DGGE 指纹图谱分析太湖富营养化水体中细菌群落结构的变化.doc

DGGE 指纹图谱分析太湖富营养化水体中细菌群落结构的变化摘 要太湖作为我国第三大淡水湖泊，其富营养化程度日益加深。太湖水体水质不断变差，生态系统遭到严重破坏。在自然界中，微生物之间及其与环境之间有着特定的关系，彼此影响，相互依存。因此，研究环境中的微生物组成对于富营养化湖泊的生物监测和生物修复具有重要意义。淡水生境中存在大量不可培养的细菌，使得传统的培养技术无法对细菌群落结构的多样性进行深入而全面的研究，而分子生物学技术的发展则为此方面研究开辟了新的路径。为了探究严重富营养化水体的细菌群落结构组成，本文运用PCR-DGGE 方法对太湖水体的细菌群落结构进行了分析。本文采集太湖不同地点(梅梁湖、东太湖和南部沿岸区)、不同月份(06年4 至9 月)的表层水样，提取细菌总DNA，采用引物357F-GC-clamp和518R 进行PCR 扩增。实验结果表明，PCR 扩增产物的特异性会对DGGE 实验产生至关重要的影响，包括选择适合的引物及其浓度、适当的模板浓度，确定初始退火温度和总循环数。变性剂梯度被确定为40%55%。DGGE 图谱的初步分析结果表明，太湖水样中的菌种丰富度非常高，并且不同取样时间和不同取样地点的DGGE 带谱在条带的数量、位置及条带的亮度上均存在较大的差异。Quantity One 软件包定量分析表明，太湖水样的细菌群落结构组成主要分为四种类型，即冬季期、水华发生期、水华暴发期和严重水华期。梅梁湖作为太湖流域富营养化最严重的区域，其细菌群落结构较东太湖和南部沿岸区存在明显的差别。17 条典型条带的测序结果显示，序列属于放线菌、 、 -变形杆菌、拟杆菌、热微菌和蓝细菌。值得注意的是，3 条序列的最相似菌为来自梅梁湖克隆文库分析中得到的序列，且相似度均大于98%。系统进化分析表明大部分序列属于被广泛定义的公认的淡水细菌群落。本文还运用了主成分分析和典型相应分析两种统计学方法。主成分分析结果证明了太湖水体中细菌群落结构存在显著的季节性变化。典型相应分析结果表明温度对于细菌群落组成的相关程度是最大的。此外，氮、磷、碳三类元素的含量同细菌群落结构的关联度也较大。关键词： 细菌群落结构，变性梯度凝胶电泳，16S rRNA，太湖，统计学分析CHANGES IN BACTERIAL COMMUNITY STRUCTURE OF A HYPERTROPHIC FRESHWATER LAKE TAIHU,DETERMINED BY DENATURING GRADIENT GELELECTROPHORESIS FINGERPRINT ABSTRACTLake Taihu, the third-largest lake in Peoples Republic of China, is atypical shallow freshwater lake. Due to agricultural intensification andexcessive exploitation, its trophic status was increasingly getting aggravated.Water quality was getting worse and the ecosystem was declining. In nature,there are extraordinary relationships among microorganisms and between microorganisms and environments. Due to the lack of cultured bacteria in aquatic ecosystems, the diversity of bacterial communities has not been extensively studied. However, developments in molecular biologicaltechnology bring a new path for scientists to investigate bacterial communities. In order to describe a complete picture of the structure ofbacterial communities in a hypertrophic freshwater lake, PCR-DGGE method was applied to study water samples from Lake Taihu.Water samples were collected with different locations (Eastern, southernand northern part of Lake Taihu) and different months (From April toSeptember in 2006). After DNA extraction, the DNA was used as template to amplify 16S rRNA gene with