「乙肝病毒特性与致病机理研究进展」.doc

乙肝病毒特性与致病机理研究进展王晓冬，王峰，吕月蒙，李强，张国峰，孙涛，贾亚雄 甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州（730070） E-mail：摘要：乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)是引起中国及东南亚一带病毒性肝炎的主要病原之一，有半数以上HBV感染的患者将会发展为慢性肝炎(Chronic Hepatitis, CH)、肝硬化(Liver Cirrhosis, LC)，甚至肝细胞性1fl癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC )，常被形象的称之为“慢性肝病三步曲”。新近有多项研究表明活化的T细胞反应可能在HBV感染的慢性化和肝细胞损伤过程中起重要作用。CD4+Th细胞可分为Thl和Th2细胞，分别介导两种不同的免疫学效应。Thl细胞主要分泌IL-2, IFN- X和肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子，参与细胞免疫应答;Th2细胞主要分泌IL-4, IL-5, IL-6和IL-10等细胞因子，参与体液免疫应答;Thl/Th2的平衡决定了免疫应答的有效性和安全性。Thl与Th2之间存在相互制约或促进左右，细胞因子组成一个复杂的分子网络，参与调节炎症反应以及器官功能的自我稳定。关键词：细胞因子，乙型肝炎病毒，细胞毒性T淋巴细胞 1.引言乙型病毒性肝炎（hepatitis B, HB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）引起的。HBV的感染不仅可以导致急、慢性病毒性肝炎和重性肝炎，而且还与肝硬化（liver cirrhosis, LC）和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发生、发展密切相关。20的慢性乙肝患者将发展成为肝硬化，HBV慢性感染的人罹患HCC的危险性是正常人的100倍。HBV感染呈世界性分布，其中西欧、北美、澳大利亚为低流行区，乙性肝炎病毒表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg）携带率在2以下；东欧、日本、南美、北美和地中海国家为中流行区；中国、东南亚与南非为高流行区（HBsAg 携带率10左右）。全世界共有约3.5亿人为HBsAg慢性携带者，其中3/4在亚洲。HBV感染导致全球每年50120万人死亡，其中死于HCC的约占32万。我国是HBV感染的高发区，约60的人群感染过HBV，10的人群为携带者，多达1.2亿。现有乙型肝炎患者约为1200万，年发病率为158/10万1-4。随着HBV疫苗在1982年的问世，HBV感染率大大降低，抗病毒药物的出现也使乙型肝炎的治疗取得了一定的进展。但是，乙型肝炎的现状仍然不容乐观，现有乙型肝炎患者及带毒者数量庞大，面临发展为肝硬化和肝癌的危险，不幸的是，到目前为止，还没有针对HBV的特效药物。因此，乙型肝炎的治疗至少在今后50年内仍然是一个严重的问题，寻找更有效的治疗途径是医学研究的重大课题。2.HBV的生物学特性2.1 HBV的生物学分类1986年国际病毒革命委员会正式将人类HBV划归为一个新的病毒科嗜肝DNA病毒科（Hepadnaviridae）的成员。该科病毒成员除了人HBV外还有：（1）东方土拨鼠肝炎病毒（GHV），1978年在美国新泽西州和马里兰州等地的野生土拨鼠发现该病毒。东方土拨鼠肝炎和肝癌的发病率较高；（2）地松鼠肝炎病毒（GHV），是1980年在美国南加州的地松鼠中发现的；（3）鸭乙型肝炎病毒（DHBV），1981年在我国江苏省启东县肝癌高发区分离自易发生肝癌的麻鸭，后来在北京能够鸭和美国商品鸭中也发现此病毒5-6。 2.2 HBV的形态与结构 -1- HBV在动物病毒中是不寻常的，是由于在被浸染的细胞中能产生多类型的与病毒相关的颗粒，电镜下观察HBV的提纯制品，证明有三种类型颗粒7-9。 1.小球型颗粒 平均直径为22nm，由空心病毒包膜组成，是HBV多余的衣壳蛋白，没有病毒核酸。无感染性，但刺激机体产生相应的抗体，具有中和病毒的作用，制备乙肝疫苗即由此种颗粒组成。 