SiRNA介导哺乳动物基因沉默1.doc

siRNA介导哺乳动物基因沉默1 导言在人类基因组（30亿bp）中，约有34万个编码蛋白的基因，但一半以上基因的功能仍不清楚。一项全新的技术siRNA（small interfering RNAs）技术已用来系统研究数以千计的基因功能及相互关系。SiRNA是RNAi的介导者之一，它通过dsRNA使同源基因沉默。用siRNA去沉默脊椎动物基因，尽管一年前才见报道，但对绝大多数脊椎动物基因功能的分析仍显示出了强大生命力。2 RNAi的发现2.1基因功能的分析策略经典的正向遗传学是依赖突变体而分析基因的功能，但随着基因组测序的巨大进展，仍有数以千计的基因功能不为人们所知。反向遗传学是当今研究基因功能的最有效手段，但目前还没有一项通用的反向遗传学技术，人们只是通过对目的基因进行同源重组来分析其功能，实验周期长而且花费巨大。而最新的RNAi 技术可使目的基因沉默，是反向遗传学的一次伟大变革。2.2 RNAi的发现1998年，当时线虫基因组测序工作业已完成，Andrew Fire和Craig Mello提出了一项新技术：通过dsRNA诱导特异基因的沉默，即所谓RNAi。这一发明与先前的dsRNA介导植物体内的PTGS相似。Fire和Mello等指出，在线虫体内，哪怕存在几个分子的dsRNA，也足以使与其同源的基因的表达完全受阻。这一研究掀起了以RNAi介导线虫基因沉默的热潮，不仅如此，该技术在哺乳动物中的应用正如火如荼。人们不仅用RNAi来研究基因的功能，甚至还用它来治疗一些病毒引起的疾病。3 SiRNA简介3.1 siRNA的发现在1999年，Andrew Hamilton 和David Baulcombe发现，在拟南芥的转基因株和病毒诱导的PTGS中，存在2125nt RNAs，该RNAs与沉默基因序列互补，其来源是较长的dsRNA前体。还有研究表明，2123nt的dsRNA，携带2nt 3突出末端。这些小RNA决定了RNAi的特异性。在果蝇的基因沉默细胞中，提取到的小分子RNA，足以使原初胚胎胞容物及S2细胞的基因表达沉默。这些小分子RNA即称siRNA。3.2人工合成的 siRNA 人工合成的21nt和22nt dsRNA也可高效诱导胞溶物中特异的mRNA的降解。人们一直努力去合成一些具有活性的siRNA。由于化学合成法造价昂贵，有人利用T7噬菌体聚合酶在体外合成siRNA：一种方法是用该酶分别转录siRNA的正义链和反义链，之后再退火以形成siRNA；另一种方法是用T7 聚合酶直接转录顺式连接的siRNA的两条链，以形成发夹结构。值得注意的是，T7 聚合酶体外合成的siRNA都具有5三磷酸末端结构，而在果蝇中，siRNA活性必需的结构是5一磷酸末端。因而，在哺乳动物中，要么其5三磷酸 需转化成5一磷酸，要么其5端的结构要求并不严格。还有人利用纯化的细菌RNase，在体外加工较长的dsRNA以产生siRNA。4 stRNA简介4.1 stRNA的发现研究生物体内基因表达调控的一个新策略始自线虫中lin-4和 let-7 RNA的发现。这两种RNA均来自于70nt具发夹结构的前体RNA，经加工形成22nt 的RNA。在线虫和蠕虫中，lin-4和 let-7的基因均与发育的时序性有关，一旦突变，都会引起异时序性的发育缺陷。如蠕虫的lin-4突变体停留在幼虫期而不再向前发育，而let-7突变体则滞留于幼虫的最后一次蜕皮期。4.2 lin-4 RNAlin-14和lin-28 mRNA编码发育过程中的重要蛋白，而lin-4则对其进行负调控。lin-4 RNA与lin-14和lin-28等重要的发育调控的3UTR的特定序列同源。一旦删除这些mRNA的3UTR，会发生发育失控的表型。靶mRNA的Northern blot 分析结果表明，调控者（如lin-4，很可能包括let-7 RNA）可能稳定地与多核糖体结合，从而引起了靶mRNA在翻译水平的沉默。4.3 let-7 RNAlet-7 RNA结合于lin-41（另一种重要的发育调控基因）mRNA 3UTR上并进行负调控。let-7 RNA的序列在两侧对称的哺乳动物中高度保守。2000年，Amy Pasquinelli等将lin-4和let-4称作stRNAs(small temporal RNAs),并指出，更多的stRNAs仍有待发现。