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游离脂肪酸及高糖对内皮细胞功能的影响研究作者：万沁 钟海花 何建华 马红燕 徐勇 李佳 作者单位：泸州医学院附属医院内分泌科,四川 泸州 646000 【摘要】 目的 探讨游离脂肪酸及高糖对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的功能的影响及可能机制。方法 研究游离脂肪酸及高糖对血管内皮细胞功能指标一氧化氮(NO)和可溶性细胞间黏附分子1(sICAM1)的影响;用激光共聚焦显微镜观察游离脂肪酸及高糖对PKC、PKC的影响。结果 不同浓度游离脂肪酸及高糖均可诱导内皮细胞功能紊乱及PKC及PKC表达位置转移及表达增强，高糖中加入游离脂肪酸可使变化更显著。结论 游离脂肪酸及高糖均可导致内皮细胞功能紊乱，可能部分是通过PKC及PKC途径来实现的。【关键词】 内皮细胞功能;游离脂肪酸;高糖;蛋白激酶C(PKC);PKCEffects of free fatty acids and high glucose on endothelial cellsWAN Qin, ZHONG HaiHua, HE JianHua, et al.Department of Endocrinology, Luzhou Medical College, Luzhou 646000, Sichuan, China 【Abstract】Objective To study the effects of free fatty acids and high glucose on human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and the possible mechanisms.Methods The expressions of nitric oxide (NO) and soluble intercellular adhesion molecule1 (sICAM1) were determined by kits. The expressions of PKC and PKC were determined by laserscanning confocal microscopy. Results Different concentration of free fatty acids and high glucose induced HUVECs dysfunction, PKC and PKC translocation and over expression, and high glucose added free fatty acids made more significant changes.Conclusions Free fatty acids and high glucose could induce endothelial cells dysfunctions by PKC and PKC signaling pathways. 【Key words】Endothelial cells function; Free fatty acids; High glucose; Protein kinase C（PKC）; PKC血管并发症是糖尿病的主要并发症之一,它严重影响了糖尿病患者的预后和生存，其中血管内皮细胞（endothelial cell，EC）的损伤在大血管并发症中起着关键作用，已证实高血糖在血管EC的损伤中起重要作用1。除高糖外,游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)水平升高也在糖尿病血管并发症发生发展过程中起重要作用，FFA特别是软脂酸(palmitic acid，PA)可导致血管内皮细胞功能受损是糖尿病血管并发症的关键因素2。但目前有关FFA引起EC损伤的机制尚不清楚。FFA介导的EC损伤中的机制有多种,氧化损伤是研究的重点3,也与细胞黏附因子(ICAM1)、一氧化氮(NO)等表达增加引起炎症反应有关,其中激活的蛋白激酶C（PKC）起着关键性作用,但PKC各亚型的作用不一。体外培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）是血管内皮功能研究中最常采用的一种细胞,它对包括炎症因子在内的多种体内因子均有很好的反应性,通过HUVEC的体外实验可以帮助探讨在体条件下多种因素对血管内皮功能的影响及其机制。本实验以HUVEC为靶细胞，观察FFA、高糖单独及这两种因素共存时对血管EC的损伤情况，进一步探讨大血管并发症的发生机制。1 材料与方法1.1 材料 软脂酸(美国Sigma公司)，牛内皮细胞生长因子（endothelial cell growth factor， ECGF）,胎牛血清、I型胶原酶、M199培养液、胰蛋白酶(Gibco公司)，兔抗人因子相关抗原抗体、SP免疫组化染色试剂盒、浓缩型DAB试剂盒(北京中山生物技术有限公司)，二甲基亚砜(DMSO)、PMSF(Sigma公司)，酶标仪(美国BioRad550型)，微量自动洗板机(美国BIOTEK公司，型号EL404）；NO试剂盒(南京建成生物有限公司)，ICAM1试剂盒(晶美生物工程有限公司)。