2.管型颗粒 由小球型颗粒连接而成，其长短不一。小球型颗粒和管型颗粒的产生是由于病毒颗粒包膜产量过剩。小球型颗粒和管型颗粒与Dane颗粒的比例依不同的病程差异较大，一般撒Dane颗粒的10 4 108 倍，在患者血液中的含量可高达 1013个/ml. 3.Dane颗粒 为完整的具有感染性的病毒颗粒，直径为42nm，由包膜和核衣壳组成。核衣壳直径为27nm，含有HBcAg，单一分子的部分双链DNA以及依赖DNA的DNA聚合酶。核衣壳很重要的一个功能是作为病毒基因组的保护性容器。另一独特的特征是P蛋白与长DNA链共价结合。在患者血液中的Dane颗粒含量为10 4 106个/ml. 图一 电子显微镜下可以观察到乙肝病毒3种不同的形态： 大球形颗粒，小球形颗粒和管形颗粒10 -2- 图二 肝病毒（HBV）结构示意图10 2.3理化特性及抵抗力在氧化铯平衡梯度离心中，HBV颗粒（42nm）的浮力为1.22g/cm3.表面抗原颗粒（22 nm） 为1.22g/cm3，病毒外膜成分含有来自宿主细胞的脂类，约占外膜干重的30%。 HBV对理化因素有较强的抵抗力。病毒在30 32 可存活至少6个月，在 -20 可存活15年。病毒浓度高时，60 加热10h,或98 加热1min,以及乙醚或pH2。4处理均不能有效灭活乙肝病毒，能够灭活HBV的常用方法和条件包括121高压灭菌20min, 160 干烤1h，100直接煮沸2min,以及0.5%过氧化酸，3%漂白粉溶液，5%次氯酸钠和环氧乙烷等的直接处理。HBV的感染性并非与其抗原性和免疫原性相一致，在一些能够灭活HBV感染性的条件下，其抗原性和免疫原性-仍可较好保留11。 2.4 HBV的基因组和蛋白组成HBV基因组结构特殊，成不完全闭合的双链形式，负（一）链为全长基因，约含3200个核苷酸，而正（+）链是负链长度的2080%，病毒颗粒内含有DNA聚合酶。在所有已知可感染人体而且具有独立复制能力的双链DNA病毒中，HBV基因组是最小但又是最高效的。 它具有以下4个鲜明的特点12-14： （1）不完全双链环状结构； （2）利用重叠的开放读码框（open reading frame ORF）编码多个蛋白质； （3）所有调控序列均位于蛋白质编码区内； （4）基因序列具有多变性。 -3- 图三 HBV基因组基本结构15 HBV含有4个ORF，即S区（包括preS1、preS2及S）、C区（包括preC和C）、P区和X区16，ORF之间互相重叠。HBV有4种转录子，共用一个PolyA加尾信号，长度分别为3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb（图 ）。4种mRNA合成7种病毒蛋白，即外膜蛋白（大、中、主蛋白）、核壳蛋白（前C和C蛋白）、X蛋白和P蛋白17。 外膜蛋白由S基因区编码，包括3种外膜成分：主蛋白（small protein ,S protein, 即HBsAg）、中蛋白（middle protein ,M protein, 即preS2+HBsAg）和大蛋白（large protein ,L protein, 即preS1+preS2+HBsAg）,主蛋白在3种成分中含量最高。主蛋白和中蛋白由2.1kbmRNA翻译而来，而大蛋白则是2.4kbmRNA的产物。HBV的外膜蛋白构成病毒的外壳包裹颗粒，使病毒能够附着和侵入新的细胞。大蛋白在病毒与细胞受体的结合、病毒颗粒的包装和自细胞向外分泌的过程中发挥重要作用。此外，外膜蛋白还含有引起宿主免疫反应的抗原表位，能够刺激机体产生保护性免疫应答。 核壳蛋白由HBV基因组的C区编码，存在两种形式：核心抗原（HBcAg）和e抗原(HBeAg). HBcAg分子量21KD，是病毒核壳的组成成分，在病毒复制过程中负责对前基因组RNA包装，这是基因组复制的必备步骤。HBcAg有较强的免疫原性，几乎所有的HBV感染者均产生针对HBcAg的抗体。HBeAg是分泌性蛋白，先由preC+C区编码带有信号肽的24KD的前体蛋白，前体蛋白进入高尔基体被蛋白酶切割后形成16KD成熟分子进入病人的血液中，HBeAg可诱导机体产生相应的抗体，其功能尚不清楚。HBcAg和HBeAg均是3.5kbmRNA的翻译产物。 P蛋白即聚合酶（polymerasa, Pol）由P基因区编码， 是一个含816个氨基酸的大蛋白，也是3.5kbmRNA的翻译产物。