5 stRNA和siRNA的共同调控5.1 Dicer 与stRNA和siRNAstRNA和siRNA有共同的大小，暗示它们在介导基因沉默过程中的可能联系。遗传学的证据表明，Dicer联系着这两个过程。有两个RNase结构域，一个RNA解旋酶区和一个dsRNA结合区。Dicer可催化长dsRNA分解成2123nt的，还能将的稳定发夹结构的前体RNA分解成2123nt的stRNA。当用siRNA将Hela细胞中的Dicer消除时，会发生70nt2未加工的let-7前体RNA的积累。同样，在蠕虫中去除Dicer，会引起发育的异时性，同时也发生未加工的let-7和lin-4前体RNA的积累。5.2 EIF2C/Argonaute族蛋白EIF2C/Argonaute族蛋白是RNAi和stRNA的又一联系者。这类蛋白有一个保守的PAZ(Pawi-argonaute-zwille)区（也见于Dicer中），PAZ区的功能仍不明确。这类蛋白在各生物体的RNAi和PTGS中发挥至关重要的作用。最早发现EIF2C族蛋白是与核糖体相作用而调控翻译的，现已证明RNAi可能与核糖体发生作用。蠕虫的两种EIF2C族蛋白缺陷体（alg1和alg2），其发育呈异时性表型，同时积累未加工的lin-4前体RNA。同样，在果蝇中，两种与Argonaute同源的蛋白是RNAi必需的。实际上，人类的EIF2C蛋白是从RISC中纯化的。5.3其他的2123nt RNA 最近，在不同的生物体中，已发现90多种可能的发夹结构的RNA，其两侧序列可产生2123nt RNA。并非所有这些2123nt RNA都象lin-4和 let-7 一样时序性表达，于是只能统称为miRNAs(micro-RNAs)。也就是说，lin-4和 let-7可被称作miRNA，但因其具有表达的时序性及特殊的功能，当属于stRNA类。当然，还有其它类型的miRNA：如sdRNAs(spatal develepment RNAs)，srRNAs(stess response RNAs)及ccRNAs(cell cycle RNAs)等。通过对小鼠组织中miRNAs分布的研究，发现许多miRNA都是组织特异性的。同样，植物中的miRNA的分布也有组织和器官特异性。最近，David Bartel等指出，在植物体中，miRNA可能直接作用mRNA的ORFs而使靶基因沉默，其作用机制与siRNA介导的mRNA降解相似。看来在植物体内，绝大多数miRNA可与多个转录因子mRNA精确或近乎精确的互补。5.4 GEMIN3和GEMIN4 在哺乳动物中，许多miRNA的形成具有时空特异性，可能暗示其通过stRNA途径产生。miRNA的成批鉴定罕见相同者，足见其数量庞大。用EIF2C免疫沉淀法发现了两种与SMN复合体（survival of motor neurons complex）密切相关的蛋白，即 GEMIN3和GEMIN4。这两种复合体与各种核糖核蛋白复合体（RNP）的组装、重组和发挥功能密不可分。重要的是，与SMN复合体不同，miRNA和GEMIN3/4复合体包含与Argonaute同源的EIF2C和Dicer。GEMIN3/4复合体是否与RNAi有关，仍不明确；但GEMIN3有解旋酶区域，说明其可能与miRNA的加工有关。最近，Gyorgy Hutvagner和Phillip Zamore指出，miRNA和siRNA可能共存于同一复合体。他们发现，包含内源let-7（与人类同源）的复合体可直接引起外源mRNA（包含与let-7精确互补序列者）的降解。6 哺乳动物细胞中siRNA技术的应用6.1 siRNA技术应用概述目前，应用siRNA技术研究哺乳动物基因功能日益普遍。表1 概括了最近siRNA介导的哺乳动物基因沉默的一些结果。显而易见，被siRNA沉默的基因种类繁多，既有编码结构蛋白的，也有编码催化蛋白的。6.2 siRNA的转化siRNA的转化效率不仅取决于细胞的类型，还受继代次数以及细胞融合的影响。已发现，许多转化介质具有细胞特异性，因而必须慎重选择最合适的一种以用于某种细胞的转化。siRNA也可以电穿孔法导入目的细胞（正常情况下不易转化者），其转化效率高达95以上，但有5以上的细胞在电击过程中死亡。