靶标引物 结核分枝杆菌 基因快速检测方法的目标菌株确定为结核分枝杆菌 复合群 包括结核分枝杆菌 牛结核分枝杆菌 非洲 结核分枝杆菌 和田鼠结 核分枝杆菌 根据相关文 献报道 和预实验 靶标确定为编码 解旋酶 亚基的 基因 通过序列分析获得保守区域设 计引物 图 内引物为 和 外引物为 和 引物设计软件为华南理工大学开发的 引物设计专用软件 引物序列为 和 模板制备 取对数生长期的分枝杆菌 标准菌株和临床结核分枝杆菌 用灭菌蒸馏水分别 悬浮于 离心管中高温灭菌后 离 心 取上清液转移至另一离心管中作为粗制模 板 或将上清液和细胞沉淀用基因组 纯化试剂盒 提取 基因组 作为精制的模板 扩增反应 结核分枝杆菌 法 基因快速检测试剂盒包括 支 反应管 和阳性标准管 阴性标准管各 支 每支 反 图 目标菌 基因序列高度一致的保守区域 红框中是引物识别靶基因的 个特定区段 年 月 第 卷 第 期 图 反应结果 绿色的是有发生特异性扩增的阳性管 橙色的为阴性管 应管为 个 反应体系 分为大小 个腔 大 腔含有 引物 引 物 引 物 引 物 溶液 溶液 聚合酶 溶液 小腔含 核酸染料 最 后上面覆盖一层石蜡油 以防止污染 阳性 标准为卡介苗核酸溶液 阴性标准为样品处理液 将粗制模板 或精制模板 加 入 反应管的大腔底部 置 恒温反应 即可 每次反应都应加阴性标准模版 阳性标准模版 作为对照 扩增反应 在 反应体系中 进行扩增反应 含有 缓冲液 上下游引物 各 聚 合 酶 及 模板 在 扩增仪上 预变 性 后 进 行 次 下 述 循 环 和 延伸 最后 取 扩增产物 在 琼脂糖凝胶 其中 含 溴乙锭 中进行电泳 时间为 电 泳完毕 用读胶仪拍照 并用标准 进行带型大小比较结果判定 结核杆菌 基因组 稀释实验 取结核杆菌 培养物作为原液 用灭菌蒸馏水 悬浮于 离心管 高温灭菌后 用纯化试剂盒 提取基因组 作为底液作 倍梯度稀释 共稀释 个梯度 然 后以其做模版进行 检测 重复对照实验 分别由本室实验员和华南 理工大学实验员对相同的样品进行重复对照测试 结果判断 取出反应管 冷却至室温 颠倒 反应管 使大小腔反应物混匀 其结果可以 通过肉眼观察到的颜色变化来判断 颜色立即变绿 的是有发生特异性扩增的阳性管 变橙色的为阴性 管 若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符 则 本次检测结果无效 应重新检测 结果 反应的灵敏度和特异性试验 取本室 保存分枝杆菌 株标准菌株和 株临床结核分枝 杆菌的 模板进行 反应 结果如表 和 图 所示 从图 可以看到 颜色立即变绿的是发 生特异性扩增的阳性管 变橙色的为阴性管 在相 同反应条件下 方法能迅速的检测出结核杆 菌复合群 包括结核分枝杆菌 牛分枝杆菌 非洲分 枝杆菌 和田鼠分枝杆菌 华南理工大学的检测结 果为 株菌为阳性 株菌为阴性 其中溃疡分枝 杆菌 和鸟分枝杆菌 不属 于结核分枝杆菌复合群的菌株也为阳性 以实验菌 株培养和 测序结果作为金标 从表 可 计算得出特异度为 灵敏度为 北 京结研所的检测结果为 株菌为阳性 株菌为 阴性 其中耻垢分枝杆菌 副偶发分 枝杆菌 和不产色分枝杆菌 不属于结核杆菌复合群的菌株 也为阳性 从表 可计算得出特异度为 灵 敏度为 扩增和金标的结果相同 都 是 株菌为阳性 株菌为阴性 表 实验菌株 扩增和 检测结果 检测结果 扩增 华南理工结研所 扩增 金标 阳性 阴性 合计 所示金标结果为实验菌株经培养和 测序所得的结果 表 华南理工大学 检测结果 检测结果 金标结果 阳性阴性 合计 阳性 阴性 合计 特异度为 灵敏度为 年 月 第 卷 第 期 表 北京结研所检测结果 检测结果 金标结果 阳性阴性 合计 阳性 阴性 合计 特异度为 灵敏度为 