目前已经发现P蛋白具有4个功能性结构域，P蛋白参与病毒基因组复制的全过程，每一个结构域在基因组复制过程中都发挥不同的作用。HBV前基因组RNA反转录过程中的几个关键步骤，包括RNA的包装、DNA合成所需的引物、以RNA和DNA为模板合成DNA以及将RNA-DNA杂交体中的RNA消化等，均涉及P蛋 -4- 白的功能。由于P蛋白的重要性，使其成为抗病毒药物的主要靶点。 X蛋白由X基因区编码，其转录子为0.7kbmRNA。X蛋白具有多种功能。它可反式激活HBV本身的、其它病毒或细胞的调节序列，还可以激活蛋白激酶C，从而影响细胞信号转导。病毒在体内复制和传播也需要X蛋白的参与18-21。 2.5 HBV的复制在HBV的复制过程中，最突出的特点是，作为DNA病毒，HBV不以DNA为模板进行复制，而是将DNA转录RNA中间体（RNA intermediate）或称前基因组RNA，再逆转录成DNA进行复制，与逆转录病毒的复制过程类似。HBV的复制过程有以下几个环节22： （1）侵入：病毒颗粒的外膜蛋白和宿主细胞膜上的受体（至今不清楚）结合，脱去外壳 核心颗粒进入细胞质，进而脱去核壳，病毒DNA及聚合酶进入细胞核； （2）修复：HBV聚合酶修复不完整的正链，使其与负链完全互补，形成共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA, ccc DNA）,即超螺旋结构，是病毒复制的重要标志； （3）转录：宿主RNA聚合酶以ccc DNA为模板，转录出长短不一的mRAN,这些mRNA分子从细胞核转移到细胞质； （4）复制： mRNA分子在细胞质内被翻译成外膜、核心、X和聚合酶等多种蛋白。3.5kbmRNA被成为前基因组RNA（pregenomic RNA,pRNA）,含有病毒编码的全部遗传信息，既是蛋白质翻译的模板，也是HBV基因组复制时反转录的模板。在细胞质内，核心蛋白包裹pRNA和聚合酶形成新生的核心颗粒，病毒复制即在其中进行：先由病毒自身的聚合酶以pRNA为模板，逆转录出负链DNA，pRNA被降解：再以负链为模板，合成正链DNA，形成部分双链的环状DNA，即成熟的病毒基因组； （5）循环：一小部分含有病毒基因组的核心颗粒重新进入细胞核，以维持核内一定量的ccc DNA； （6）释放：大多数新形成的核心颗粒出芽到细胞质，装配好病毒的外壳，形成成熟的病毒颗粒释放到细胞外。 图四 HBV的复制过程23 -5- 3.HBV的致病性与免疫性乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)是引起中国及东南亚一带病毒性肝炎的主要病原之一，有半数以上HBV感染的患者将会发展为慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis, CH)、肝硬化(Liver Cirrhosis, LC)，甚至肝细胞性1fl癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC )，常被形象的称之为“慢性肝病三步曲24。 HBV感染后导致乙型肝炎的致病机制迄今尚未完全阐明。目前学者们一致认为乙型肝炎病人肝脏损伤并不是病毒在肝内复制的直接结果，而是机体对HBV表达产物的免疫导致反应机制所致25。 人体被HBV感染后，可产生免疫应答反应： （1）体液介导的免疫反应：受乙肝病毒感染后，机体可产生三种抗体，抗HBs、抗HBc 及抗HBe。抗HBs一般在感染HBV后4周出现，对乙肝有保护作用。据报道，在医务人员中，有抗HBs者发生乙肝的不到1%，而无抗HBs者有11%发生肝炎。但抗HBs仅能作用于细胞外的HBV，在预防感染上较重要，而在疾病恢复时尚需细胞免疫协同作用。 抗HBc的出现反映了HBV新近感染及正在体内进行增殖，因此，它可用为HBV在体内复制的一个指标。抗HBc一般在感染后60150天出现，往往在症状出现前或出现不久后即存在，比抗HBs出现要早3187天，由于抗HBc在疾病恢复过程中不仅不升高、反而下降，因此，认为抗HBc与抗HBs不同，它与保护无关，而与病毒增殖和肝细胞损害有关。抗Hbe能使病毒活力降低，可能有保护作用，但机制不一样26。 （2）细胞介导的免疫反应：目前认为HBV是非溶细胞性的，即不会增殖裂解被感染的细胞。