麦胚黄酮的制备及其降血脂和抗氧化作用的研究 精品.doc

麦胚黄酮的制备及其降血脂和抗氧化作用的研究学科、 专业： 食品科学 研 究 方 向： 功能性食品 目 录第一章 引言1 1.1 麦胚功能性成分及其保健作用11.1.1麦胚蛋白质及其保健作用11.1.2麦胚脂类及其保健作用11.1.3麦胚维生素及其保健作用21.1.4麦胚黄酮类化合物及其保健作用21.1.5麦胚廿八烷醇及其保健作用21.2 黄酮类化合物研究进展31.2.1黄酮类化合物的结构及分类31.2.2黄酮类化合物的生理活性及药理、保健作用研究现状41.2.3黄酮类化合物的提取技术研究现状及进展51.2.4黄酮类化合物在食品中的应用61.2.5黄酮类化合物应用中今后应解决的问题71.3 麦胚黄酮抗动脉粥样硬化作用研究进展71.3.1动脉粥样硬化的形成81.3.2麦胚黄酮抗动脉粥样硬化的作用机理81.3.3前景展望91.4 研究的目的意义10第二章 麦胚黄酮提取工艺研究112.1实验材料112.1.1材料112.1.2主要试剂112.1.3 主要仪器112.2 实验方法112.2.1提取工艺流程112.2.2酶法提取112.2.3芦丁标准溶液的配制及标准曲线的制订122.2.4提取液中黄酮的测定122.3 结果122.3.1芦丁标准曲线的确定122.3.2酶用量对黄酮提取率的影响132.3.3 pH值对黄酮提取率的影响132.3.4酶解温度对黄酮提取的影响142.3.5酶解时间对黄酮提取的影响142.3.6酶解条件优化结果152.3.7单因子效应分析结果162.4 讨论182.5小结18第三章 麦胚黄酮降血脂及抗氧化作用研究193.1 实验材料193.1.1实验动物分组和饲养193.1.2主要试剂193.1.3 主要仪器193.2 实验方法193.2.1测定指标及方法193.2.2数据统计分析203.3 结果203.3.1麦胚黄酮对大鼠肝脂质及肝体比值的影响203.3.2麦胚黄酮对大鼠血脂的影响203.3.3肝组织病理学检查213.3.4麦胚黄酮对大鼠血清和组织中LPO含量的影响213.3.5麦胚黄酮对大鼠血清SOD和GSH-Px活性的影响223.4 讨论223.5 小结23第四章 麦胚黄酮在不同氧化体系的抗氧化作用研究244.1 实验材料244.1.1主要试剂244.1.2主要仪器244.2 实验方法244.2.1猪脂过氧化值测定244.2.2猪脂中丙二醛值测定254.2.3麦胚黄酮对O2的清除试验方法254.2.4麦胚黄酮对OH的清除试验方法264.3 实验结果264.3.1猪脂过氧化值测定264.3.2猪脂中丙二醛值测定274.3.3麦胚黄酮对O2的清除试验274.3.4麦胚黄酮对OH的清除试验284.4 讨论284.5 小结29第五章 结论30参考文献31致谢35作者简介36第一章 引 言麦胚以其丰富的营养成分和良好的保健功能倍受重视。麦胚是小麦籽粒的一部分，是小麦籽粒的生命源泉，含有极丰富而优质的蛋白质、脂肪、多种维生素、矿物质，被营养学家们誉为“人类天然的营养宝库”。其蛋白质含量约占30%以上，含有人体必需的8种氨基酸，尤其是人体第一必需氨基酸赖氨酸的含量丰富。小麦胚含油量为13%，油中不饱和脂肪酸占82%；磷脂含量为1.38%，还有多种维生素，特别富含全价维生素E。麦胚中还含有许多特有成份，如廿三、廿五、廿六、廿八等烷醇，其中的廿八烷醇是一种生物活性极强的物质能够改善机体的体能、耐力及增强机体的抗疲劳能力。另外，麦胚中色素的主要成分是黄酮类化合物，它能捕捉生物体内膜脂质过氧化自由基，捕捉生物体内的超氧化物及氧离子，切断生物体内导致人体衰老与疾病的脂质过氧化连锁反应，螯合金属离子使之纯化，阻止脂质氧化酶的作用，其持续抗氧化作用效果比维生素E还强。1.1麦胚功能性成分及其保健作用1.1.1 麦胚蛋白质及其保健作用麦胚蛋白质含量可超过30%，其主要成分是球蛋白，也有少量的清蛋白，而无醇溶蛋白和谷蛋白。表1-1几种食品的蛋白质含量(%)Table 1-1 The protein content of several foods品 种麦胚牛肉瘦猪肉牛奶鸡蛋大米小麦面粉蛋白质含量3117.716.73.314.78.39.9由表1-1可知，麦胚中的蛋白质含量远远高于小麦面粉和大米，而且比肉、蛋、奶的蛋白质含量还高。麦胚中蛋白质的氨基酸组成的质地也很好，含人体所需的八种必需氨基酸，其含量占氨基酸总量的35%，而人类第一限制性氨基酸赖氨酸的含量高达1.85g/100g，它可有效地促进人的生长发育。此外，麦胚蛋白中还含有一种含硫抗氧化物谷胱甘肽(GSH)，它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的活性小分子肽，GSH在人体细胞的氧化还原中起着重要的作用，可将机体内氧化反应生成的过多自由基清除，与过氧化物酶共同作用能将体内过氧化氢或过氧化脂质还原，保护生物膜，从而延缓机体的衰老、预防动脉粥样硬化、保护大脑及促进生长发育等功能。