反应最低检出限的计算 将结核杆菌 提 取 基 因 组 并 稀 释 个 梯 度 用 检测试剂盒进行检测 结果第 到第 个梯 度的稀释液为阳性 其余梯度都为阴性 表 结 核杆菌 基因组 原液经紫外分光光度计 定量为 从 查结核杆菌基因组大 约为 最后计算得出每个 反应体系 最低检出限为 个拷贝 表 结核杆菌 基因组 稀释液 方法检测结果 稀释倍数 阳性对照空白对照 结果 为阳性 为阴性 讨论 从 技术的原理和以上检测结果来看 方法的灵敏度同现在广泛应用的 方法 一致 能完全满足目前结核分枝杆菌检测的需要 每个 反应体系最低检出限可达到 个拷贝 这一点要优于 方法 结核分枝杆菌 法 基因快速检测试剂盒的目标菌株为结核分枝杆 菌复合群 而我们的检测结果中溃疡分枝杆菌 鸟分枝杆菌 耻垢分枝杆菌 副偶发分枝杆菌 和不产色分枝杆菌 都 不属于结核分枝杆菌复合群的菌株也为阳性 这些 实验结果说明 检测试剂盒可稳定检出目标 菌 但部分非目标菌存在不确定的干扰 该方法对 非目标菌存在的不确定干扰从序列上分析是不存在 的 我 们 用 的 外 引 物 作为上下游引物 常规 扩增目的 片段 结果发现 实验结果与培养和 测 序所得的结果一致 据此可确定 溃疡分枝杆菌 等 株菌的检测结果为假阳性 假阳性的产生有很多原因 国内也有类似文献 报道 因北京结研所和华南理工大学的实验室都 要常规进行分子生物学实验 交叉污染的可能 性较大 故推测影响本实验特异性结果的因素很可 能为模板的污染问题 实验者可以通过规范的操作 和特殊处理来减少污染的机会 比如隔离混合反应 液和检测结果的房间 经常进行实验工具和实验台 的 清 洗 和 加 入 偶 联 尿 嘧 啶 糖 苷 酶 来防止扩增产物的污染 目前的 技术具有很多优点 恒温扩 增 不需特殊试剂 不需预先双链 变性 高 特异性 应用 个区段 种引物进行扩增 快 速 高效扩增 整个扩增在 内即可完成 且产率 可达到 使用环状引物可以在现有的基 础上缩短 的时间 不需要昂贵的仪 器设备 检测方法简单 结果判定直接 该方法的 特点和优势可以使之在基层实验室及现场监测方面 广泛使用 在快速检测方面具有光明的应用前景 因此自 技术发明以来 其被广泛的应用于病 原体基因检测等领域 国外的结核分枝杆菌 快速检测试剂试用结果表明 该方法 对痰涂 片 和 痰培 养 都 阳性标 本 的 检 测 灵 敏 度 为 而对于涂片阴性但培养阳性标本的灵敏度 为 对培养阴性的标本特异性为 目 前 国外此类 快速检测试剂尚未在国内销 售 而且观察实验结果需要价格高昂的配套设备 不 适于在广大基层实验室开展 为此 我们开发了具 有自主版权的 引物设计软件 提高了设计效 率和引物成功率 而且通过 反应管的专利 设计 彻底解决了 气溶胶 干扰 实现核酸扩增后 不开盖判读检测结果 有效避免了交叉污染 因为该方法主要应用于基层实验室的结核杆菌 诊断 所以适用性是关系到该技术能否被广大基层 医务工作者接受的关键因素之一 从目前试用情况 来看 我们建立的结核分枝杆菌 快速检测方 法将操作者的操作步骤降到最少 交叉污染的可能 性也降到了很低水平 而且具有所需设备简单 操作 容易 价格低廉等优势 因此 技术的应用 将会大幅度提高结核病患者的发现率 并将对我国 结核病控制工作的顺利进行提供有力的保障 年 月 第 卷 第 期 参考文献 黄帆 李琳 林世平 梅国华 山崎伸二 石磊 环介导恒温 扩增技术速检测结核分枝杆菌的研究 现代食品科技 李 启 明 侯 云 德 逆 转 录 环 介 导 等 温 核 酸 扩 增 技 术 在 禽流感病毒基因检测中的应用 病毒学 报 收稿日期 本文编辑 张晓进 短篇论著 例不典型肺结核误诊分析 韦堆库 王芳兰 甘肃省张家川回族自治县第一人民医院 肺结核目前在全球仍是最严重的呼吸系统传染 性疾病 典型