核酸分子杂交技术2010-11-04.ppt

1 核酸分子杂交技术 严永敏细胞与分子诊断系 yym 2 目录 基本原理核酸探针核酸分子杂交技术 3 变性 在热 酸碱或变性剂作用下 DNA双螺旋的氢键断裂 解离为两条单链DNA的现象称为变性 变性的特征生物学活性丧失 增色效应 核酸的变性与复性 4 磷酸二酯键 DNA和RNA的一级结构 5 DNA解链曲线 增色效应 hyperchromiceffect 核酸分子加热变性时 其在260nm处的紫外吸收急剧增加的现象 Tm值 当紫外吸收变化达到最大变化的半数值时 此时所对应的温度称为熔解温度 Tm 变性温度或中点解链温度 6 影响Tm值的因素 1 溶液的性质2 DNA中碱基组成的影响 大肠杆菌DNA在不同浓度KCl溶液下的熔融温度曲线 7 复性 复性 变性DNA分开的两股链在适当条件下重新生成双链结构的过程退火 annealing 热变性的DNA经缓慢冷却复性的过程 淬火 热变性的DNA骤然冷却的过程 8 分子杂交 当两条不同来源的单链核酸分子DNA RNA或DNA DNA链之间存在互补的碱基序列时 通过碱基互补配对形成双链杂交体的过程 称为分子杂交 molecularhybridization 分子杂交图 9 10 概念 用同位素或其他化学方法标记的与待测靶核苷酸序列互补杂交的核酸片段 DNA或RNA 用途 检测待检核酸样品中的特定基因序列 DNA DNA DNA RNA RNA RNA 要求 特异性 来源方便 第二节核酸探针 11 hybridization DNA DNA5 ATGCCGAT3 TACGGCDNA RNA5 ATGCGTA3 UACGCAURNA RNA5 AUGCUACG3 UACGAUGC 12 1 基因组DNA探针 2 cDNA探针 3 RNA探针 核酸探针的类型 4 寡核苷酸探针 13 一 基因组DNA探针1 来源 这类探针来源于某种生物的基因组多为某一基因的全部或部分序列 2 制备方法 1 基因克隆的方法 2 聚合酶链反应 PCR 14 3 特点 1 多克隆在载体中的DNA片段 可以无限繁殖 取之不尽 2 相对RNA而言 DNA探针不易降解 标记方法也较成熟 15 二 cDNA探针1 制备 cDNA文库中筛选 2 特点 不存在内含子和高度重复序列 是一种较理想的核酸探针 尤其是用于基因表达的研究 16 三 RNA探针 特点 1 单链探针 效率高 灵敏度高 2 RNA RNA RNA DNA更稳定 特异性高 3 不稳定 易降解 17 四 寡核苷酸探针特点 根据需要来合成相应的核酸序列 避免天然探针的缺点 大多数长度一般为20 50bp 由于探针的长度较短 特异性较低 杂交信号较弱 18 常用的探针标记物 放射性同位素 3H 32P 35S 125I等 核酸探针的标记 特点 灵敏度高 特异性高 检出限 1 10ug 环境污染 半衰期短 19 常用放射性核素的物理性质 非放射性 20 FITC异硫氰酸酯 TRITC硫氰酸四甲基罗达明 人染色体不同荧光素染色结果 非放射性同位素 荧光染料 地高辛素 辣根过氧化酶 碱性磷酸酶等 21 缺口平移标记法示意图 酶促法1 缺口平移法 nicktranslation 探针标记方法 22 2 随机引物法 randompriming 人工合成6 8bp各种不同排列顺序混合物引物在DNA聚合酶作用下 合成与探针DNA互补的DNA链 当在反应液中加入一种被标记dNTP时 即可形成标记的DNA探针 但探针DNA序列是长短不等的 优点 比活度高 结果稳定 23 随机引物标记法示意图 24 3 DNA探针的末端标记 1 Klenow大片段的末端标记法 323个氨基酸 小片段 5 核酸外切酶活性 大片段 Klenow片段 604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 25 利用KlenowDNA聚合酶标记3 端DNA探针 26 2 多核苷酸激酶标记法 polynucleofidekinase PNK 多核苷酸激酶标记法示意图 不能进行非放射性标记 27 DNA半抗原标记探针的检测 显色系统 碱性磷酸酶 NBT辣根过氧化物酶 DAB 底物 非放射性探针的检测 四唑硝基蓝 二氨基联苯胺 28 制备特异性探针所需要的基本条件 1 被检基因结构清楚 2 有明确的基因产物 3 已知某一基因产物 具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针 29 第三节核酸分子杂交技术 30 1 tissue SDS ProtK PhenolChloro ETOHSpin 一 Southern印迹杂交 31 毛细管转移示意图 电转移示意图 32 Northern印迹杂交流程图 二 Northern印迹杂交 33 Southern杂交结果 Northern杂交结果 34 基因表达产物的检测Western印迹法 蛋白质水平上的杂交技术 又称为免疫印迹 即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合 经放射自显影显示条带 根据条带密度确定蛋白质表达量 优点 分辨率高 1 5ng 特异 简便 稳定 35 准备PAGE胶 样品的制备 加样 SDS PAGE 蛋白先定量 蛋白质的电转移 抗体结合与显色检测 判断结果 实验流程 36 聚丙烯酰