universal primers 357F-GC-clamp and 518r.Results indicated that nonspecific amplification could have a bad influence to DGGE process. The factors, which might lead to a bad amplification,included the type of primers and their concentrations, concentration of template, annealing temperature and total cycles. The gradient of denaturant was finally confirmed as 40%-55%. Analysis of DGGE fingerprint revealed that richness of bacteria in Lake Taihu was relatively high. Distinct differences were detected in fingerprint at band numbers, band patterns anddensities with different sampling sites and different sampling months.Quantitative analyses by Quantity One software package showed that therewere four major types of bacterial community structure in Lake Taihu,including winter period, beginning period, happening period and heavy period.As an important hypertrophic part of Lake Taihu, Meliang Bay was found differently to other two locations in bacterial community composition.Seventeen typical bands were excised and sequenced. The sequences obtained were affiliated with Actinobacteria, -, -, -Proteobacteria, Bacteriodetes,Thermomicrobia and Cyanobacteria. Remarkably, the most relative representatives of three sequences came from a previous study based on clone library method to investigate bacterial community composition of Meiliang Bay. The similarity was above 98%. According to phylogenetic analysis, these sequences could be grouped to previous putative freshwater clusters. Two statistical methods, principal component analysis (PCA) and canonical correspondence analysis (CCA), were carried out for further analysis.Seasonal changes of bacterial community structure in Lake Taihu could be confirmed based on PCA. Results of CCA indicated that bacterial community structure of Lake Taihu was primarily associated with temperature, followed by nitrogen, phosphate and carbon.KEY WORDS ： bacterial community structure ， denaturing gradient gel electrophoresis，16S rRNA，Lake Taihu，statistical analysis第一章概 述1.1 太湖流域现状太湖是我国第三大淡水湖泊，位于长江下游沪、宁、杭三角带中心，地处北纬30553134，东经1195312036，流域面积达3165万km3，人口约为3770万，拥有大小城市38座，人口密度达1030人/km3，是全国人口最稠密、工农业生产最发达的地区之一，城市化水平占全国之首。太湖流域经济发达，GDP占全国的1/8，财政收入占全国的1/6，淡水鱼产量占全国的1/4。