另外，谷胱甘肽可与体内的有毒物质形成共轭化合物，将毒物中和并排出解毒。1.1.2 麦胚脂类及其保健作用麦胚中含有10%14%的脂肪，所含的脂肪是优质植物性脂肪，含有大量的不饱和脂肪酸，其中亚油酸含量近57%，现代医学认为，高胆固醇与AS有密切关系，而且血清中亚油酸含量的高低直接影响到AS的发生。因为胆固醇在体内的运转靠必需脂肪酸，如果必需脂肪酸含量过低，胆固醇就会与一些饱和脂肪酸结合，易于在大、小动脉管壁上沉积，造成AS。另外，亚油酸对维持电解质平衡、保护内环境稳定及预防心血管疾病都起到重要作用。此外，麦胚油中还含有一种对人体也具有生理活性的物质廿八烷醇，它是含有一个羟基的高级脂肪醇，与脂肪酸结合以酯的形式存在，廿八烷醇能提高运动耐力，改善心肌功能，提高全身肌肉的松弛作用和灵敏性，缓解肌肉疲劳，增强运动能力。1.1.3 麦胚维生素及其保健作用麦胚中所含维生素主要有维生素B族和维生素E二大类，麦胚中维生素B1、B2、B6含量丰富，其相互协同作用可大大提高麦胚营养价值，人体如果缺乏这些成分，就可能诱发荨麻疹类的皮肤病，然而，一般食品中却无此成分，这样麦胚的营养价值就更为突出。麦胚中含有全价的维生素E，这也是其他食品无法比拟的，它是一种极其宝贵的营养素，是一种强氧化剂，与硒元素共同作用保护多不饱和脂肪酸不被氧化，抑制与清除过多的自由基，使巨噬细胞活化，提高其吞噬能力，维持细胞膜的正常脂质结构和生理功能，从而增强人体免疫力，起到防癌和抗癌作用。维生素E还可以促进末梢血管血液循环，调整体内酶的消耗，保护细胞膜，延缓人体衰老。1.1.4 麦胚黄酮类化合物及其保健作用麦胚中色素的主要成分是黄酮类化合物，包括黄酮、异黄酮、黄烷醇及其甙（dai）等一大类化合物。黄酮类化合物广泛存在于自然界中，多具有艳丽的色泽。在植物体内黄酮类化合物大部分与糖结合成苷，一部分以游离形式存在。植物中的黄酮类化合物分布广、含量丰富，具有多种生理活性，能捕捉生物体内膜脂质过氧化自由基，捕捉生物体内的超氧化物及氧离子，切断生物体内导致人体衰老与疾病的脂质过氧化连锁反应，螯合金属离子使之纯化，阻止脂质氧化酶的作用，其持续抗氧化作用效果比维生素E还强，从而具有抗衰老作用。另外，对冠状动脉血管、下肢等血管有扩张及调节作用，可作血管保护剂，有防止动脉硬化、栓塞等效果。它还能抑制多种化学物质的诱变作用，提高动物的免疫功能并具有抗癌及诱导癌细胞分化的作用，而对正常繁殖速率的细胞则几乎无影响。1.1.5 麦胚廿八烷醇及其保健作用Pollard于1993年从小麦胚芽油中提取出廿八烷醇，由于它具有很强的抗肿瘤作用，因此近年来发展很快。Cureton等研究指出廿八烷醇具有增进运动机能、提高耐缺氧能力、增进心脏功能等方面的生理作用。加藤茂明发现廿八烷醇具有增进Wistar大鼠脂肪氧化分解的能力，Kato实验表明廿八烷醇可以促进大鼠肌糖元在运动过程中的消耗。（1）廿八烷醇的化学廿八烷醇是天然存在的高级醇，一般以蜡酯的形式存在于自然界许多植物的叶、茎、果实等表皮中，在蔗蜡、糠蜡、小麦胚芽油、蜂蜡及虫蜡等产品中廿八烷醇的含量较高。Kazuko等测定了坚果、籽粒、水果和谷物的胚中游离一元醇的含量，结果表明，高级醇类通常含量较低，与大量的烃类、酯类和甘油酯类共同存在。植物的不同部位廿八烷醇的含量差异很大，脱胚籽粒中廿八烷醇的含量是胚中的2倍，而种皮和壳的含量则只有胚的1/151/2。例如小麦胚芽，在其麦芽中廿八烷醇的含量为10mg/kg ，胚芽油中含量为100mg/kg。廿八烷醇是一元直链的高级脂肪醇，有28个碳原子，直链的末端连着羟基。分子式为CH3(CH2)26CH2OH，相对分子质量为410.77，白色晶体，熔点为83，安全性极高，LD50为18000mg/kg。廿八烷醇的使用量很小，就有显著的生理活性，在天然食物中含量很低，属于难以提取的高附加值成分。（2）二十八烷醇的生理功能1937年，国外学者发现廿八烷醇对人体的生殖障碍疾病有治疗作用，从1949年开始，Cureton博士等花费了20年的时间，进行了894人、42个项目的测试研究，确定廿八烷醇具有以下生理功能：增强耐力、精力和体力；提高反应敏锐性；调节运动神经功能；提高能量代谢率；改善心肌功能；降低收缩期血压；促进性激素作用，减少肌肉疼痛。1.2 黄酮类化合物研究进展黄酮类化合物是一类在自然界广泛分布的多酚类物质。现已发现数百种不同类型的黄酮类化合物具有广泛的生物活性和药理活性。大量研究表明，黄酮类化合物具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和调节免疫、防治血管硬化、降血糖等功能。还有许多黄酮类化合物被证明有抗HIV病毒活性。另外，随着食品工业的发展与消费观念的改变，天然活性成分的保健食品成为现代人追逐的目标，其中黄酮类化合物以纯天然、高活性、见效快、作用广泛等特点日益受到人们的关注。