分子生物学技术在松材线虫研究中的应用.doc

植病检疫学期末论文系 别: 专 业: 姓 名: 学 号: 分子生物学技术在松材线虫研究中的应用摘要: 松材线虫病（Bursaphlenchus xylophilu）是松树的一种毁灭性病害，也是重要的森林检疫对象。松材线虫病的诊断方法是防止松材线虫病发生、蔓延及传播的技术保证。根据松材线虫分子生物学的研究基础，以及基于不同的研究目的，对松材线虫不同DNA区域，包括基因组DNA、线粒体DNA、核糖体DNA研究做了综述、分析。关键词：植物检疫 松材线虫 分子生物学植物检疫是旨在防止危险性有害生物传入、扩散或确保其官方防治的一切活动，即通过法律、行政和技术的手段，防止危险性植物病、虫、杂草和其他有害生物的人为传播，保障农林业生产的安全，促进贸易发展的措施。它是人类同有害生物长期斗争的产物，也是当今世界各国普遍实行的一项制度。植物检疫是植物保护措施中最具有前沿性和强制性的一项措施。植物保护的原理包括预防、杜绝或铲除、免疫、保护和治疗5个方面，植物检疫的内容就涉及植物保护中预防、杜绝或铲除各个方面，因此是最有效的、最经济、最值得提倡的一个措施，有时甚至是某一有害生物综合治理（IPM）计划中的唯一一项具体措施，但植物检疫所具有的特点确不同于植物保护通常采用的化学防治、物理防治、生物防治和农业防治等措施。曾士迈院士指出，“植物检疫是植物保护系统工程中的一个极其重要的子系统，是植物保护的边防线，必须严防密守。新的危险性有害生物一旦侵入，往往后患无穷，没有检疫的防治永远是被动挨打的防治。中外历史上已有教训。”松材线虫病是由松材线虫（Bursaphlenchus xylophilu）引发的一种毁灭性森林病害，可危害多种松属(Pinus)植物。主要通过传媒松墨天牛(Monochamus alternatus )在松树上取食和产卵进行自然传播及病木、加工木进行长距离传播。目前，该病主要分布于美国、加拿大、墨西哥、日本、韩国、中国等，近来葡萄牙也有报道，其中日本和中国受害最重1-2。由于该病对各国林业生产造成巨大影响，因而受到世界各国的普遍重视并被列为重要的森林植物检疫对象。尽管早在20世纪初日本就发现了松枯萎病(松材线虫病)，但直到70年代初Mamiya等用采自死松树上的松材线虫进行接种试验，证实了松材线虫强烈的致病作用才首次提出松材线虫是松枯萎病(Pine wilt disease)的病原。之后便对该病进行了广泛而深人的研究，并取得了较多成果。由于该病危害的严重性和防治上的巨大困难，严格检验检疫是阻止该病的发生、传播和蔓延的最重要的途径之一。所以多年来松材线虫病的诊断方法一直是研究的一个热点3。1病原的诊断方法对病害最可靠的鉴定方法是对其病原物的鉴定。所以快速、准确地直接对病原物进行鉴定便成为病害诊断的主要方法之一。由于与松材线虫形态相似、致病性较弱的拟松材线虫(Bursaphlenchus mucronatus)常与松材线虫混生，此外，尚有多种其他非致病性线虫也会出现在病树木上。因而，简便、快速鉴定松材线虫的方法，对病死材的准确诊断具有极其重要的应用价值。随着分子生物学和生物技术的发展，特别是PCR技术的出现，20世纪90年代以后，分子生物学技术在松材线虫研究方面应用的报道开始增多。研究多集中在松材线虫的鉴定、系统演化，以及抗线虫策略等，而常用的分子生物学技术有RAPD、RFLP、AFLP和SSCP等4。2松材线虫分子生物学的研究基础对松材线虫分子生物学的研究，有对整个基因组DNA(enomic DNA)的研究，也有对线粒体DNA（mitochondrial，mtDNA）、核糖体DNA (ribosomal，rDNA)及卫星DNA(satellite DNA，satDNA)等特定部分DNA的研究。