近20多年里，太湖流域经济快速发展，1995年以来，GDP年平均增长率已达到和超过10%。太湖的湖泊总面积达2427.8km3，其水面广阔，实际水面积为2338.1km3，平均水深1.89m，年吞吐量约53 亿m3。区域内河流荡漾密布，出入湖河流224 条，其中入湖河流70 多条，以苕溪、南溪及分散得港渎为主；出湖河流150 余条，以东太湖的太浦河与吴淞江为主。太湖水域是环湖地区城镇居民生活饮用水、工业用水、农业用水、渔业用水的重要水源，也是水上航运的通道。此外，太湖还是一个天然的巨大水库，在水位2.99m 时的库容为44.23 亿m3，在水位4.65m 时的库容约83 亿m3。太湖不仅接纳上游百川来水，下游湖东地区或遇暴雨，沥水也会倒流入湖。当长江水位高涨而通江港口无水闸控制时，江水也会分流入湖。由于湖面大，水位每上涨1cm，可蓄水2300 多万m3，故洪枯水位变幅小。一般每年4 月雨季开始水位上涨，7 月中下旬达到高峰，到11 月进入枯水期，23 月水位最低。由于湖水较浅，湖流微弱，环湖各河流构成的密集水网，进出湖流向往往顺逆不定，这一特有的水文地理特征使太湖水体稀释自净能力降低并极易受到来自工业、农业和生活等诸方面的污染，流域内水质普遍下降的问题也日益突出。到20世纪90年代中期，太湖的平均水质从80年代的I类为主变为以IV类为主，局部湖区已处于V类或劣于V类，水质下降了2个等级。水体营养状态也由80年代的中营养-中富营养转为以富营养为主，十年内富营养化上升了1.52个等级。水质监测显示，近年藻类数量比十年前增加了5倍，总磷、总氮比1960年增加了67倍(表1-1)，且藻类出现时间趋早，历时趋长，范围趋广。1990年夏，太湖蓝藻爆发，北部沿岸水域形成0.5m厚的藻类聚集层，迫使无锡市2家水厂和116家工厂停产，直接经济损失1.3亿元。1994年夏，蓝藻再度爆发，无锡梅园、马山水厂取水口被大片蓝藻包围，水质腥臭，造成市民用水困难。2000年7月太湖蓝藻又一次大面积爆发，其直接原因就是太湖湖体水质富营养化。太湖水体富营养化已严重危及人们正常生产和生活秩序。太湖流域能否维持良好的生态平衡，环境和经济能否持续、协调发展这一突出矛盾已经摆在我们面前，成为广大环保工作者面临的重要课题。1.2 富营养化的成因与危害随着城市化和工农业生产的发展，大量富含氮、磷等营养物质的城市污水、工农业废水流入自然水域，使水体中营养物质迅速富集，导致某些藻类特别是蓝、绿藻过度增殖，水体透明度下降，溶解氧含量降低，水质恶化，严重时发生“水华”，水变腥变臭，大量水生生物死亡，这就是水域富营养化现象，其经常发生在湖泊、海湾等相对封闭，水流缓慢的水体。据美国环保局的评价标准2，水体总磷大于2025mg/l，叶绿素a大于10mg/l，透明度小于2.0m，深水溶解氧小于饱和溶氧量的10%的湖泊可判断为富营养化水体。国际湖泊环境委员会曾对世界主要湖泊开展调查，普遍存在有富营养化现象。淡水水域富营养化会破坏水生态系统的平衡，影响饮用水的使用，破坏景观，严重时更会使水域生产力大大下降，水产品质量受损。1.2.1 营养物质的主要来源2 工业废水：富营养化的水体中含有较多的氮和磷，它们首先来自工业废水。近年来，工业排放的废水逐年递增，钢铁、化工、制药、造纸、印染等行业的废水中氮和磷的含量都相当高。但由于技术与资金的原因，大部分工业废水只经简单处理甚至未经任何处理就直接排入江河等水体中，废水中所含的氮、磷等物质也就不断地在水体中累积了下来。 生活污水：人们在日常生活中产生了大量的生活污水，生活污水中含有大量富含氮、磷的有机物，其中的磷主要来自洗涤剂。据估计，我国人口人均体内排除的磷约1g/天， 每天消耗的洗衣粉中的磷为0.21g。另一方面，污水作为一种可靠的水源和廉价的肥料常被用于灌溉农田，是污水农业利用的一种提倡方式。但由于一些污水中的营养物含量较高或技术原因，常常造成土壤和地表水的污染。 水土流失和农业施肥：不同地形集水区和不同肥力土壤输出的氮、磷量不同，水土流失提高了水体中营养物质的含量。此外，现代农业生产中大量使用化肥和农药，在很大程度上污染了环境。残留的农药和化肥在土壤中积累，其中所含的氮、磷营养物可随地表径流进入地面水体中或下渗，通过土壤进行横向运动，然后排入地表水体中，这也是导致地表水富营养化的重要原因。氮和磷还会在运动中随土壤颗粒沉积下来，成为湖、河或海底沉积物的一部分，沉淀在底泥中的污染物可以通过再悬浮、溶解的方式返回水中，构成水源的二次污染。 畜牧业、渔业：在一些畜牧业发达的地区，畜牧排泄会产生大量营养物质进入土壤，圈养家禽、家畜也会产生大量富含营养物和细菌的排泄物。这些排泄物极易随地表径流、亚表面流流入江河、湖泊而造成水体的污染。随着水产养殖业的发展，许多水体成为人工养殖的场所。人工投放的饵料以及鱼类的排泄物给水体带来了大量的氮、磷。近年来，湖泊、水库等大水面养殖发展也很快，并应用池塘高产技术和大水面优越的生态条件相结合发展“三网”养殖，虽然提高了水产品的质量和数量，但加速了我国湖泊水库富营养化的进程。 城镇与矿区地表径流：城镇路面大部分是不透水地面，由人类生活垃圾、生活污水及某些工业废水所携带的氮磷营养物易随地表径流进入地表水中。