黄酮类化合物为一类低分子量的广泛分布于植物界的天然植物成分，为植物多酚类的代谢物，大多有颜色。从植物系统学的角度，植物体产生黄酮的能力与植物体木质化性质密切相关。因此黄酮类化合物主要分布在维管束植物中，而在其它较低等的植物类群中分布较少。含有黄酮类化合物的植物很多，如银杏叶、茶叶、葛根、大豆、芹菜、黄瓜、小麦等，在这些植物中此类化合物的类型最全，结构最复杂，含量也最高。1.2.1 黄酮类化合物的结构及分类黄酮类化合物又名生物类黄酮化合物，是色原酮或色原烷的衍生物，黄酮类化合物是自然界中以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物(如图1-1)，其化学结构中C3部分可以是脂链，或与C6部分形成六元或五元环，黄酮类化合物泛指这种两个苯环通过中央三碳链相互连接而成的一系列化合物。一般黄酮类化合物可根据母核基本结构的不同进行分类，主要有黄酮醇、黄酮、黄烷酮、黄烷醇、花色素、异黄酮、二氢黄酮醇以及查尔酮等8类。另外，还有一些其他类型的类黄酮，如香豆素等。类黄酮可以是配基和糖苷型，也可以是甲脂衍生物。黄酮醇以及黄酮化合物是最为常见的类黄酮，而黄烷酮、黄烷醇类、二氢黄酮以及二氢查尔酮类化合物被认为是一类微量类黄酮，因为后者在自然界分布相对有限。 黄 酮 麦胚黄酮苷元 麦胚黄酮 麦胚黄酮麸皮黄酮 麸皮黄酮 图1-1 麦胚黄酮糖苷及苷元的化学结构Fig 1-1 Flavone glycoside in wheat germ and chemical structure of daidzein1.2.2 黄酮类化合物的生理活性及药理、保健作用研究现状 （1） 抗肿瘤、抗癌作用黄酮类化合物是通过促进肿瘤坏死因子，抑制致癌剂及抗氧化等多途径发挥疗效的。如大豆异黄酮的A环5、7位及B环的4位的羟基是抑制乳腺癌和前列腺癌的主要基团，在前列腺细胞增殖阶段大豆蛋白对其有抑制作用，因此，可减少前列腺肿瘤的发生。Kenneth 研究表明，大豆异黄酮能降低乳腺癌、前列腺癌。赵秀兰等的研究表明麦胚黄酮类粗提取物具有抑制乳腺肿瘤的作用。（2）对心血管系统的作用 对血压的影响黄酮类化合物对高血压引起的头痛、项强、头晕、耳鸣等症状有明显的疗效，尤以缓解头痛、项强为显著。葛根素对正常和高血压动物都有一定的降压作用，静注葛根素能使正常麻醉犬的血压短暂而明显地降低，也能显著降低清醒自发性高血压大鼠血压。 抑制血小板凝集作用黄酮类化合物对凝血因子具有较强的抑制作用，故表现出较好的抗凝血作用。试验表明，不同浓度的黄酮类化合物可以不同程度地抑制二磷酸腺苷诱导的大鼠血小板凝集，对5羟色胺和ADP联合诱导的家兔和绵羊血小板凝集也有同样的抑制作用。黄酮类化合物还可降低血管内皮细胞羟脯酸代谢，使内壁的胶原或胶原纤维含量相对减少，利于防止血小板粘附凝集和血栓形成，有利于防治动脉粥样硬化。大豆异黄酮能抑制凝血酶和血小板活化因子诱导的血小板聚集，高浓度抑制血管渗透性因子诱导的冠状动脉舒张。 对外周血管的影响静注黄酮类化合物于麻醉犬后，全部动物的脑血流量增加且血管阻力相应降低，还能使乙酸胆碱引起的脑内动脉扩张和去甲肾上腺素引起的收缩减弱，使处于异常状态下的血管功能恢复正常水平。还可改善异丙肾上腺素引起的小鼠微循环障碍，使毛细血管前小动脉管径增加，流速加快。（3）抗氧化及抗自由基作用自由基性质活泼，有极强的氧化反应能力，对人体有很大的危害性，在体内自由基和脂质过氧化作用导致细胞结构改变和功能破坏，而引起癌症、衰老及心血管等退变性疾病。在黄酮提取物的抗氧化性研究方面，国外曾有人利用DPPH法研究羟基黄酮Tinospora Crispa以及单宁和类黄酮的抗氧化能力。徐雅琴研究了黑穗栗叶片黄酮提取物的抗氧化性，结果表明，叶片黄酮提取物具有一定抗氧化效果，且其抗氧化性随天加量的增加而增强。于长青等研究表明，麦胚黄酮可显著增强大鼠血液中和活性，提示麦胚黄酮可能通过提高机体抗氧化酶类的生物合成而增强机体抗氧化能力。（4）抗炎、抗微生物及提高免疫功能的作用黄酮类化合物主要通过影响细胞的分泌过程，有丝分裂及细胞间的相互作用而起抗炎及提高免疫功能。多数黄酮类化合物能抑制大鼠肥大细胞和嗜碱性细胞对多种刺激引起的组胺及慢反应物质的释放，抑制PGE2、白三烯的合成和释放，抑制透明质酸酶的活性，抑制大鼠中性粒细胞溶酶体酶的释放及其脱颗粒。白凤梅等研究表明，天然黄酮对小鼠急性胃溃疡有明显的消退作用。甘草黄酮化合物中抗菌成分较多，其黄酮单体化合物licochalconeA，licochalconeB，glabridin，glabrene等对金黄色葡萄球菌，枯草杆菌，大肠杆菌，绿脓杆菌，白色念珠菌等均有抑制作用。Neobavai isolavone亦能明显抑制烟曲霉菌和新型隐球菌的生长。翟爱华等采用二倍稀释法和管碟法对麦胚黄酮进行体外抑菌试验，结果表明，对灰葡萄孢、白色念珠菌、黑根霉、意大利青霉等真菌具有较好的抑菌效果。（5）类黄酮对脂质代谢的调节作用有关对类黄酮作用的大量研究表明，类黄酮物质对动物的脂质代谢具有调节作用。