其中线粒体DNA和核糖体DNA因为存在多个标记基因,在分子系统研究中应用较多。线粒体DNA为双链闭合环状，长13-16 kb，包括12个蛋白质基因、2个rRNA基因和22个tRNA基因，及1个富含AT核苷酸二聚体的非编码序列5。线粒体DNA缺少组蛋白的保护，暴露于大量氧自由基中，易受诱变，因而变异较明显，被用于种及种以下关系鉴别和反映较短时间内的系统演化6。核糖体DNA是核DNA基因组中度重复簇的一个组分,在基因组中有100-500个拷贝,总长度为7-13 kb。核糖体DNA是由核糖体RAN基因及与之相邻的间隔区组成,其基因组序列从5到3依次为：外部转录间隔区（external transcribed spacer，ETS）、18S基因、内部转录间隔区1（internal transcribed spacer， ITS1）、5.8S基因、内部转录间隔区2（ITS2）、28S基因和基因间隔序列（intergenic spacer ，IGS）7。其中ITS作为分子分类还具有以下优点：快速的协同进化，适合种及种下水平的分子分类研究；变异以点突变为主,变异位点相互独立；通过两旁rDNA保守序列上的通用引物，可以对广泛种类的线虫进行PCR扩增和测序，作为线虫分类的通用标记；另外，由于多拷贝，需要的样品量少，通过PCR扩增可对单条线虫鉴定分析。在核糖体DNA中，其基因间隔区IGS的序列变化最大，使生理小种之间差异显著，但在松材线虫的研究中，目前应用IGS区作为对象的不多，而多集中在ITS区等其他区段上。对卫星DNA研究，虽没有像线粒体DNA和核糖体DNA那么热门，但基于其高重复性，以及不参与“翻译”，而具有相当可变性的特点，也有许多研究是着手于卫星DNA的。3基于各部分DNA的研究3.1、基因组DNA郑经武等用40个10聚体随机引物对松材线虫和拟松材线虫进行种间和种下群体的随机扩增多态性DNA分析(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD）。通过扩增及多态性比较，发现其中8个引物能在种间和种内不同群体间产生差异片段，而引物P253在两种中均能产生具有种特异性的标记，在松材线虫株系中可得到700bp左右的片段，在拟松材线虫中则得到1300bp和1900bp两个片段。但由于所研究的拟松材线虫只有一个株系，在其他株系中能否产生相同的分子标记还有待验证8。汪来发等同样用RAPD技术对18个松材线虫株系、8个拟松材线虫株系的基因组DNA多态性进行研究。结果表明，松材线虫和拟松材线虫种间表现极高的遗传多样性，每个株系对每个引物都有独特的DNA谱带9。根据聚类分析结果，他们认为松材线虫可能最初从北美传到日本，然后北美和日本的松材线虫再传入中国，因为中国有的株系，分别与北美或日本的某些株系关系较近。3.2线粒体DNA在线虫研究中，应用mtDNA保守片段或特异片段的报道不少，主要针对的都是根结线虫、胞囊线虫、食蚊罗索线虫、优雅新杆线虫和猪蛔虫等，但在松材线虫的研究中应用的不多。张路平等对7个株系的松材线虫和2个株系的拟松材线虫的mtDNA序列进行了RAPD分析，结果显示松材线虫和拟松材线虫种间和种内都表现出很大的差异，但种间差异明显大于种内差异，支持松材线虫和拟松材线虫是两个不同的种10。聚类分析的结果也显示了这两者属于不同的类群，其中松材线虫类群又可分为两个亚组，一个以日本株系为代表，另一个以北美株系为代表。与基因组DNA相比,mtDNA碱基序列短，在细胞内系列拷贝多，限制性内切酶酶切后，琼脂糖电泳，可直接或经Southern杂交后观察其片段的差异，因此适合限制性片段长度多态性(RFLP)分析11。