「大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代」.doc

大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养及传代南京军区总院神经内科实验室 许丽丽 2012-12-01一、试剂1) Poly-L-lysine（Sigma,P2636）2) DMEM（Invitrogen,11995-065）3) FBS（Invitroge,10099-141）仅供参考！4) HBSS, no Calcium, no Magnesium（Invitrogen, 14170-112）5) 0.25% Trypsin-EDTA （Invitrogen, 25200-056）6) DPBS（HyClone，SH30028.01B）7) dd H2O8) 75酒精二、器械1) 手术器械：眼科剪x2、眼科镊直、弯各x2、显微镊x2（金钟，WA3050）、显微剪x12) 100 ml小烧杯3) 200目不锈钢筛4) 细胞计数器（求精）5) 50ml离心管（Corning，430828）、15ml离心管（Corning，430790）6) 25ml培养瓶（Corning，430639）或75ml培养瓶（Corning，430641）7) 100ml玻璃瓶（蜀牛）8) 直径为60mm的培养皿（LabServ,310109010）9) 3ml移液管（Biologix, 30-0138A1）10) 过滤器（Millex-GP, SLGP033RB）11) 注射器：50ml、5ml各 112) Pipette and pipette tips13) 冰袋、手套、口罩Day 11、消毒1.1 将解剖器械、枪头高温高压消毒15分钟，消毒结束后放入烘箱中烘干待第二天使用。1.2 打开操作台紫外线灯消毒30分钟。2、包被培养板2.1 戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。2.2 取PLL，用DPBS将其稀释至100g/ml。2.3 以PLL包被培养瓶，量以覆盖培养瓶底面为宜。25ml培养瓶：3ml；75ml培养瓶：8ml。过夜。3、配置培养基、消化酶3.1 DMEM with 10% FBSFBS：DMEM=1：10取FBS 8ml、DMEM 80ml加入100ml高温高压过的玻璃瓶中。3.2 0.125胰酶取0.25Trypsin-EDTA,用DPBS稀释2倍。将配置好的培养基、消化酶放入4C冰箱中，待第二天使用。4、消毒操作台使用完毕后清理垃圾，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。Day 21、消毒打开操作台紫外线灯消毒30分钟。2、洗板用ddH2O洗涤3 x 5 min，放入培养箱中晾干。3、解剖新生鼠（所有操作在冰袋上进行）3.1 将出生24小时之内的新生鼠在100ml烧杯中用75%酒精浸泡5min。3.2戴手套，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，点燃酒精灯。3.3 取2个培养皿，内乘HBSS，放置在冰袋上。3.4 剪去新生鼠的头，将头放入一个培养皿中。3.5 用眼科剪把新生鼠头骨剪开，取出脑组织，将脑组织放入另一乘HBSS的培养皿中（将所有的新生鼠都同样处理）。3.6 用两支显微镊分离脑膜，尽可能的去掉所有的血管和血管膜，将分离好的脑组织放入另一新的内乘HBSS的培养皿中。3.7 将分离好的脑膜用显微剪剪碎脑组织，约1mm3。4、接种细胞4.1 用移液管将剪碎的脑组织移入两个15 ml离心管中。4.2 每支离心管加入3 ml 0.125胰酶，摇匀，37消化15分钟（为增加接触面积消化更充分可将离心管平放，也可以用60 mm培养皿消化。）4.3 消化期间整理操作台。4.4 消化15min后，用移液管除去胰酶，每支离心管加入2 ml 10 FBS/DMEM终止消化。4.5 吹打：用1 ml枪头，吹打40次，静止2分钟，将上面液体移入一新的15ml离心管中。下面沉淀的细胞团块不要丢弃，加入1-1.5ml10 FBS/DMEM吹打20次，重复上面的步骤。一共这样分次吹打3次。3次之后如果还有团块在下面，果断丢弃。（吹打时候要注意，切忌过快，要缓慢吹打。吸入时候要很缓慢，吹出的时候可以略快，但是也要缓慢。）4.6 过筛网至60 mm培养皿中。4.7 将培养皿中液体移入2支15 ml离心管中。4.8 离心：800g/min,5min。4.9 弃上清，沉淀的细胞加10FBS/DMEM 3ml重悬，轻柔吹打100次（具体吹打次数据细胞计数时看到的情况而定，若看到大量细胞团，应加大吹打次数）。4.10 用细胞计数板计数：细胞浓度 = (4个大格细胞总数/4) 104 /ml4.11 调浓度，接种。接种后摇晃培养板摇匀细胞（注意不要圈圈摇晃，圈圈摇晃会导致神经元都集中到培养板的孔中间，导致浓度不均，生长不均匀。要左右平行翻转角度，然后前后平行翻转角度）。具体细胞接种数值：培养液体积（ml/瓶）细胞密度（个/ml）总细胞数（个/瓶）25cm2培养瓶4ml1x1064x10675 cm2培养瓶15ml1x1066-8x1065、消毒实验结束后清理垃圾，清洗器械，用酒精棉球擦拭操作台、移液枪，关闭酒精灯，打开紫外线灯消毒30分钟。6、换液细胞种植成功后24小时全量换液，以后每天观察细胞生长状态，每 3天半量换液。注意：换液前要将10%FBS/DMEM放入37细胞培养箱中预热半小时。7、传代7.1待细胞长到第10天或看到细胞细胞爬满培养瓶的90%左右时，在37恒温摇床200g/min震荡12-14小时，全量换液。7.2震荡过后，弃培养基，DPBS洗涤2-3次，加入适量0.25%胰酶，37消化1-3min（以镜下看到细胞突触回缩为最佳）。7.3加入2ml培养基中和胰酶，用移液管轻轻吹打细胞壁，使贴壁细胞脱落。7.4将培养基移入15ml离心管中，200g/min离心5min，弃上清。7.5加入新的培养基