Lichtenstein认为， 大豆产品预防动脉粥样硬化、冠心病的作用归因于大豆类黄酮的降血胆固醇、抗氧化和保护动脉完整的作用。Balmir等在大鼠试验中发现，大鼠日粮中添加大豆异黄酮可显著降低血清总胆固醇和LDL胆固醇浓度。于长青等试验研究表明麦胚黄酮可明显地降低大鼠血清和肝脏中的胆固醇、甘油三酯的含量。1.2.3 黄酮类化合物的提取技术研究现状及进展黄酮类化合物分布范围广、种类多，近年来利用不同的质料进行提取研究多有报道。（1）有机溶剂萃取法利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同，选用不同的溶剂萃取可达到精制纯化目的。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮等，一般采取乙醇为提取溶剂。高金燕等以西芹作为测试样品，使用无水乙醇为提取剂，按西芹鲜重与提取剂的比例（w/v）12 ，在80 下回流提取24 h，西芹样品中的黄酮物质被提取的量较多，提取效果较好。（2）碱性水提法黄酮类成分大多具有酚羟基，可用碱性水或碱性稀醇浸出，浸出液经酸化后析出类黄酮化合物。张永煜等根据葛根黄酮结构中酚羟基易溶于碱水的性质，应用饱和氢氧化钙水溶液，分别以8倍量提取1次及6倍量提取2次。（3）超声提取法此法也是一种较新的方法，具有能耗低、效率高、不破坏有效成分的特点。在较低温度下，超声可以强化水浸提效率，达到省时、高效、节能的目的。梁惠花等运用超声技术从油菜蜂花粉中提取黄酮类化合物，可提高黄酮得率，大大缩短提取时间。（4）微波法此法一般作为前处理，具有可降低机溶剂浓度、缩短提取时间及提取率高等特点。李嵘等人曾用微波法提取过银杏叶中的黄酮甙，他们发现溶剂萃取前对原料和水的混合液进行短时间微波处理，能大大提高黄酮提取率和缩短溶剂萃取所需的时间27。（5）超临界萃取法随着国际上超临界流体提取技术迅速发展，用该技术提取植物中的活性成分愈加广泛。与有机溶剂法相比，具有提取效率高、无溶剂残留、活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏等优点。陈从贵、潘见、张宏康等研究探讨超临界CO2提取分离银杏叶药用成分的适用性和可操作性，提出溶剂浸提与超临界流体萃取相结合的生产工艺，既可降低生产成本，又可保证产品质量。1.2.4黄酮类化合物在食品中的应用黄酮类化合物广泛存在于植物的各个部位，尤其是花、叶部位，主要存在于芸香科、唇形科、豆科、伞形科、银杏科与菊科中。有文献估计约有20的中草药中含有黄酮类化合物，可见其资源之丰富。许多研究已表明黄酮类化合物具有多种生物活性，除利用其抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等方面也有显著效果。它是大多数氧自由基的清除剂，因而能升高SOD（过氧化物歧化酶）的活力，减少MDA（脂质过氧化物丙二醛）及OXLDL（氧化低密度脂蛋白）的生成。它可以增加冠脉流量，对实验性心肌梗塞有对抗作用；对急性心肌缺血有保护作用；对治疗冠心病、心绞痛、高血压等有显著效果；对降低舒张压，防治心律失常、心血管病和活血化瘀也起重要作用。由于黄酮类化合物的这些生物活性使它的研究进入了一个新的阶段，掀起了黄酮类化合物研究、开发利用热潮，促使其在化妆品、医药、食品等工业中有广泛的应用。黄酮类化合物在食品中的应用形式比较单一，主要是作为食品添加剂或直接应用于食品中增加其保健作用。从产品形式看种类不多，基本上液态饮品、果蔬汁饮料（单一或混合）、低度发酵酒、茶（固体或液体）占有很大比重，也有少量醋、糖果、白酒、冷饮料的黄酮类产品。（1）天然抗氧化剂 研究表明，黄酮类化合物均具有不同程度的抗氧化作用，尤其芸香苷、槲皮素、银杏黄酮、大豆异黄酮等具有较强的抗氧化能力，可以代替合成抗氧化剂，用于油脂的抗氧化中。也可用于奶制品、方便面、糖果、冰淇淋及油炸小吃以吸引消费者。儿茶素的抗菌和除臭作用延缓了牙齿的腐烂（抗龋）并改善了口气清新度，因此，可在牙膏、漱口液、口香糖及口气清新剂中添加儿茶素以发挥其作用。（2）天然风味增强剂有些黄酮类化合物具有增强食品风味的作用，如柚皮苷虽具有苦味，但用在饮料以及高级糖果中却具有增强风味的作用。如柑橘汁中的橘皮苷是其特征的黄酮化合物，用其可以鉴别外观和风味类似柑橘汁的伪劣产品。 用从茶叶、竹叶中所提取的黄酮类混合物配制成的可乐型饮料及口香糖均具有一种天然的淡淡茶香和竹香，生津止渴，口感甚佳，具有明显的除口臭、去烟味、蒜味及口腔灭菌功效，且成本比一般可乐饮料及一般口香糖低。（3）天然色素近20年来，发现一些合成色素都有不同程度的毒性，其应用受到一定限制，因而从自然界寻找合成色素的代用品天然食用色素的研究倍受各国重视。黄酮类化合物多呈黄色，同时又具有很宽的溶解特性，既有水溶性的黄酮类化合物，又有脂溶性的黄酮类化合物，所以完全可以根据食品加工的需要而选择合适的黄酮类化合物作为着色剂。