3.3核糖体DNA目前对松材线虫鉴定及种系发生的研究大多集中在rDNA所编码的一些基因及ITS区域的同源性分析。在对松材线虫的不同株系的研究中还发现，中国、日本和美国的样本之间的遗传距离近，但与加拿大样本的遗传距离较远，而另一种日本非致病型松材线虫和加拿大松材线虫的差别不明显。张立海等对线虫的rDNA的ITS1区测序结果显示：松材线虫种内区别很小，不超过1 bp；拟松材线虫种内区别大，最大达7 bp，但这两种线虫的种间差异达32-39 bp12。随后，他又对14种松材线虫和拟松材线虫的样本做了单链构型多态性( SSCP)分析。该技术利用PCR扩增某一特定的DNA片段，高温下使双链DNA变性成单链DNA(ssDNA)，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，ss-DNA谱带在凝胶中位置的差异反映了DNA序列的差异18。一般来说，SSCP分析的单链DNA片段越小，检测的敏感性就越高。对小于200bp片段，SS-CP可发现其中70%的点突变；对于300 bp左右的片段，可发现其中50%的变异；而对大于500 bp的片段,则仅可检出10%-30%的点突变。将线虫ITS1区扩增的片段长度调节到400 bp左右，此时利用SSCP对ssDNA点突变的敏感性，可区分松材线虫和拟松材线虫，两者差异达32-39 bp，同时也有潜力区分拟松材线虫中的亚洲样本和欧洲样本，种内差异为7 bp。3.4、卫星DNA对单条线虫的精确鉴定，也有一部分工作是建立在利用卫星DNA的基础上。如Piotte等在鉴定根结线虫时，利用其卫星DNA的特异性引物成功地把北方根结线虫、花生根结线虫和南方根结线虫区分开；同时还区分了北方根结线虫的3个地理小种。在松材线虫的研究中,Tares、Abad等曾先后用Msp卫星DNA作为虫种特异性探针，成功地检测出压碎在滤纸上的单条线虫。这种方法如结合PCR扩增来检测松材线虫将更为有效。Piotte等认为在对非常相近的种进行多态性分析时，克隆卫星DNA是一种有效的方法。4、结语松材线虫病是国际公认的林业特大毁灭性病害，自发现以来，世界上对该病已进行了较长期的广泛研究，并取得了较多的研究成果。目前对松材线虫病的防治没有特别有效的方法，主要是利用高效的内吸性杀线虫剂进行树干打孔注射或者根部浇灌。利用遗传物质DNA对线虫分类，是20世纪80年代随分子生物技术发展而发展起来的，主要用于鉴定经济上比较重要的植物病原线虫，其中包括松材线虫。相信随着科学技术的迅速发展，多学科的相互渗透及对该病更深人细致的研究，一定能够在松材线虫病的诊断技术上取得突破性进展。参考文献：1 杨宝君,朱克恭,周元生,等.中国松材线虫病的流行与治理C.北京:中国林业出版社,1995.2 郭道森,赵博光,李周直.松材线虫病致病机理的研究进展J.南京林业大学学报,2000，24(4):64一68.3 陈玉惠,叶建仁,魏初奖.松材线虫病诊断方法研究进展 A .南京林业大学学报，2001，25(6):83一87.4 吴姗,吴蓉,林晓佳,等.分子生物学技术在松材线虫研究中的应用.植物保护,第31卷第5期（2005）:15-19.5 徐芬,王国秀,曹文博.线虫线粒体DNA结构及分子生物学特性J.生命的化学,2004,24(20): 115-117.6 余道坚,邓中平,陈志粦,等.昆虫分子标记基因和序列及应用J.植物检疫,2003,17(3): 156-159.7 赵鸿,彭德良,朱建兰. rDNA-ITS-PCR技术在植物寄生线虫分子诊断中的应用J.植物检疫,2004,18(2): 100105.8 郑经武,许建平,吴良玉,等.松材线虫和拟松材线虫种间及种下群体的指纹分析J.浙江农业大学学报,1998,24(6):597-601.9 汪来发,王扬,杨宝君,