美国环保局把城市地表径流列为导致全美河流和湖泊污染的第三大污染源。在磷矿区，人类活动破坏了原来的土壤结构和植被面貌，使土壤表层裸露。在降雨条件下，散落在矿区的矿渣、泥沙、磷酸盐等污染物随地表径流进入湖泊、水库、江河、海湾，从而导致水体污染。 大气沉降：大气沉降不仅是悬浮颗粒物、有害气体的来源之一，也是氮的来源之一。燃料燃烧时，氮元素以氮氧化物的形式进入空气，随雨雪降落在土壤或水体表面，污染地表水源。随着大气污染日益加重，大气沉降也成为水域富营养化的原因之一。1.2.2 富营养化的危害 赤潮和水华现象：水体发生富营养化现象时，水体中某些微小的浮游植物、原生动物或细菌开始大量繁殖和生长，在一定的环境条件下发生突发性地增殖和聚集，随着藻类及浮游生物种类和数量的不同，水体反映出不同的颜色，一般由占优势的浮游生物的颜色决定，如蓝色、红色、棕色和乳白色等。这种富营养化现象发生在江河湖泊叫做“水华”，发生在海洋叫做“赤潮”。一旦发生赤潮或水华，水体中藻类及浮游生物和绿色植物迅速繁殖，使水体透明度下降，溶解氧减少，水质恶化，有些赤潮生物还会分泌出粘液，粘在鱼、虾、贝等生物的鳃上，妨碍呼吸，导致鱼类及其他水生生物大量死亡。其次，含有毒素的赤潮生物被海洋生物摄食后能引起中毒死亡，人类食用含有毒素的海产品，也会造成类似的后果。第三，大量赤潮生物死亡后，在尸骸的分解过程中要大量消耗海水中的溶解氧，同样会造成缺氧环境，引起虾和贝类的大量死亡，导致水产养殖业的灾难性后果。目前，赤潮已成为一种世界性的公害，美国、日本、中国、加拿大、法国、瑞典、挪威、菲律宾、印度、印度尼西亚、马来西亚、韩国和香港等30多个国家和地区赤潮发生都很频繁。我国自1933年首次报道以来，至1994年共有194次较大规模的赤潮，其中60年代以前只有4次，1990年后则有157起。 影响水体的处理和利用：水体富营养化现象一旦出现，水就不能被人畜直接利用。由于水中的藻类会大大提高化学需氧量(COD)、生物需氧量(BOD)、悬浮固体(SS)等的浓度，使得水处理的负担增大不少。藻类在过滤时会堵塞滤料，在氯化消毒时产生三卤甲烷(THMs)等有毒副产物。藻类代谢物如糖酸等，在混凝过程中与混凝剂反应，降低处理效果，增加混凝剂用量，而生成的络合物又会导致管网腐蚀。因此，富营养化水体作为饮用水源会严重影响水厂的工艺运行，腐蚀管网，危害出水水质。此外，大量生物和有机物残体沉积于水的底层，在缺氧情况下，被一些微生物分解，产生甲烷、硫化氢等有害气体。富营养化的水体中还存在能使人畜中毒受害的亚硝酸盐和硝酸盐物质。出现富营养化现象的水体，不仅严重影响了水体的处理和利用，造成水生经济生物(如鱼类)的损失，而且恢复水体的清洁需要相当长的时间。 加速水体沼泽化、陆地化进程：湖泊沼泽化是指湖泊淤积变浅，大量水生植物生长和埋藏，发展成为沼泽的过程。由于富营养化的水体含有大量营养物质，使得藻类和水生生物大量生长和繁殖，加速了水体沼泽化和陆地化进程，破坏了特定地区的生态平衡。湖泊沼泽化是湖泊衰老消亡的最后一个阶段，如目前东太湖已沼泽化。近年来，为了缓解太湖富营养化状况，国家采取了很多措施。1998 年的“零点行动”并未产生明显效果。监测表明，2000 年全年平均太湖29%为中富营养水平，71%已达富营养水平3。据2004 年中国水资源公报报道，太湖中营养水平的面积占23%，富营养占77%。这说明以控制工业污染排放为主要途径的治理措施，对于太湖的富营养化问题已经很难达到预期的效果。近三年来，太湖流域管理局积极组织“引江济太”调度，引长江水入流域，以清释污。“引江济太”调活了流域水体，加快了水体置换，从一定程度上改善了太湖水质。1.3 变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)水生生态系统中，微生物群落是生物地球化学循环的基础结构，对微生物群落结构演变的研究和评价非常重要4。自然界中任何环境条件下的微生物，都不是单一种群，微生物之间及其与环境之间有着特定的关系，彼此影响，相互依存，构成微生物生态系统(Microbial Ecosystem)，它是具有一定结构和功能的开放系统。微生物的种群和数量组成了微生物生态系统的结构，而微生物与环境之间的相互作用过程所表现出的宏观效应构成了微生物生态系统的功能。但我们对于维持这种平衡的微生物生态系统的构造和动力学参数知之甚少，其中最大的原因就是，传统的研究方法是通过纯培养获得菌株后才能对其特性进行描述，然而研究表明自然环境中，可培养微生物仅占自然界微生物的0.1%15%左右5。纯培养技术的局限性使得自然界的大多数微生物特征很难被具体描述。近年来基于DNA 方法的群落分析得到了迅速的发展6,7，如PCR 扩增技术，克隆文库法，荧光原位杂交法8,9，限制性酶切片段长度多态性法10, 11，变性和温度梯度凝胶电泳法12。多种分子生物学技术的发展使得我们可以摆脱纯培养条件的束缚，开辟了一条更客观的探索环境中微生物多样性的新思路(图1-1)。这些方法克服了微生物培养技术的限制，能在遗传本质的层面上对微生物群落进行较客观的分析，较精确地揭示了微生物种类和遗传多样性。变性梯度凝胶电泳(DGGE) 技术是由Fischer 和Lerman 于1979 年最先提出的用于检测DNA 突变的一种电泳技术。