因此，机体清除乙肝病毒主要依赖T细胞（Tc, T杀伤细胞）或通过抗体介导的K细胞来杀伤靶细胞，将病毒释放于体液中，以后再经抗体作用。实验研究发现，凡转为慢性肝炎者，一般T细胞数及功能较低下。因此，推测可能乙型肝炎病人T细胞功能强弱与临床过程的轻重和转归有关。Dudleuy认为，当T细胞免疫功能正常，受病毒感染的肝细胞不多时，乙肝病毒很快被细胞免疫配合体液免疫予以清除，这时，由细胞免疫所造成的急性肝细胞损伤可完全恢复。如T细胞免疫功能低下，免疫反应不足以完全破坏被病毒感染的肝细胞，或亦不能产生有效的抗HBs，或即使抗HBs却无法作用于细胞内的病毒，持续在肝细胞内的病毒可引起免疫病理反应而导致慢性持续性肝炎。如机体对病毒完全缺乏细胞免疫反应，既不能有效地清除病毒，亦不导致免疫病理反应，结果出现HBsAg 无症状携带症状。如果T细胞免疫功能过强，病毒感染的细胞又过多，细胞免疫反应可迅速引起大量肝细胞坏死，临床上表现为暴发性肝炎。但上述学说尚未被完全证实，通过进一步的研究，多数人认为细胞免疫和体液免疫相互配合发挥免疫作用。因此，抗体介导的K细胞作用已日益受到重视，并认为是杀伤靶细胞的重要免疫机制。除上述T细胞作用低下外，还有人认为慢性活动性肝炎的发生与T细胞抑制性功能低下，Tc细胞或K细胞的杀伤功能过强有关，从而造成肝细胞持续损伤27。 （3）自身免疫反应：HBV感染肝细胞后，一方面可引起肝细胞表面抗原的改变，暴露出膜上的肝特异蛋白抗原，另一方面可能因HBsAg含有与宿主肝细胞蛋白相同的抗原，从而诱导机体产生对肝细胞膜抗原成份的自身免疫反应。通过研究，发现确有部分乙肝病人存在对LSP的特异抗体或细胞免疫反应。一般认为，如病人在病程中出现自身免疫反应，则可加强对肝细胞的损伤而发展成为慢性活动性肝炎。 正常人由于T细胞对自身抗体系统的调控，在清除老化或破坏的肝细胞时，虽可产生自身抗 -6- 体，但并不发生自身免疫性疾病。在慢性肝炎，特别是慢性活动性肝炎时，由于T细胞免疫机能缺陷，乙型肝炎抗原（包括HBsAg,HBcAg及HBeAg）与宿主肝细胞表面或内部的蛋白质相互作用，形成含自身组织蛋白的抗原，具有较强的免疫原性，可引起持续的自身免疫反应；也可能由于病毒使机体免疫系统稳定性发生紊乱，细胞免疫失去调控，体液免疫反应亢进，对宿主的自身组织产生抗体，发生自身组织免疫反应，引起肝细胞损伤。有研究表明，慢性活动性肝炎的患者出现对肝细胞表面肝特异性脂蛋白的特异性细胞免疫反应。有人报道，根据肝炎患者肝细胞上免疫球蛋白的沉积，提示存在与HBsAg无关的自身免疫机理。有人认为，肝炎患者病毒性损伤可释放肝特异抗原，使宿主致敏，并使肝损伤持续存在。因此，自身免疫反应在慢性活动性肝炎发病中具有一定的作用28。 （4） 细胞因子介导的免疫机制：虽然HBV特异性CTL应答对HBV清除起着重要的作用但肝内CTL的数目湖杀伤效应远低于能有效控制HBV感染的能力。如果CTL通过直接杀伤效应有效地清除含HBV的肝细胞，则多数乙肝患者有可能发生大片肝坏死及急性肝衰竭。因此，除了CTL应答外，其他的机制有可能介导HBV诱发的肝损伤。体内及体外的研究显示，有些细胞因子可直接抑制HBV复制。通过加速HBVmRNA的降解抑制HBV的复制。有人报道，由HBV特异性的CTL产生的IFN-Y及TNF-a可通过非细胞致病效应增强CTL的抗病毒效应。肝内CTL产生型致炎性细胞因子，包括IFN-Y，IL-12等，控制肝内的病毒感染和复制。如果这些细胞因子分泌的不足，则形成慢性感染29-31。 新近有多项研究表明Th1/Th2细胞平衡在HBV感染的结局中起着关键的作用。CD4+Th细胞（CD4+辅助性T细胞）可分为Thl和Th2细胞，分别介导两种不同的免疫学效应。Thl细胞主要分泌IL-2, IFN- X和肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子，参与细胞免疫应答;Th2细胞主要分泌IL-4, IL-5, IL-6和IL-10等细胞因子，参与体液免疫应答;Thl/Th2的平衡决定了免疫应答的有效性和安全性。Th1细胞占优势，倾向于发生急性自限性感染和HBV清除；而Th2细胞占优势，倾向于发生持续的慢性HBV感染。活化的Th1优势反应可以强化充分的HBV特异性CTL反应。慢性HBV感染者中，HBcAg/HBeAg特异性的Th1/Th2细胞平衡被打破（分泌性HBeAg耗竭了Th1细胞，HBeAg特异性Th2细胞占优势）。