（4）黄酮类化合物功能食品近年来上市的保健产品中，很大一部分其中主要功效成分都属于黄酮类化合物，涉及功能食品的许多方面，如防衰、防癌、提高免疫力、降脂、降压食品等，产品外观覆盖到液体、固体和半流体等多种形式，如银杏叶袋泡茶、苦芥速食粉、山楂叶冲剂、蜂胶胶囊、黄酮类口香糖、黄酮类牙膏、沙棘汁等，其中以蜂胶、银杏、山楂、沙棘、荞麦、柑橘皮、茶叶等黄酮类化合物加工品为最多，占黄酮类化合物功能食品的80以上。黄酮类化合物无毒，广泛存在于植物界中，人体不能合成，而且在体内代谢很快。人体摄取黄酮类化合物主要来自于饮料、茶、咖啡、可可、果酒（尤其红葡萄酒）和啤酒，甚至醋都是其重要来源，占总摄入量的25-30。关于其日摄取量，目前尚无定性结论，美国摄取量达1g/d，荷兰对槲皮素、山萘酚、高粱黄酮、叶黄酮、杨梅黄酮的总摄取量达23mg/d，但目前的摄取水平远未达到有益的摄取量。近年来虽然分离、提取了大量的新黄酮类化合物，掀起了黄酮类化合物的研究热潮，但对其吸收、代谢机制、活性机理，具有生理功能的活性基团、稳定性等方面仍缺乏全面的认识，因此应加强此方面的工作，弄清其生理功能从而进行有效地分离和提取，为生物类黄酮在医药、食品工业中的应用提供理论依据，加速植物资源的有效开发利用，生产出具有治疗和预防多种疾病的药品和天然保健品。1.2.5 黄酮类化合物应用中今后应解决的问题近年来对黄酮类化合物的结构、功能等都有了深刻的了解，并应用各种高新技术从各种植物中分离、提取了大量的黄酮类化合物，掀起了黄酮类化合物的研究热潮，但对其吸收、代谢机制、活性机理，具有生理功能的活性基团结构、稳定性等方面仍缺乏全面的认识，因此应加强此方面的工作。另外，随着研究的加深，开发出了一大批黄酮类药物与食品，但其结构复杂，并且作用位点较多，因而对一些病症缺乏针对性和选择性，限制了其进一步开发和利用，这也是今后研究者所要解决的重要问题。总之，黄酮类化合物作为一类生物活性很强的化合物，具有众多优点，其在医药、食品等领域中具有广阔的应用前景。1.3 麦胚黄酮抗动脉粥样硬化作用研究进展动脉粥样硬化(atherosclerosis AS)是心脑血管病的主要病理学基础，是一种由多因素诱导的复杂病变，其中血脂代谢异常和氧化损伤与AS的发生和发展密切相关。近年来，随着对AS的深入了解，植物来源的抗氧化物的研究开发及其在抗AS中的应用已取得很大进展。麦胚是面粉加工业的副产品, 麦胚中色素的主要成分是黄酮类化合物, 黄酮具有多种生理活性，能捕捉生物体内膜脂质过氧化自由基，捕捉生物体内的超氧化物及氧离子，切断生物体内脂质过氧化连锁反应，螯合金属离子使之纯化,阻止脂质氧化酶的作用，有持续抗氧化作用。另外，对冠状动脉血管、下肢等血管有扩张及调节作用，可作血管保护剂有防止动脉硬化、栓塞等效果。所以本文综述了近年麦胚黄酮（Flavonoids of Wheatgem）抗AS的研究进展。1.3.1动脉粥样硬化的形成动脉粥样硬化(AS)是许多心脑血管疾病的病理基础，发病率及死亡率极高。其主要表现为动脉内膜形成纤维性(纤维脂性,动脉粥样)斑块。AS的发病原因很多，病程复杂。其形成原因主要是由于血脂代谢异常，脂质过氧化损伤、动脉壁受损等。血浆脂质超出正常范围称为高脂血症或高脂蛋白血症，是体内脂质代谢障碍的表现，为动脉弱样病变的重要原因之一。大量资料表明，AS的发生与脂质过氧化的损伤有关。机体氧化系统和抗氧化系统失去平衡时就会产生大量的自由基，血清中活性氧自由基导致脂质过氧化而产生大量的丙二醛(MDA)可能与LDL结合成一种对血管内皮细胞有较强的损伤作用的复合物，当这种复合物进入细胞，使细胞内胆固醇堆积并转变成泡沫细胞，形成AS早期病变。1.3.2 麦胚黄酮抗动脉粥样硬化的作用机理（1）减少主动脉病变斑块程度汪敏等用高胆固醇饲养家兔60天，取主动脉镜检，出现明显的AS，动脉壁表面粗糙，大量泡沫细胞形成，有变性、坏死及纤维组织增生出现。泡沫细胞是脂质沉积的主要部位，脂质的大量积聚使细胞器移位，进而使其代谢障碍而坏死。麦胚黄酮组镜检后发现AS病变有不同程度的减轻，并未见泡沫细胞。可见，麦胚黄酮能减少脂质沉积和泡沫细胞的出现以抑制AS斑块形成。（2）降脂作用高血脂症与AS的发生密切相关，高胆固醇、高LDL、高甘油三酯、低HDL是AS的主要原因。国内外动脉粥样硬化和血脂的流行病学调查及近10年来开展的调脂药物应用的多中心多病例数的观察结果显示：高TC、高HDL-C与临床心血管病事件发生率密切相关。HDL-C降低0.5g/L，发生动脉粥样硬化的危险性上升20%，HDL-C降低1g/L，发生动脉粥样硬化的危险性增加2倍。TG2mmol/L并伴有HDL-C降低(6.24mmol/L)者动脉粥样硬化发病与死亡率显著增高。麦胚黄酮对血脂代谢的影响展示了其防治AS的作用。Bordia等早在20世纪70年代就发现黄酮类化合物对营养性高血脂症和血液凝固有非常明显的保护作用。