它的分辨精度比琼脂糖(Agarose)电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)更高，可以检测到一个核苷酸水平的差异。1985 年，Myers 等13首次在DGGE 中使用“GC 夹板”和异源双链技术，使该技术日臻完善。1993 年Muzyer等12首次将DGGE 技术应用于分子微生物学研究领域，并证实了这种技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性。由于DGGE 技术避免了分离纯化培养所造成的分析上的误差，通过指纹图谱直接再现群落结构，目前 已经成为微生物群落遗传多样性和动态性分析的强有力工具。其优点如下： 检测极限低 检测速度快、经济 结果比较客观 可同时检测多种微生物，分析多个样品 能与其它多种方法结合1.3.1 变性梯度凝胶电泳的原理与普通电泳不同，DGGE不是基于核酸分子量的不同将DNA片段分开，而是根据核酸序列的不同，将片段大小相同的DNA序列进行分离。双链DNA分子中A、T碱基之间有2个氢键，而G、C碱基之间有3个氢键连接，因此A、T碱基对对变性剂的耐受性要低于G、C碱基对。由于这四种碱基的组成和排列差异，使不同序列的双链DNA分子具有不同的解链温度。当双链DNA分子在含梯度变性剂(尿素、甲酰胺)聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，因其解链的速度和程度与其序列密切相关，所以当某一双链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其解链温度时，即开始部分解链(图1-2)。在DGGE中，这种情况的发生是因为凝胶的温度保持不变，各个结构域的解链根据凝胶中变性剂的浓度而变化，随之在凝胶中的位置也变化。当DNA进入含足够变性剂的凝胶区域时，双螺旋分子转变成部分解链分子，结果产生分支分子，这种分子明显地降低DNA片段的迁移率。特定结构域中的序列变化改变其解链行为。这样，不同PCR扩增产物会在变性梯度中的不同位置停止迁移(图1-3)。使用富含GC的序列或GC夹板(GC-clamp，由富含GC序列的3050个碱基组成)可防止PCR产物完全解链。GC夹板一般连接在正向引物的5端。要想使DGGE 达到最佳效果，就有必要了解与待测DNA 片段有关的解链性质,同时应选择用于检测DNA 的最理想的变性浓度范围以及电泳时间。根据垂直DGGE或计算机计算可以得到的结果来确定待测DNA 片段的最理想的电泳条件。1.3.2 DGGE 技术的关键环节和系统优化14根据变性剂梯度方向的不同，DGGE可分为：a.垂直DGGE，其变性剂梯度同电场方向垂直，常用的变性剂浓度梯度范围比较宽，如0%100%，20%70%，主要用于试验决定分离野生型和突变型的最佳变性剂梯度范围；b.平行DGGE，其变性剂的梯度同电场的方向平行，常用的变性剂浓度梯度范围则比较窄，以便更好的分离DNA片段，主要用于解链范围明确的DNA片段的检测。目前，应用在环境微生物样品分析的主要是平行DGGE。若使DGGE技术对DNA片段达到最佳的分离效果，必须了解与待测DNA片段相关的解链性质，选择适合检测该DNA片段的最理想的变性剂浓度范围以及电泳时间。 最佳变性剂梯度的选择为使仅有一个碱基之差的不同DNA片段取得最佳的分离效果，可以用垂直变性梯度实验来选择所要研究的DNA片段的解链性质和变性剂浓度梯度。在垂直变性梯度电泳实验中，电泳方向与变性剂梯度线性增加方向垂直。加样孔是一个占胶板整个宽度的单一大孔(与梯度方向平行)。从低浓度变性胶的一侧进胶的DNA片段，由于未与变性剂发生作用，DNA片段未解链，DNA以双链分子形式迁移较远。DNA片段在高浓度变性剂一侧进胶后在电泳过程中几乎不能移动，此时DNA分子已大部分解链，单链DNA分子在电场中停止运动。中等变性剂浓度导致DNA片段不同的解链程度，因此会停留在胶板的不同位置，观察到中等移动速率的DNA片段。电泳后经染色处理，DNA片段经凝胶成像系统呈现出一条清晰的“S”型曲线。变性剂梯度范围应选在垂直实验曲线斜率较大的部分，这时多数分子处于部分变性状态，此时的位置相当于它所代表的解链区域的Tm (解链温度)值，这使得落入低温解链区的不同分子达到最佳分离状态。这种电泳胶提供了有关DNA片段解链区数目及相对Tm值的信息。选择水平胶的条件可包括Tm左右约10的范围区内，10相当于30%范围的变性剂。根据这些要点便可设计具有多个样品孔的平行变性梯度胶，在最佳条件下进行靶片段的分析。 最佳电泳时间和温度的确定DGGE系统要求在聚丙烯酰胺凝胶中对待测DNA片段进行电泳，电泳的温度要低于待测解链区域Tm值。对绝大多数天然的DNA片段5065是比较适合的。最佳解链温度是由平行凝胶电泳实验确定的。变性剂梯度由胶板的顶端向底端线性增加，电泳方向平行于变性剂梯度变化方向。平行DGGE技术适用于多个样品的比较分析。样品分析之前，首先要将待测样品以恒定的时间间隔在同一块胶版上点样，跑胶。根据DNA片段的分辨情况来确定电泳时间。电泳的时间长短与系统的电压密切相关，一般来讲采用低电压，则电泳时间要长一点，采用高电压则相反。