1.2 方法1.2.1 HUVEC原代细胞培养 采用原代培养方法。取健康产妇的婴儿脐带,用0.1胶原酶37消化2030 min，用培养液重新悬浮细胞，台盼蓝染色细胞活性在95%以上。以104105个/ml接种到培养瓶中，置于37，5CO2培养箱中培养。用含20的小牛血清的M199培养液,其中1 000 ml培养液中含2 mg ECGF，青霉素0.125 g，链霉素0.1 g，5 000 U肝素钠。23 d换液1次，细胞生长至融合后进行传代，经因子相关抗原免疫组化鉴定阳性,传代培养至24代用于实验。1.2.2 分组 对照组：葡萄糖浓度5.5 mmol/L;2.高糖组:葡萄糖浓度30 mmol/L;3.FFA组：以PA为代表，培养液中分别加入终浓度为125、250和500 mol/L的PA。4.葡萄糖与FFA联合作用组：30 mmol/L高糖+250 mol/L的PA。每组6孔,于37、5%CO2孵箱中孵育48 h。1.2.3 NO的测定 细胞上清液中NO含量的测定：NO化学性质活跃，体内代谢转化为硝酸盐(NO-3)和亚硝酸盐(NO-2)，采用硝酸还原酶法测定NO-3+NO-2可较准确反映NO水平。具体检测方法主要参照试剂盒说明进行。1.2.4 sICAMl测定 采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ABCELISA）法测定上清液中sICAM1水平，具体操作严格按照试剂盒进行。1.2.5 激光共聚焦显微镜作PKC及PKC免疫荧光分析 将生长在载玻片的EC同步经上述分组培养后用丙酮：甲醇73湿盒内固定；滴加0.1TritonX100PBS4下作用细胞10 min；分别加1100的兔抗人PKC、PKC多抗，37温育60 min，4作用细胞过夜；滴加1100的FITC标记羊抗兔IgG 100 l，37温育60 min;用甘油封片；各步骤间以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液充分洗涤，35 min。用激光共聚焦显微镜(LaserScanning Confocal Microscope，CLSM，MRC1024型)观察荧光在细胞内分布、定位，测定时选用激发光波长为488 nm，发射光波长为475 nm，Iris5.1，Pixel size1.291 m，Power30%，Gain 1 500，所有实验保持参数不变。1.3 统计学分析 计量资料以xs表示,数据结果采用SPSS11.0统计软件包进行处理。数据方差齐性的采用多样本方差分析;数据方差不齐者采用秩和检验。2 结果2.1 NO、sICAM1浓度 见表1。各浓度FFA组、高糖组NO水平比对照组明显降低。其中高糖组、高浓度FFA显著降低（P0.001），低、中浓度FFA组明显（P0.05）。不同浓度FFA组内比较，低、中浓度组之间NO水平差异无统计学意义,高、中浓度组相比有统计学意义（P0.01）。提示FFA达到一定浓度时，对NO水平的抑制作用会更明显。在高糖培养同时加入FFA后可加重上述损害，其NO下降水平与高糖组相比有统计学意义（P0.05）。高糖组及各浓度FFA组sICAM1水平比对照组明显增加。高、中、低浓度FFA组对sICAM1浓度的刺激程度组间比较均有统计学意义（P0.05），其对sICAM1表达的刺激作用呈剂量依赖性。在高糖培养同时加入FFA后sICAM1浓度升高更明显，与高糖组相比有统计学意义（P0.05）。表1 正常对照组、高糖组和FFA组NO、sICAM1浓度值(略)2.2 PKC,PKC的表达 PKC在正常HUVEC内在胞浆呈弥漫性分布，胞核无表达或弱表达（图1A）。高糖作用后，PKC发生转位，主要转位于胞核和核周，尤以胞核明显（图1B）。而加入不同浓度的FFA同样可引起这种转位（图1C、D、E）。在高糖中加入FFA后可使转位更明显（图1F）。PKC主要在正常HUVEC中胞浆表达,以细胞核周明显（图2A），不同浓度的FFA作用后PKC发生不同程度的转位，主要是以核周向胞浆胞膜转位,且荧光强度升高，提示表达增强（图2B、C、D）。而同样高糖作用后可引起转位及荧光表达强度增高（图2E）。在高糖中加入FFA后可促进转位及荧光强度增强（图2F）。未加一抗的阴性对照组无荧光表达。3 讨论 糖尿病血管并发症是糖尿病的主要并发症，其发病关键部位是血管EC。血管EC不仅阻隔血液与血管内膜下成分的接触,更重要的是它能分泌和表达一系列生物活性物质,在调节血管舒缩、血小板功能及凝血、纤溶系统和白细胞移行方面具有重要作用。在病理状态下EC易受损伤,致内皮功能发生变化,因此血管EC的损伤被认为是形成糖尿病及其血管并发症的基础。近年来炎症反应学说在2型糖尿病及其血管并发症的研究中成为热点，普遍认为糖尿病及其血管病变是炎症性疾病,由于炎症因子引起的炎性反应导致EC功能紊乱,从而对糖尿病慢性血管并发症的发生发展起着重要作用。这些炎症因子包括:急性期反应蛋白、内皮黏附分子、肿瘤坏死因子、白介素系列、纤溶酶原激活物抑制物、von Willebrand因子、脂联素、抵抗素等，其中ICAM1是重要成员,在正常情况下很少表达，当受到刺激后，可表达于多种细胞表面。