黄酮类化合物能够明显阻止高胆固醇饲料所致的家兔高脂血症,明显降低血清胆固醇，血浆纤维蛋白原的升高，明显降低低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白的含量，提高高密度脂蛋白含量，阻止B2脂蛋白上升和A2脂蛋白降低，从而维持B/A值于正常水平，其作用明显优于安妥明组。Balkan等报道将实验家兔分为普通饲料喂养之对照组、高胆固醇饲料喂养组和高胆固醇喂养加麦胚组，表明能降低血浆胆固醇和三酰甘油，并能改善因高胆固醇饲料诱发的氧化刺激及胆固醇在大动脉内皮的蓄积。国内学者高希宝等实验发现麦胚对改善血清中游离脂肪酸组成，降低胆固醇含量有显著作用。于长青等对用高胆固醇饲料饲养的小鼠形成高脂对照组，同时给予麦胚黄酮，观察麦胚黄酮对高脂对照组小鼠胆固醇代谢和胆固醇在大动脉蓄积的影响，结果表明麦胚黄酮组TC、TG极显著低于高脂对照组(P0.01),HDL-C极显著高于高脂对照组(P0.01)。陆旭等在应用麦胚油丸为高血脂病人的服用试验中发现其可选择性地升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，升高HDL-C的作用(升24.4%)比较明显。还有学者发现麦胚具有延缓脂肪肝发生的作用，喂高脂肪饲料的同时给予麦胚，有显著阻止肝中胆固醇和脂肪升高作用。文献表明，高脂型的AS主要与HDL和LDL水平有关，HDL可将体外胆固醇运送到肝脏内，因而可降低血液中胆固醇的浓度，HDL能够转运动脉壁胆固醇到肝脏分解为胆酸,是有效的抗AS因子。而影响HDL转运胆固醇的主要因素是卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)活性，LCAT能够使血中胆固醇催化生成胆固醇酯转入HDL核心部分而转动，HDL的含量反映了从心脑血管系统运送胆固醇至肝脏代谢的活跃程度。综上所述可表明麦胚黄酮抗AS的机制与降血脂有关。（3）抗氧化作用黄酮类化合物清除氧自由基的作用机制途径：通过抗氧化剂的还原作用直接给出电子而清除自由基，同时能显著提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活性并对过氧化氢(H2O2)的生成有明显的抑制作用；通过抗氧化剂对金属离子的络合，降低若干需金属离子催化的反应,从而间接实现抗氧化作用。目前研究已证实，SOD、GSH-PX是体内最重要的抗氧化酶, 分别具有清除体内过量的自由基和抑制脂质过氧化的作用。在机体抗自由基损伤中起着重要作用。Thomas等报道GSH-PX对内皮细胞防御氧化损伤起到重要作用。于长青等研究发现麦胚黄酮可显著增强大鼠血液中SOD、GSH-PX活性,提示麦胚黄酮可能通过提高机体抗氧化酶类的生物合成而增强机体抗氧化能力,从而有效地防止的发生。徐贵发等实验研究结果显示麦胚提取的黄酮类化合物能增加SD大鼠GSH-Px酶活性,降低体内脂质过氧化水平。脂质过氧化物(lipid peroxidase,LPO)能通过多种途径促进的AS发生和发展， LPO可造成内皮细胞受损，平滑肌细胞坏死,最终导致细胞结构和功能的改变。它的中间产物丙二醛(MDA)可改变LDL的性质，导致大量的胆固醇堆积于平滑细胞和巨噬细胞，使血脂升高。于长青等报道高脂血症大鼠在给予麦胚黄酮灌胃后，血清和组织中LPO含量明显降低，说明了麦胚黄酮具有抗氧自由基的作用,并使血脂降低。Ross等认为LPO对胆固醇酯酶活性的抑制，有助于TC的沉积，促进AS的形成和发展。而麦胚黄酮能显著降低实验性高脂血症大鼠血清和组织中LPO含量清除过多活性氧自由基。氧化修饰低密度脂蛋白(OX-LDL)在AS的发生与发展中起着重要作用。有关研究表明在AS损害部位存在OX-LDL抗原决定簇，而正常动脉壁中却没有，麦胚黄酮具有抗氧化作用，能减少OX-LDL的生成。可见，麦胚黄酮作为一种强抗氧化剂，通过减少OX-LDL的生成，增加SOD合成及活性，清除氧自由基而降低AS的发生。1.3.3 前景展望由动脉粥样硬化(AS)所引起的心血管疾病是导致全球人口死亡的主要原因之一，故干预的治疗和预防尤为重要。由于有疗效稳定、毒副作用小、资源丰富且经济实惠等特点，黄酮类化合物在营养保健和医药方面的作用已备受重视。我国有着麦胚丰富的植物资源优势，而黄酮的提取工艺也在日益优化，过程也越来越化繁为简。这一切也预示有着降血脂、抗氧化功效的麦胚黄酮在抗动脉粥样硬化的应用中具有广阔的应用前景，但在揭示其抗AS机制的生化学方面有待于进一步的研究。1.4 研究的目的意义麦胚是面粉工业的副产品，是小麦籽粒的营养宝库和精华，麦胚中色素的主要成分是黄酮，它能捕捉生物体内膜烷过氧化自由基，切断生物体内导致人体衰老与疾病的脂质过氧化连锁反应，阻止脂质氧化酶的作用，其持续抗氧化作用效果强于维生素E。因此，加速这一新型保健食品资源的开发研究，形成消费者需求的系列保健产品，不仅有着较高的营养保健效果，而且将会带来极好的经济效益和社会效益。