DNA片段为200bp左右，通常在电压为150V时,电泳4h可以达到良好的分离效果。目前，计算机程序预测解链性质，节省了对目标DNA片段的分析所占用的大量时间。这些程序以寡核苷酸溶解性的研究及解链理论为基础，可模拟和任何已知序列DNA 解链温度有关的解链行为、最佳凝胶电泳时间及任何碱基改变对解链图象产生的预期影响。可用WinMelt/MacMelt (/es/melt.html)，TGGE-STAR (http:/www.charite.de/bioinf/tgge/)和Poland analysis (http:/www.biophys.uni-duesseldorf.de/local/POLAND/poland.html)等软件进行分析。 “GC夹板”技术由于DNA分子中的G、C碱基对要比A、T碱基对结合得牢固，因此G、C含量高的区域具有较高的解链温度。基于这一原理，“GC夹板”(GC-clamp)技术是将一段长度为3050bp富含G、C的DNA碱基片段附加到双链的一端以形成一个人工高温解链区。这样，DNA片段的原有部分就处在低温解链区从而可以实现更好的分离。常规的DGGE电泳技术对于长度超过500bp的DNA片段的序列变化情况，只能有50%的检出率。应用“GC夹板”技术可使检出率提高到100%。表1-3中列出了常用的“GC夹板”碱基片段。DGGE电泳技术中，“GC夹板”技术的引入方式主要有两种：一种是应用含有“GC夹板”的特定引物进行PCR扩增，此方法要使用校对功能的聚合酶(Proof reading polymerase)以防止引入人为突变。另一种是在PCR反应中加入“GC夹板”，“GC夹板”在此反应中充当接头或夹式引物。 染色技术核酸电泳后需要进行染色才能呈现出带型和指纹图谱，最常用的是溴化乙锭染色法和银染法。由于聚丙烯酰胺对溴化乙锭(Ethidium bromide, EB) 具有熄灭作用，因此导致灵敏度大为降低，人为缩小了微生物多态性，导致分析误差。同时EB是强致变剂，不利于身体健康。银染法是通过银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，再使用还原剂如甲醛使银离子(Ag+)还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色，其灵敏度比EB高200倍，是目前最灵敏的方法。但银染法不易回收DNA，无法进行后续的杂交分析。近年来，相继出现了SYBR Gold、SYBR Green I和SYBR Green II等新一代荧光核酸凝胶染料，这类染料的背景极低，可以帮助更好的观察微量的条带。致突变性远低于EB数倍甚至数10倍，几乎具有银染的超高灵敏度。由于该染料渗透入凝胶的速度极快，无须脱色，因此使染色过程更加简便，节省时间。虽然这种染料价格比较昂贵，但还是一类具有良好应用前景的荧光染料。显色后，凝胶上的条带可以在回收后用于测序，也可直接进行凝胶的杂交分析。1.3.3 DGGE 指纹图谱的分析16在获得DGGE图谱后，需要对图谱中条带的核酸序列进行分析，并对图谱进行统计学分析，阐述不同样品间的关系，从而合理的解释复杂的指纹图谱。随着DGGE的广泛应用，一些统计学方法也不断应用于图谱的分析。这些分析方法从不同角度对图谱进行归纳总结。如解释群落结构和演替规律，种群遗传多样性，优势条带的位置和强度分析等。无论选择哪种分析方法，对数据分析时得到的结论都应该是一致的。 DGGE图谱的统计分析目前很多凝胶分析软件都可以对DGGE图谱中的条带位置和强度进行简单分析，如Gel-Pro Analyzer，Quantity One和Image Tool等软件。无论如何利用条带的强度，是不能代表细菌数量的，只能根据条带的强度表示相对的趋势，但是这种趋势有时还是存在误差的。DGGE图谱可以作为一个多元变量数据，因此可以应用多元变量的统计学方法分析。应用这些统计学方法对不同微生物群落样品的DGGE结果进行分析，可以研究群落之间的相互关系。排序(Ordination)和分类(Classification)是群落生态学中两种主要的多变量分析方法。目前，对DGGE图谱分析中，较早应用的是聚类分析(Clustering)方法。聚类分析包括凝聚分层聚类分析、分解分层聚类和非分层聚类。目前，应用较多的是凝聚分层聚类分析中的非加权算术平均法(UPGMA)。有些凝胶分析系统整合了聚类分析功能(如Bio-rad Gel Document 3000)，通过自动或手动选带，可以生成聚类树。也可以手动选带生成矩阵数据，输入统计软件后完成聚类分析。排序方法也被广泛应用于群落分析。近几年， 多维尺度分析(Multidimensional scaling, MDS) 和主成分分析(Principal component analysis, PCA)在DGGE图谱分析中应用较多。主坐标分析(PcoA)是经典的公制尺度分析方法，在生物学中应用的较少，非公制多维尺度分析(NMDS)应用较多，而利用主成分分析解释DGGE图谱呈上升趋势。根据DGGE图谱手动选带后生成矩阵数据，输人统计软件SAS，SSPS，MiniTab和Statistics等均可以进行MDS和PCA分析。