体液免疫和细胞免疫反应是被不同的Th细胞亚群所调节的：体液免疫主要由Th2细胞调节，细胞免疫主要由Th1细胞调节。Th细胞亚群失衡将严重扰乱体液免疫和细胞免疫32-34。 在鼠模型中观察到影响 HBcAg/ HBeAg特异性 Th1/Th2细胞平衡的因素包括35: 抗原构成 （HBcAg 对 HBeAg）； 宿主 MHC 和 T细胞识别位点 ； Th1 细胞和 Th2 细胞的交互调节 分泌性 HBeAg对 Th1细胞的抑制； 细胞因子体内治疗使HBV特异性Th细胞亚群反应向 Th1或 Th2 倾斜。 干扰素能诱导IL-122亚单位的表达，可以使Th0细胞向Th1细胞分化，这是干扰素调节Th1/Th2细胞平衡的分子机制之一。 最新的研究认为,CTL在不损伤肝细胞的情况下也可能清除HBV DNA、核壳蛋白和DNA复制中间体，即“非溶细胞性清除机制”。这种作用是通过Th1型细胞因子诱导而实现的，慢性乙型肝炎的恢复伴随着Th1型细胞因子反应上调，在病毒清除时干扰素水平有显著升高。在黑猩猩中也发现HBV DNA水平的下降伴随着干扰素的增加。在干扰素抗病毒治疗显现持续反应者中，肝内HBV特异性CD4+T细胞反应和Th1型细胞因子显著增加存在相关性，外周血淋巴细胞中细胞因子的表达也以Th1型占优势，这说明干扰素的抗病毒效应在很大 -7- 程度上是通过Th1型细胞因子而实现的36-38。 4. 乙型肝炎的抗病毒治疗和特异性免疫重建乙型肝炎治疗的目的是减轻肝脏病变，防止或延缓发展为肝硬化、肝癌，最终目标是彻底清除病毒，达到完全治愈。除一般的保护肝脏和免疫调节治疗外，抗病毒治疗是肝炎治疗的重点也是难点。 到目前为止，获得美国食品与药物管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准并在临床应用的抗HBV药物有两大类：干扰素及核苷类似物，它们的代表药物分别是a干扰素（interferon-a, IFN-a）,拉米夫定（Lamivudine, 3CT）39。 4.1 干扰素干扰素本身是机体细胞因子网络中的重要组成部分，具有抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节等多种生物活性。 干扰素的免疫调节作用包括以下几个方面40-41： （1）调整Th1/Th2细胞平衡，促进Th1优势反应； （2）使CD4/CD8比值恢复正常；激活NK细胞的细胞毒作用，增强抗体依赖性细胞介导的细胞毒（ADCC）活性； （3）能诱导病毒感染细胞表面主要组织相容复合体（MHC）-类抗原表达，有利于CTL对感染细胞的识别和攻击； （4）能激活抗原提呈细胞，增强抗原提呈细胞的功能； （5）能增强巨噬细胞的吞噬功能，诱导释放溶酶体酶； （6）调节细胞因子，如IL-1、IL-2、TNF、有丝分裂因子、巨噬细胞激活因子等的分泌，参与免疫增强反应。 4.2拉米夫定拉米夫定抑制HBV DNA复制迅速、疗效确切。但拉米夫定的免疫调节作用并未得到肯定。早年的一项研究认为，拉米夫定可以使血清HBV DNA迅速下降，但不能重新恢复受损的HBV特异性T细胞反应。 最近的研究认为，拉米夫定可以重建HBV特异性细胞免疫在拉米夫定治疗过程中测定T细胞功能时发现，拉米夫定在大幅度降低病毒和抗原数量的同时，可使长期处于对HBV低反应状态的T细胞功能得以恢复。在一组HBeAg阳性、ALT升高单独应用拉米夫定的病例中，观察到拉米夫定可以克服慢性HBV感染状态时CTL低应答状态，使CTL对外源性刺激敏感。在拉米夫定治疗后714天，可以测得明显的CD4+T细胞介导的对HBV核壳抗原的反应，这种反应在12例患者中有10例呈持续性，其出现继之以快速且显著的血清病毒水平的下降。伴随着血清病毒水平的下降，拉米夫定治疗后慢性乙型肝炎患者有效的抗病毒T细胞反应可以得到恢复和重建；拉米夫定还可增强T细胞对丝裂原和回忆抗原的反应，说明拉米夫定的效应并不局限于HBV特异性T细胞42。 一般认为干扰素和拉米夫定治疗显效的近期均不能清除细胞内HBV cccDNA,停药后部分病例容易复发，这些复发病例很可能没有建立起充分的抗病毒免疫反应。当充分正规的治疗使抗病毒免疫反应稳固重建后，细胞内HBV cccDNA也许可以清除43。 近年来核苷类药物的研发在国际上很活跃，随着抗病毒药物的逐渐增多，药物的联合 -8- 应用为提高疗效和降低耐药提供了可能。 