在糖尿病慢性血管并发症的形成和发展中起重要作用,其水平升高反映了糖尿病时EC功能异常4。 糖尿病的血管EC损伤的具体机制目前尚未完全明确,已证实高糖及FFA在血管EC的损伤中均起着重要作用。FFA是脂类代谢中最活跃的部分,升高的FFA可导致血管EC功能损伤。FFA介导的EC损伤中的机制有多种,可能与其诱导致细胞凋亡、EC的一氧化氮合酶活性改变和细胞因子刺激EC神经酰胺的产生等有关。氧化损伤一直是研究的重点，研究表明,随实验动物的血浆FFA浓度增加,血浆氧化应激的标志物异前列腺素和蛋白质羰基增高,表明FFA可增加细胞的氧化应激4。还有研究表明FFA培养细胞后使氧化应激增强，白介素IL8增多、核因子NFB活性增强,ICAM1含量增加，认为NFB能调控血管EC黏附分子、NOS等基因表达而引起炎症反应。Coll5发现,高FFA可使细胞内活性氧增高,通过氧化应激促发MAPKERK和NFB等途径激活和表达增加,进而形成糖尿病血管损害，但机制并不完全明了。 激活的PKC可抑制eNOS的活性，导致NO生成减少，引起EC损伤是糖尿病血管病变的机制之一。同时高糖通过PKC上调黏附分子表达，成为糖尿病内皮功能受损的一个重要机制6。但PKC各亚型的作用不一,PKC与糖尿病慢性并发症如肾病、心血管疾病等发生有关,还参与EC功能紊乱发生7。而PKC参与EC功能紊乱发生的作用,研究发现内皮素1的缩血管作用由主要由PKC介导的。凝血酶刺激EC的血管VCAM1基因表达是NFB依赖性机制,在共转染HUVECs时凝血酶刺激NFBVCAM1表达过程仅能被PKC抑制剂阻断8。 本研究采用人脐静脉EC的体外培养方法,探讨FFA对EC的损伤作用，结果显示,高糖、不同浓度的FFA均对EC的NO合成具有明显的抑制作用，还可刺激sICAM1的表达，而在高糖培养同时加入FFA可加重上述损害。实验发现高糖和不同浓度FFA均可诱导的PKC转位及表达增加，还可诱导的PKC转位，提示高糖和FFA对血管EC的损伤机制除公认的氧化应激外，PKC转位、PKC转位及表达增加可能也参与作用。 血管EC的损伤是血管病变的启动环节,血浆FFA可能通过氧化应激、PKC，PKC途径等损伤EC，导致的内皮源性NO水平下降，炎性标志物ICAM1升高，在糖尿病血管病变发病过程起到很重要的作用。血浆FFA浓度增高已成为糖尿病血管病变的危险因子,因此如何在该病理生理链的上游调整糖尿病患者FFA代谢紊乱以及在下游通过PKC，PKC途径改善血管EC功能有可能成为未来糖尿病患者防治大血管病变治疗的一个新的治疗靶点。晋升网（）设有论文学院、考试学院、在线投稿等，本网站致力于成为医务工作者晋升职称心灵导师；是目前国内收录医学期刊、医学杂志最多最权威的医学学术平台；提供免费医学期刊在线阅读；网罗和甄选海量优秀医学论文检索，独立研发医学在线资源分享库和医学在线模拟考试库；整合刊类、标题、关键词检索及全文检索，并独家研发刊社管理和刊社加盟系统、在线投稿、在线查稿、在线阅读、远程审稿、在线下载等系统；聚刊社力量，建服务平台，让晋升网通过“专业”走入每一个医务人员的身边是我们不懈的追求目标【参考文献】1 Omi H，Okayama N，Shimizu M,et al.Participation of high glucose concentrations in neutrophil adhesion and surface expression of adhesion molecules on cultured human endothelial cells：effect of antidiabetic medicinesJ.J Diabetes Complications，2002；16(3):2018.2 余叶蓉，J insu Z，Yonggang W,et al.胰岛素对游离脂肪酸所致大鼠内皮依赖性血管舒张功能损害的影响J.中华医学杂志,2002;82(6)：4225.3 Bitar MS，AlSaleh E，AlMulla F.Oxidative stressmediated alterations in glucose dynamics in a genetic animal model of type diabetesJ.Life Sci，2005；77(20):255273.4 Zhou Z，Liu Y，Miao AD,et al.Protocatechuic aldehyde suppresses TNFalphainduced ICAM1 and VCAM1 expression in human umbilical vein endothelial cellsJ.Eur J Pharmacol，2005；513 (12):18.5 Coll T，Jove M，RodriguezCalvo R,et al.Palmitatemediated downregulation of peroxisome proliferatoractivated receptorgamma coactivator 1alpha in skeletal muscle cells involves MEK1/2 and nuclear factorkappaB activationJ.Diabet