近来，一些研究者认为，不利用PCA等统计分析方法，可以直接观察到DGGE图谱不同样本间的显著差异，所以不需要进行统计学分析。如果样本很多，DGGE条带复杂，很难定义样本间的相似性，这时必须借助于统计学方法，所以要根据研究目的和具体情况选择适宜的分析方法。 DGGE图谱的核酸序列分析为了了解微生物群落结构和系统进化关系，通常需要切取DGGE图谱中的优势条带，获得序列信息。Vallaeys等发现DGGE法并不能对样品中所有的DNA片段进行分离。一个条带经常含有多种序列，所以在切取条带重新扩增后，需要对PCR产物进行克隆，然后测序。即使采取了d-PAGE和修补PCR方法，在一个条带中也可能包含共迁移的双链和单链DNA分子。另外，在没有人工产物产生时，较长的片段和具有高Tm片段，较短的片段和具有低Tm片段也会发生共迁移。这时我们无法确定选择多少克隆测序，以及哪个克隆是迁移位置的真实序列，因此，需要对克隆进行进一步验证。从一个切取条带的克隆文库中随机挑选一些克隆用带GC夹板的引物扩增，每个克隆的PCR产物再进行DGGE分析，检查与切取条带的迁移位置是否一致，选择一致迁移位置的克隆进行测序分析。如果条带过于复杂，则需要进一步提高DGGE的分离效果。还可以选择种属或者菌群的特异引物选择性扩增样品，这样可以降低样品的复杂性，从而降低DGGE 分析时条带的多样性。在获得条带的序列信息后， 可用CHECK-CHIMERA软件(2/cgis/chimera.cgi? su=SSU)进行嵌合序列评估，然后在GenBank中进行比对分析，搜索最相似的序列。将全部序列对齐后构建系统进化树，得到待测样品的系统进化或分类信息。1.3.4 变性梯度凝胶电泳的局限性17DGGE和其它方法一样也有它的缺点，除了微生物生态学中大多数分子生物学技术所面临的一般性可能的偏见外，DGGE也有它特殊的限制性，其中之一是只能分离较小的片段(达500bp) ，较长的片段分离率下降，限制了用于系统发育分析和探针的序列信息量。不过Vainio和Hantula发现，扩增不同真菌的1650bp 18S rDNA片段可通过DGGE获得较好的分离，作者解释为可能是较长分子中发生另外的变化补偿分辨能力的降低。关于分辨率问题，DGGE通常显示群落中优势种类的rDNA片段。1%左右的细菌种群可通过PCR-DGGE检测到。Yang和Crowley在研究与根不同部位相关的根际微生物群落结构中发现，产生于根的所有部位得到的单条16S rDNA带的克隆的序列分析揭示同一条带中有不同的种类，表明DGGE在种水平上鉴定细菌群落结构是有限的。Van Elsas等发现，依据NS2f/Fung5r-C引物对的PCR-DGGE方法适合评价真菌接种菌株的命运，但评价土壤中总的真菌多样性明显限制在对有限数量迁移类型的分辨。具有不同序列DNA片段的共迁移对从单条带中得到清晰的序列也是一个问题。再一个问题就是依据16S rDNA的DGGE研究群落多样性，由于某些种类16S rDNA的拷贝之间的异质性问题及异源核酸双链分子的检出可能会导致自然群落中细菌数量的过多估计。1.4 DGGE 在微生物生态学中的应用进展最初，DGGE在微生物生态学中的应用是用来监测复杂细菌群落的基因多样性12。经过近20年的发展和改进，DGGE的用途已经越来越广泛。Muyzer and Smalla18对相关的应用研究进行了详细的综述。1.4.1研究微生物类群的多样性从环境样品直接提取总DNA，经PCR扩增得到含有某一高变区的目的DNA序列产物，通过DGGE得到指纹图谱。因为每个条带很可能就代表一个不同的微生物物种，所以DGGE带谱中条带的数量，即反映出该环境微生物群落中优势类群的数量。但为了得到更详实的信息，往往采用种或类群专一性探针与得到的条带进行杂交或将条带切下，重新扩增后测序，进而得到部分系统发育信息。Muyzer等12首次应用DGGE研究了菌藻席和细菌生物膜中微生物的遗传多样性。在得到DGGE带谱后，将其印迹转移到尼龙膜上与硫还原细菌特异性探针进行杂交，与其中一样品的带谱出现了强烈的杂交信号，表明该环境中存在硫还原细菌。Ferris等19通过DGGE 对美国黄石公园一温泉中不同温度菌藻席中的细菌多样性进行比较。发现从相同温度采集的样品的DGGE带谱相同，而从不同温度得到的样品的带谱差异很大，表明其中的细菌多样性不同。通过对得到的DGGE条带进行测序并与纯培养及克隆得到的序列进行比较，探测到以往已得到的序列，同时还探测到一些尚不能确定其系统发育地位的细菌类群。1.4.2用于环境中微生物变化的动态监测DGGE 技术的一个显著特性就是可以同时对多份样品进行分析，因此适合于监测环境中微生物在时间或空间上的动态变化。Duineveld等20应用DGGE 研究了菊花生长过程中其根际细菌类群多样性的动态变化，发现生长过程中根际细菌类群的DGGE带谱通过UPGMA算法聚类分析，带谱之间的相似性为82%，没有发生显著变化，与同时通过纯培养方法进行研究的结果一致，因此认为根的生长过程对根际优势细菌类群的影响不大。