死细胞可以很容易冲洗去除（附着力下降）。 在几种低等真核生物中，RDP(RNA dependent polynerase)可以使长dsRNA增加，从而导致siRNA水平上升。在线虫中，许多siRNA在mRNA模板上延伸，形成了长dsRNA；长dsRNA在Dicer加工下产生更多的siRNA。哺乳动物细胞很可能没有这种siRNA的放大机制；而在植物和线虫中则依靠这一机制维持RNAi的活性和长寿命。事实如此。直觉上，高度表达的哺乳动物基因比低表达的基因更难沉默。研究表明，中度表达的一些基因（如核纤层蛋白基因）可被沉默到检测不到的水平；而高表达的肌动蛋白和波形蛋白基因被抑制后的水平仍足以显示出表型。这很可能是因为细胞中的每个RISC(RNA induced silencing complex)能够引发不同轮次的mRNA的降解。因为siRNA的活性、转化效率、细胞类型以及蛋白的稳定性等方面的差异，均会影响siRNA介导的RNAi的效率，所以，不同基因的沉默差异难以比较。但是，若同时抑制两个或更多高表达的基因又当如何？Elbashir等(2002)在Hela细胞中实现了对NUMA1(nuclear mitotic apparatus protein)和lamin的抑制。但M.T.M等报告，同时抑制高表达的细胞表面分子CD4和CD8殊非易事，因为CD4 siRNA与CD8 siRNA在沉默实验中存在竞争性。这一结果验证了在哺乳动物和果蝇细胞中，RNAi容量是可滴定的或者说是有限的。因此，用siRNA研究某个途径或网络的不同基因时，务必要小心控制siRNA的浓度。在siRNA降低蛋白水平的实验中，建立准确的时间历程至关重要。通常，siRNA引起的mRNA水平的迅速下降会在18h以内观察到。然而，不同的蛋白有不同的周转速率。在siRNA存在的条件下，稳定的蛋白比不稳定的蛋白需要更长的时间才会被削减。绝大多数情况下，siRNA介导的RNAi可维持35次细胞分裂，即对大多数细胞而言是35天，基因表达要恢复到正常水平则需710次细胞分裂。如果细胞处于饥饿或生长受阻状态，则siRNA的作用实效可被延长，表明siRNA活性的丧失很可能是因为它被稀释到有效水平以下，而不是因为它的降解。7 siRNA的靶mRNA7.1 靶mRNA序列的选择在哺乳动物细胞中，用siRNA去沉默特定的基因，必须十分慎重的考虑二者序列的互补性，以免影响到其他基因的表达。RNAi可以允许siRNA与mRNA在一定程度上的错配：12bp的错配只会部分降低靶mRNA的剪切效率，尤其是当错配发生在配对双链的近端位时，影响更小。Tuschl(2001)指出，在翻译起点下游50100nt的DNA序列，可以作用于靶基因；而其5或3UTR以及翻译起始点附近区域，因为含有调控蛋白结合位点，所以应避免使用。至今还不清楚mRNA的哪个区域对siRNA最合适。表1的结果指出，RNAi可以高效率的作用于整个的mRNA，包括其3UTR。然而，作用于靶mRNA的不同区域可能会产生不同的结果。例如，在与小鼠CD4和CD8基因序列互补的siRNA中，只有约1/5的siRNA起作用；实际上，仅当siRNA与CD4和CD8的3UTR或附近区域互补时，才会表现活性。在技术上，选择靶mRNA 3UTR有突出的优点：为了验证消除的症状，可以导入含有不同3UTR的该基因序列，并观察其症状能否恢复。7.2 靶mRNA的位置效应到目前为止，结合在同一靶mRNA上的不同siRNA的相对效率如何，尚缺乏系统的研究。实验结果指出，位置效应发生在密码子水平；也就是说，每次改变靶mRNA的一个三联体密码子，就会引起不同程度的沉默。以上表明，RNA结构可能控制着与siRNA的结合能力。此外，siRNA的序列也影响其在体外的活性。Michaelescherr等（1998）发明了一项用于选择最适的靶mRNA位点的技术，并且应用于HIV(2002)。今后的研究将证明此项技术能否被广泛应用。在实际工作中，如果某种siRNA未能沉默靶基因，则可以尝试另一个结合靶mRNA位点的siRNA。8 哺乳动物细胞的抗病毒感染RNAi的抗病毒作用，已见于植物和其他生物，但目前还未见到在脊椎动物中内源RNAi的抗病毒现象。