5.乙型肝炎的基因治疗所谓乙型肝炎的基因治疗是指将正常的野生型基因或特定设计的治疗基因导入机体或特定的细胞内替代、修正、补偿有缺陷的基因功能；或封闭、抑制异常表达的基因以达到治疗某种疾病的目的。目前乙型肝炎基因治疗的主要策略包括：反义技术、反基因技术、核酶、DNA疫苗、干扰性多肽或蛋白质以及单链抗体等。 5.1反义技术反义技术是指设计与mRNA序列互补的核酸分子，导入细胞，使其遵循碱基配对原则与mRNA特异性位点结合，从而抑制或阻止蛋白质的翻译，达到抗病毒的目的。反义技术有反义寡聚核糖核苷酸（antisense oligodexynucleotide, ASODN）和反义RNA（antisense RNA）。ASODN是人工合成的由12 30个碱基组成的与靶mRNA互补的寡核苷酸片段。它的作用机制包括以下几个方面： （1）ASODN与靶mRNA结合，形成DNA-RNA杂化分子，阻止蛋白质的翻译，并诱导RNaseH降解靶mRNA； （2）作用于mRNA5端，阻止帽子结构的形成，影响mRNA的成熟； （3）作用于polyA的形成位点，阻止mRNA的成熟及向胞浆内转移。由于ASODN在细胞或体内易被核酸降解失活，为增强其稳定性提高抑制作用，需要对ASODN进行修饰。现常用的修饰方法包括硫代磷酸化和甲基化，亦有报道用聚乙二胺与ASODN结合可阻止在体内降解。经过修饰后的ASODN在透膜性和稳定方面都有很大提高。体外研究表明，针对HBV S、C、P、X区基因的ASODN均取得相应的抑制效果。反义RNA在细胞质内与基因的mRNA完全互补，从而阻止蛋白质的翻译。 5.2 反基因技术与反义技术不同，反基因技术是根据三螺旋结构DNA形成的原理，以靶基因中同聚嘌呤-嘧啶区域为靶位点，设计、合成反基因寡核苷酸或三螺旋形成寡核苷酸，导入细胞内，通过与双链DNA形成三螺旋结构，抑制或阻断靶基因的转录。 5.3 核酶（Ribozyme, Rz） 核酶（Ribozyme, Rz）是一种具有核酸内切酶活性的RNA分子，可特异性地与靶基因结合并切割靶mRNA。近年来，应用Rz已成功地在细胞内抑制HBV的基因表达。最近，一种针对HBVmRNA的经化学修饰的Rz已经进入临床试验阶段。 5.4 DAN疫苗（DNA vaccine） DAN疫苗（DNA vaccine）又称基因疫苗或核酸疫苗，是指将编码某一特定蛋白质抗原的基因片段插入适当的真核细胞表达载体中，构建重组质粒，然后经肌肉注射或基因枪技术直接接种到机体中，宿主细胞摄取质粒后，表达抗原蛋白，从而诱导机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答。针对HBV的基因疫苗一般选择HBV C区和S区为靶点构建质粒，诱导机体产生特异性细胞免疫和体液免疫应答 ，达到清除病毒的目的。目前已有一批针对HIV、HBV及流感病毒的预防及治疗型DNA疫苗正在进行临床试验。 -9- 5.5 负性突变体技术负性突变体技术是通过构建病毒蛋白编码基因的突变体，在细胞内表达异常的病毒蛋白或多肽，从而干扰病毒核酸的包装及病毒颗粒的装配。 5.6 单链抗体技术单链抗体技术是将目的抗体基因转导靶细胞并产生抗体，中和病原体并抑制其复制的一种治疗方法。有研究表明，HBsAg的单链抗体（single chain variable fragments, scFv）可使细胞外的HBsAg降低85%。选择抗HBcAg的单链抗体基因在细胞内表达scFv，通过在细胞内形成抗原-抗体复合物和干扰HBcAg的功能可抑制病毒复制44-46。 6. 常见的几种HBV病毒变异6.1 S基因区变异S基因区包括前S1、前S2及S基因，分别编码前S1蛋白、前S2蛋白及主蛋白。HBV DNA第3055核苷酸(nt)约相当于前S1起始码下游第230碱基，可突变形成终止码，并影响前S2起始码，这种突变与HBV逃避干扰素治疗和宿主免疫清除有关。HBV DNA第2995-3177nt位于前S开放读码框(ORF)内，但其缺失可削弱前S的免疫性，但仍能保留与肝细胞的结合位点，有利于HBV逃避机体的免疫攻击，形成慢性携带状态47。 