Smit等21也应用DGGE对一麦田中优势细菌的多样性随季节的变化做了研究，结果显示不同季节样品的DGGE带谱有差异，但差异仅出现在较弱的条带上，表明麦田中的优势细菌相对稳定，但在较弱条带所代表的细菌类群上存在着较大差异。通过对带谱进行聚类分析,发现虽然其中的优势细菌类群相对稳定，但七月份的带谱与其它月份的明显不同，表明七月份麦田中的细菌多样性发生了某些变化。这一结果与通过纯培养得到的结果相同，虽然这两种方法可能探测到完全不同的细菌类群。1.4.3有助于发现新的微生物目前，自然界中可获得纯培养的微生物仅占1%15%，这些微生物只是易于在人工的营养条件及培养条件下形成克隆，并不一定是天然的优势菌群，而分子生物技术又通常只能检测到优势菌的存在，因此自然界中还有很大一部分微生物尚未被发现。应用DGGE与富集培养相结合有助于发现这一部分微生物。Santegoeds等22对美国黄石公园一温泉中的菌藻系进行了不同的富集培养，通过DGGE检测到了以往利用纯培养及分子技术均没有发现的10个好氧化能合成细菌类群基因。通过对DGGE条带测序得到的遗传信息并结合已知的生理生化知识有助于发现新的微生物物种，并分离得到纯培养。Teske等23就成功地应用该方法从一菌藻系共生体中分离纯化得到了两个纯的菌种：Desulfovibrio sp.和Arcobacter sp.。1.4.4用于不同DNA 提取方法效果的比较在分子微生物生态学的研究中，从环境样品中提取得到总DNA是关键的一步。一般采用直接提取和间接提取两种方法，直接提取法即对样品直接进行处理使其中的微生物细胞裂解从而释放出DNA，而间接提取法则是先将样品中的细胞与环境中其它物质如土壤颗粒等分离，然后再对其进行裂解、提取等处理。总DNA的提取期望尽可能多的提出环境中微生物的DNA。通过对不同提取方法得到的DGGE带谱进行比较可以评价提取效果的好坏。Kozdrj等24应用DGGE对直接和间接从土壤中提取DNA的效果进行了比较，选用的四种方法得到的DGGE带谱几乎相同，聚类分析表明相似性达82%以上，差异也仅体现在较弱的条带上。因此他们认为在该实验中所选用的直接提取和间接提取方法具有相同的提取效果。Gelsomino等25的研究也得到相同的结论。1.4.5对功能基因多样性的研究微生物多样性及其生理代谢活动在生态系统的物质循环和能量循环中起着重要的作用，是微生物生态研究的主要内容之一。对环境样品总DNA的直接检测能够从基因水平上反映出该环境中微生物的多样性状况，这其中包括了代谢旺盛的、休眠或无代谢活性的微生物，不能单独反映该环境中有代谢活力的微生物的状况。代谢旺盛的细胞中具有较多的核糖体，因此可以通过对mRNA 的研究来反映环境中处于不同生理代谢活动期的微生物。NiFe氢化酶在Desulfovibrio菌株的能量代谢中起着重要的作用，通过对6株菌的研究表明，在指数生长期时才可以检测到NiFe氢化酶mRNA的存在，而在稳定期时则检测不到。因此，可以将它的有无作为检测这些细菌代谢活性时相的一个标准。Wawer等26通过PCR-DGGE对不同环境下的生物反应器中Desulfovibrio菌株的NiFe氢化酶大亚基基因进行了研究。分别提取出总DNA及RNA，进行PCR和RT-PCR得到目的基因，通过DGGE分析并对得到的条带进行测序，结果表现出丰富的基因多样性，并且表明NiFe氢化酶基因的转录与细菌在生长周期所处的时相密切相关，这一结果与用纯菌株的研究结果相同。该研究提示可以通过DGGE对环境中的功能基因多样性进行研究。1.4.6克隆文库的筛选在过去的报道中，研究者曾采用多种方法进行克隆文库的筛选分析，比如群落杂交(colony hybridization)和限制性酶切片段长度多态性分析(Restriction FragmentLength Polymorphism)27。Kowalchuk等28使用DGGE来判定克隆文库中冗余克隆子，并且估计自然样本中特殊16S rDNA插入片段的丰度。该方法将16S rRNA基因片段进行全长扩增，并转导入合适的克隆载体。随后对成功转导的阳性克隆子进行嵌套PCR扩增，应用DGGE技术对扩增产物进行分析。通过这种方法，可以将大量的克隆子进行归类，并可对每类代表性克隆子进行测序分析。同时，DGGE分析还可以揭示出自然界中微生物群落的特征群体。需要说明的是，DGGE图谱中出现在相同位置的条带并不能完全代表是相同的序列，必须通过测序才能确定是否属于同一序列。根据太湖不同湖区的水质特点和营养化特征，本文采集太湖三个不同区域的表层水样，通过直接提取样品中的总DNA，并对总DNA 进行16S rDNA V3 区PCR 扩增，利用变性梯度凝胶电泳来分析太湖水域水华期间以及水华前后细菌群落结构的变化，并通过对DGGE 优势条带序列的研究来分析各群落中的优势成员及其进化地位，以期为富营养化湖泊的生物监测和生物修复技术的应用提供生物学依据。第二章材料与方法2.1 实验样本采集2.1.1 取样点描述太湖分为9 个湖区，分别是五里湖、梅梁湖、竺山湖、贡湖、东太湖、湖心区、西部沿岸区、东部沿岸区和南部沿岸区。太湖流域水资源保护局每月都会对上述9个湖区进行水质评价和湖泊营养状态评价，并将评价结果以通报的形式在其网站(http:/ /)上公布。通过对该通报2003、2004 和2005 年数据的跟踪调查，选择梅梁湖、