本研究以麦胚为原料，利用酶法技术提取麦胚黄酮；通过动物试验探讨了麦胚黄酮在不同氧化体系中的抗氧化作用和降血脂效果。本研究可为开发预防和治疗心脑血管疾病的保健食品奠定理论基础，为麦胚总黄酮的进一步开发利用提供技术参考和支持。 第二章 麦胚黄酮提取工艺研究黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物。据统计目前发现有6000余种，为天然酚类化合物之首。由于这类化合物大多呈黄色或淡黄色，因此称为黄酮。此类化合物在植物的组织内大部分与糖结合成普存在，少部分以普元形式存在。黄酮类化合物是麦胚中主要的生理活性物质，能捕捉生物体内膜脂质过氧化自由基，捕捉生物体内的超氧化物及氧离子，螯合金属离子使之纯化，阻止脂肪氧化酶的作用等。近年来，不少学者对麦胚中黄酮类物质的提取技术进行了多方面积极和有益的探索，但主要还是集中在对传统提取方法的优化改良上；酶法（主要是纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等及其复合酶类）已逐渐作为提取生物活性成分的新兴技术得到了广泛的应用，然而有关于酶法技术在麦胚黄酮类物质提取中的应用鲜见报道。与传统提取方法相比，酶法提取具有无毒性、效率高、反应条件温和及催化活力可被调节控制等优势。因此，本文着重对纤维素酶辅助提取麦胚总黄酮的工艺进行了较详细的研究，以期改善传统溶剂提取法的不足。2.1 实验材料2.1.1材料麦胚，购于黑龙江科研所，用烘箱在6070烘干，粉碎过60目筛备用。2.1.2主要试剂 芦丁：中国药品生物制品检定所；纤维素酶：北京生化试剂制品厂；盐酸、硫酸、95乙醇、冰乙酸、石油醚、甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠和三氯化铝均购自天津市大茂化学试剂有限公司。2.1.3主要仪器电子天平：Mettler PM460；超临界液体萃取装置：HA121-50-01型，南通市华安超临界萃取有限公司；旋转真空蒸发仪R-200：瑞士BUCHI；紫外可见分光光度计UV-2201：日本岛津；紫外可见分光光度计：UV-754 上海第三分析仪器厂；酸度计：PH-3C，上海雷磁；微波炉：Galanz WG800DSL20-K6；自动氮分析仪342：瑞士BUCHI；电热恒温水浴锅：DH-4000型天津泰斯特仪器有限公司；离心机LD5-2A：北京医用离心机厂；冰箱：BCD-186A/E，合肥荣事达电冰箱有限公司。2.2 实验方法2.2.1提取工艺流程麦胚烘干粉碎酶法提取测定黄酮得率。2.2.2酶法提取称取麦胚4g(6份)，用石油醚浸泡1h，过滤水洗净，置于250mL锥形瓶中分别加入不同浓度的乙醇100mL和不同浓度的纤维素酶，调节pH值，摇匀，用塑料布封口，水浴加热40min,离心（3500r/min,15min）,将所得沉淀加入另一锥形瓶中，加入100mL蒸馏水，用塑料布封口，水浴90min, 离心（3500r/min,15min）,合并两次提取液，浓缩至一定体积后加入80mL95%乙醇，趁热过滤，将滤液定容至200mL,吸取2.5mL测定黄酮提取率。 2.2.3芦丁标准溶液的配制及标准曲线的制订准确称取干燥的芦丁标准品10.0mg，用无水乙醇溶解，定容至50mL，得浓度为0.2mg/mL芦丁标准液。准确取上述标准液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL，分别置于10mL容量瓶中，加入5%nNaNO2 0.5mL摇匀，静置6min；然后加入10%Al(NO3)3 0.5mL摇匀，再静置6min；最后加入5%NaOH 2.5mL,摇匀，静置10min后用蒸馏水定容至刻度，15min后30min内在510nm处测定吸光度A，制定标准曲，得芦丁含量Y(pg/m1)与吸光度A间的回归方程。2.2.4提取液中黄酮的测定分光光度法受溶液体系影响较大，提取液的浓度、离心分离的效果、固形物的含量都会对测定结果造成很大误差。所以在测定前先对提取液进行除杂，然后测定。取各组不同实验条件下所得的定容样液依法显色，按下式计算麦胚中总黄酮得率（以芦丁计）。 Y(%)= （1）式中Y黄酮得率；A样液的吸光度；m各组实验样品质量；800总的稀释倍数。2.3结 果2.3.1芦丁标准曲线的确定按照2.3.3论述的试验方法，得芦丁含量Y(pg/m1)与吸光度A间的线性关系，如图2-1所示。图2-1芦丁标准曲线Fig2-1 The standard curve of rutin根据二者的关系得到回归方程：y=0.0058x+0.0044（2）式中y为吸光度，x为芦丁含量，R2=0.9888。2.3.2酶用量对黄酮提取率的影响控制反应条件为为：pH=5，温度为50，反应时间为90min，分别加入5mg、10mg、15mg、20mg、25mg和30mg的纤维素酶，按照2.2.2论述的试验方法进行实验，结果如图2-2所示。