在某些病人，HBsAg虽然转阴，但肝功能仍未恢复，有相当比例HBsAg()、抗HBs(+/-)的患者体内仍可检出HBV DNA，可能原因有： HBsAg滴度低，常规方法不能检出； HBsAg隐匿于HBsAg/抗HBs复合物中； 病毒整合后S基因替代突变、缺失或重排； HBV变异株产生改变了HBsAg的抗原反应性，使病毒发生“诊断逃避”。 临床上出现的HBsAg(+)母亲所生婴儿用乙肝疫苗免疫失败者和原位肝移植受者免疫预防再感染失败者中，大多出现了S基因区变异，从而形成“免疫逃避和疫苗逃避”。在用高效价乙肝免疫球蛋白(HBIG)预防HBV再感染的原位肝移植受者体内检出的S突变株，特别是第142，l44，145aa三处，包括典型的“疫苗逃避株”145甘氨酸精氨酸。这些突变可削弱或改变HBsAg的免疫原性，降低HBsAg被HBIG识别的能力；撤除HBIG后又可回复到野生型，高度提示这些突变是长期免疫压力筛选的结果。因而有学者不赞同乙肝孕妇在怀孕第7、8、9月注射HBIG以减低新生儿感染率，他们认为这样反而会因过度使用HBIG而导致病毒变异而使阻断失效。但这样的报道尚未有有力数据支持。 6.2 前C/C基因变异，C1896位(A83)的变异： 前C/C基因变异，C1896位(A83)的变异是HBV中最常见的变异。野毒株1896位是G，变异为A，A83氨基酸(TGC)变异为终止密码(TAG)，使前C蛋白的翻译终止，从而使eAg不能合成，此突变有助于HBV逃避免疫攻击但它并不影响报道复制，而形成慢性感染状态。这种情况临床上表现为HBeAg(-)、HBV-DNA(+)，而病人仍处于活动状态的慢性乙型肝炎。即未经药物治疗的小三阳但HBV-DNA阳性者。上述变异也见于干扰素治疗后，因此提示以HBeAg转阴作为疾病好转的指标有时并不准确，结合HBV-DNA检测判断48。 6.3 P基因区变异 -10- P基因区编码HBV DNA聚合酶(DNAP)，其自然突变率与逆转录病毒gag基因相近。第2798nt AC可使DNAP中的一个脯氨酸由苏氨酸取代，导致HBV复制缺陷。目前临床上广泛使用的胞苷类似物拉咪呋啶(1amivudine)和乌苷类似物泛昔洛韦(famciclovir)等抗HBV药物，作用靶位主要是DNAP，通过与底物dNTP竞争结合以抑制HBV的逆转录和复制。但这些药物的使用产生了HBV的耐药突变株，而形成了“抗病毒治疗逃避”。HBV耐药株的突变就发生在DNAP基因内。DNAP催化中心核苷酸结合位区为一高度保守序列，即“酪氨酰(Y)、蛋氨酰(M)、天冬氨酰(D)”基序(YMDD motif)，是DNAP发挥催化活性所必需的关键结构。发生突变以后可能使已降低的病情加剧（即所谓反跳），对所用药物产生耐受。YMDD耐药变异的防治：随着用药时间的延长，核苷类药物易引起病毒变异，导致耐药。为了减少耐药性的出现，可以联合用药。从理论上讲，干扰素和核苷类药物在不同的靶位点联合应用，可减少耐药株的出现。阿德福韦是一个广谱的抗病毒药物。在HIV治疗过程中未发现有耐药变异。所有变异株对阿德福韦均敏感，且对联合变异也有效49。 6.4 X基因区变异X基因是病毒复制的重要调节区，是转录、反转录和正链合成的起点，也是多种细胞因子结合点，此区变异影响到病毒的转录和复制。目前认为X基因区BCP、SP或PreSP的变异改变了HBV基因表达的平衡，与HBV持续感染相关。这种变异株的HBsAg，HBcAg，HbeAg表达水平均下降，但DNA水平与野生株相仿或稍高，提示病毒复制能力变化不大；将后一变异株与少量完整的X基因共转染细胞，则HBcAg产量比单纯变异株多3倍。但Cabrerizo等报道HBV ORF-X变异可能也是某些患者体内HBV DNA水平较低、病毒生物活性减弱的一个原因。HBxAg也可能成为致敏CTL攻击的靶抗原。患者血清中可溶性HBxAg相关多肽可调节CTL对靶细胞的免疫识别，因此ORF-X变异可能亦不利于清除HBV。另一方面，HBxAg是一种强力反式激活因子，可通过多种途径促发肝细胞癌变50。 7. 乙型肝炎研究的细胞模型建立表达乙型肝炎病毒的体外培养细胞模型，对研究HBV生物学特性、乙型肝炎发病机制、体外抗HBV药物筛选及致癌机制的研究有重要意义。 7.1 肝源细胞系肝脏是HBV感染和复制的主要场所，故肝细胞是HBV感染模型的首选细胞。目前应用于HBV培养的细胞系有成人肝细胞系、胚胎肝细胞系和肝癌细胞系，尤其是肝癌细胞系，如HepG2, Huh6-C15, Huh-7,Hep3B, PLC/PRE/5等，在HBV DNA及其基因组片段的转染细胞系的建立中占有重要的地位。 （1）成人肝细胞模型:用含HBV感染颗粒的人血清接种培养的成人肝细胞，可在上清中检测到HBV抗原和HBV DNA，表明HBV可感染原代培养的成人肝细胞，同时用pre S1特异性抗血清能阻断病毒感染。川在含2%二甲亚矾(DMSO)培养液中加入聚乙二醉可显著增强HBV DNA内吞量和提高病毒的吸附效率而不改变HBV感染的组织及种属特异性。HBV感染成人肝细胞模型与自然感染过程相似，病毒抗原可较长时间存在，细胞内出现HBV DNA复制型.但成人肝细胞是一类终末分化的细胞，不能传代培养，且在肝细胞铺板后，成熟肝细胞的功能如白蛋白产生能力下降、失去典型多角形态，对病毒敏感性也逐渐下降，限制其实际应用。 -11- （2）胚胎肝细胞模型:人胎肝细胞系可较好模拟人体内肝细胞的生物学功能，并对血清HBV感染敏感，产生HBV复制型和各种病毒标志物，释放Dane颗粒。来自不同胎龄的胎肝细胞对HBV感染显示相同的感染动力学。但成熟的原代胎肝细胞体外长期培养非常困难，细胞分化能力有限，不能多次传代，且胎肝细胞的分化状态对病毒复制可能产生影响，限制了其应用和研究。 （3） HepaRG细胞株:由于用血清直接感染细胞更接近自然感染状态，适用于研究在自然条件下病毒吸附、穿入宿主细胞的机制，及抗体的中和作用、抗病毒治疗等，而过去所建立的肝癌细胞株无法直接用病人血清感染。Philippe Giipon等1121从慢性丙型肝炎感染的肝癌病人体内分离，加入DMSO和类皮质激素培养，建立的HepaRG肝癌细胞株。HepaRG细胞株与正常的肝细胞相比具有相似的形态学和生理学功能，既可用于转染，又和原代肝细胞一样适合于HBV血清直接感染，从培养上清中可检测到HBV抗原和HBV DNA.而且该细胞株具有与正常人肝细胞相似的生物学特性，可以应用于研究病毒感染的早期阶段包括仍然未知的病毒分子受体、药物对病毒感染早期阶段的作用、抗病毒药物的筛选、药物的毒理学和药理学在内的许多领域。 7.2 非肝源细胞系1980年以来，陆续在肝外组织如胰腺、肾脏、骨髓淋巴样母细胞和外周血单个核细胞等中发现了HBV DNA及其基因产物，并且可作为HBV感染复发的重要来源，提示HBV除了肝细胞外，还有泛嗜性，这是将非肝源细胞列入转染靶细胞的重要依据。目前用于HBV DNA转染的非肝源性细胞系有:FL5-1,Hela细胞、单个核细胞系U937细胞、树突状细胞等。这些细胞系可表达病毒的全部或部分抗原、HBV DNA，表明其内环境可支持HBV复制、包装和分泌。HBV基因在U937和树突状细胞中成功表达对研究HBV复制机理、在骨髓来源的细胞系中的调节、免疫系统对HBV的影响等十分有用。但非肝脏细胞装配和分泌的HBV颗粒，只是类似于天然状态的HBV病毒颗粒，与真正天然状态的HBV颗粒有很大差别。 7.3 动物细胞系许多研究表明，HBV可在动物细胞系中获得短暂或较长时间的表达。DeMeyer创414研究表明HBV S基因表达的小蛋白(SP)能与Ca+依赖性磷脂结合蛋白(human annexin V)特异性结合，促进HBV进入大鼠原代肝细胞复制并进行表达，介导HBV跨种属特异性感染。在动物细胞系中的成功转染表明HBV感染的种属屏障在于其对靶细胞细胞膜的吸附及透过，而HBV的复制和表达则依赖于肝细胞内环境。此外，小鼠成纤维细胞系NIH3T3和LtK 、大鼠Morris肝癌细胞系Q7、果蝇细胞、非洲绿猴肾细胞Vero等，也常被选为转染靶细胞，可表达HBV的抗原和分泌病毒颗粒。HBV在非人类细胞内复制的细胞模型可作为在人类细胞内复制模型的补充51-52。 7.4 展望HBV细胞模型是筛选抗HBV药物、研究HBV生物学特点及其与细胞间相互作用的必要工具。己有的细胞模型在研究HBV发病机理、免疫机制、抗病毒药物的筛选中发挥了一定的作用，但也存在问题: (1)无对病毒感染和致癌机理合适的细胞模型; -12- (2)细胞表达的稳定性问题。今后建立的细胞模型应借助于分子生物学、分子细胞学的最新进展，寻找既适用于转染，又可用血清直接感染，接近肝细胞生理状态并能稳定表达HBV抗原的细胞模型，将对研究HBV的生物学特性、感染姆制、抗病毒药物的筛选和致癌机制有重要帮助。 参考文献 1. 姚光弼等，临床肝脏病学，上海科学技术出版社 2. 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