Vira Bitko和Sailen Barik(2001)报道，用siRNA直接作用于RSV(respiratory syncytical vurus)mRNA，可抑制RSV mRNA的翻译。在培养细胞和人类原初T细胞中，siRNA已成功的抑制了HIV，可使HIV的水平降低3050倍。然而也发现了抗siRNA的病毒，这些具有抗性的病毒分子是早就存在的。因此应当采用几种不同的siRNA，以防止病毒大量增殖后产生抗性。82 siRNA技术应用举例最近向小鼠导入siRNA已获成功。向小鼠尾静脉注射siRNA，在多个组织中观察到了报告基因沉默，如在liver,spleen,lung,pancreas,和idney中发现，报告基因表达水平下降了510倍。但是这种转导技术具有有害副作用，故不能简单用于人类。因此发明一种适用于人类的siRNA转导技术是当务之急。也许有一天siRNA技术真的可以用于人类疾病的治疗。83 RNAi的抑制物在植物体内RNAi介导了抗病毒反应，而病毒也会产生强烈的RNAi抑制物。这些RNAi的抑制物序列各异，而且不同的抑制物阻抑RNAi途径的不同步骤。尽管目前发现的所有RNAi抑制物均为蛋白质，但不难想象，有些RNAi的抑制物可能是RNA。比如病毒可以编码自己的miRNA，作用于宿主细胞中的RNAi途径。哺乳动物病毒编码RNAi的抑制物到底是蛋白质还是RNA，仍不清楚。最近的报告（Li.H等2002）发现，一种昆虫和植物的双宿主病毒能产生一种蛋白质，这种蛋白质可以对两种宿主的RNAi途径进行抑制。9 内源沉默效应RNAs的结构 绝大多数的miRNA是从前体dsRNA发夹结构的臂上经不对称加工而来，也就是说，只从前体dsRNA的臂上产生一段2124nt的miRNA，有时这些2124nt的miRNA会形成精确配对双链的发夹结构，但更多的难以形成这种发夹结构（有太多的不配对突出部分）。和其他RNase一样，Dicer能够加工这种发夹结构（在臂上可以有几个错配碱基）。何种必须结构的stRNA或miRNA才能加工成21nt RNA，至今几乎一无所知。当lin-4和let-7作用其靶mRNA时，只有5085的碱基与靶mRNA 3-UTR互补配对。然而Sayda Elbashir等（2001）指出：siRNA的反义链与靶mRNA形成精确互补的双链结构，是RNAi介导mRNA降解所必须的。由于stRNA不能与靶mRNA形成精确互补的双链结构，故不能介导mRNA的降解。在果蝇中有两个3-UTR结构，即K-box(cUGUGAUa)和Brd box(AGCUUUA)，可能作为miRNA的有效作用位点。K-box和Brd box可以与miRNA的5端互补配对，一旦删除，转录的抑制作用即被解除。许多miRNA的5端可以与抑制子的3-UTR精确互补，暗示miRNA可以用来调控已知的基因。10、发夹结构RNA诱导基因沉默通过在低等生物体内表达长的发夹结构dsRNA(500-1000nt)，进而分析基因功能的技术已大获成功。在哺乳动物中，这种技术已在小鼠的胚胎干细胞中取得进展。然而，在不同的哺乳动物体细胞中，试图用如此长的发夹结构dsRNA以介导基因沉默，目前尚未成功。可能是因为长的发夹结构dsRNA活化了干扰素（IFN）相关途径，对基因表达缺乏特异性。为避免IFN反应，人们正试图用小的dsRNA结构以沉默基因。在哺乳动物细胞中，利用siRNA相关的加工途径以使靶基因稳定地保持沉默，技术上已经成熟，短短的3个月内已有9篇文章报告。利用DNA模板表达siRNA，可以取得与合成的siRNA相同的效果，即都能够使基因沉默。这些报告表明，siRNA的两个值得关注的问题，即转导效率和沉默状态的时效，终于被一并解决。表2列出了这些实验结果。在最早一篇报告（Brummel Kamp等2001）中，通过向培养细胞中导入人工合成的完整基因，以表达经特殊设计的发夹RNA，实现了对胞内TP53的表达抑制；而且在继代培养两个月后，抑制效果丝毫不减。由于Pol可以转录小分子RNA(如tRNA)，这些报告中，Pol用来转录siRNA或RNA发夹。Pol的应用有一大优点，即新生RNA 3末端总有1-4个U,这与siRNA相同。在前述报告中形成的RNA发夹结构，是直接以stRNA /miRNA做为模板的，发夹中包含突出、错配碱基对甚至环结构。在另一些实验中，siRNA双链只在一端以几个核苷酸简单相