图2-2酶浓度对黄酮提取率的影响Fig 2-2 enzyme concentration effect on the extraction rate of flavone从图2-2可看出，随着酶用量的增加，总黄酮得率先增加后降低，15mg之前吸光度升高趋势较快，而20mg之后吸光度降低趋势较为平缓，当酶用量为15mg时，提取效果最好。这是因为在试验条件下，酶量低于最佳值时，酶解未进行完全；达最佳值时，酶解进行较完全；此时如果继续加大酶量，底物浓度不能对酶达到饱和，导致酶的作用受到抑制。2.3.3 pH值对黄酮提取率的影响控制反应条件为为：酶用量为15mg，温度为50，反应时间为90min，分别调节其pH为2.5，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0，按照2.2.2论述的试验方法进行实验，结果如图2-3所示。图2-3 pH值对黄酮提取率的影响Fig 2-3 The pH effect on the extraction rate of flavone由图2-3可知在较酸性条件下，最佳。每种酶都有最适pH值，在此pH值下催化反应的速率最高。由图2-3可看出：pH值在2.54之间，麦胚黄酮得率一直随pH值的上升而增加；当pH值超过4之后化学环境不利于酶的作用，酶活力减小，黄酮得率下降趋势明显。2.3.4酶解温度对黄酮提取的影响控制反应条件为为：酶用量为15mg，pH=5，反应时间为90min，分别调节水域温度为20，30，40，50，60和70，按照2.2.2论述的试验方法进行实验，结果如图2-4所示。由图2-4所示，温度为50时，提取效果最好。这是因为温度对酶解反应速度的影响有两方面效应：一方面当温度升高，酶活性增强、反应速度加快；另一方面温度继续升高，酶活性减弱、酶的稳定性降低，同时高温还会破坏原本已被提取出来的黄酮的结构；低于50时以前种效应为主，高于50时以后种效应为主。图2-4酶解温度对黄酮提取率的影响Fig 2-4 The enzymolysis temperature effect on the extraction rate of flavone2.3.5酶解时间对黄酮提取的影响控制反应条件为：酶用量为15mg，pH=5，温度为50，分别酶解20min，30min，40min，50min，60min和70min，按照2.2.2论述的试验方法进行试验，结果如图2-5所示。图2-5酶解时间对黄酮提取率的影响Fig 2-5 The enzymolysis time effect on the extraction rate of flavone从图2-5可看出，酶解时间为40min时，提取效果最好。酶解时间太短影响酶解效果，时间太长不利于工业化生产。20-40min内黄酮得率随着时间的增加而增大。 2.3.6酶解条件优化结果在单因素实验的基础上，采用中心组合实验方案进一步研究酶用量，酶解时间，pH值和酶解温度四个因素对酶解效果的影响，实验编码表见表2-1，实验结果见表2-2。表2-1因素水平编码表Table 2-1 The table of factors and levels水平纤维素酶用量(mg)时间(min)pH值酶解温度()+120504.560015404050-110303540j5100510表2-2二次回归正交旋转组合试验结果Table 2-2 Result of orthogonal rotatable central posite design 序号酶用量时间pH温度Y值110403.5500.118210404.5500.097320403.5500.154420404.5500.124515304.0400.082615304.0600.062715504.0400.065815504.0600.118910404.0400.1161010404.0600.1311120404.0400.0931220404.0600.1461315303.5500.1451415503.5500.1381515304.5500.1121615504.5500.1021710304.0500.1281810504.0500.0761920304.0500.0842020504.0500.1632115403.5400.1382215403.5600.1672315404.5400.1152415404.5600.1662515404.0500.1852615404.0500.1672715404.0500.1752815404.0500.198以SAS System 8.2为辅助设计手段，利用实验结果和中心组合设计统计方法分析进行编程，并对结果进行分析得回归方程如下：Y= -1.479125+ 0.005783X1+ 0.323167X2 + 0.021725X3 + 0