姜黄素固体脂质纳米粒制备及理化性质研究.doc

姜黄素固体脂质纳米粒制备及理化性质研究邓睿园 1，宋金春2,吕桦1（1.武汉大学药学院，湖北 武汉 430072；2.武汉大学人民医院药学部，湖北 武汉430060）摘 要 目的: 以姜黄素为模型药物，山嵛酸甘油酯为载体材料制备姜黄素固体脂质纳米粒，并考察其质量和性质。方法：用乳化蒸发一低温固化技术制得了姜黄素固体脂质纳米拉，以单因素考察和正交设计法筛选处方和工艺, 并对其形态、粒径、表面电位、包封率、体外释药特等进行了研究。结果: 所得脂质纳米粒为类圆球状,粒径分布较均匀。样品粒径为(1345)nm,包封率为(67.41.3)%,平均Zeta电位值为(-23.51.5)mV。药物体外释放符合Higuchi方程。结论: 选择乳化蒸发低温固化法制备姜黄素固体脂质纳米粒方法可行,为开发姜黄素新型注射制剂提供了实验依据。关键词 姜黄素；固体脂质纳米粒；乳化蒸发低温固法；理化性质Preparation and Physico-chemical Property of Curcumin solid lipid nanoparticlesDENG rui-yuan1,SONG Jin-chun2, LV hua 1 (1.College of pharmacy, Wuhan university, Wuhan 430072, China ；2.Department of pharmacy, Renmin Hospital of Wuhan university, Wuhan 430060,china)ABSTRACT：OBJECTIVE To prepare the Curcumin solid lipid nanoparticles with docosanoic acid glycerol ester and investigate their quality and characteris .METHODS The method of emulsification evaporation- solidification at low temperature was used to the solid lipid nanoparticles (SLN) containing curcumin. the formula and technology were optimized by the single factor exploration and orthogonal design. Its morphology and particle size were examined by transmission electron microscope. Entrapment efficiency, Zeta potential, and the release of curcumin in vitro were studied. RESULTS The Cur -SLN assumed spherical shape.Its distribution of diameter was even with average particle size (1345) nm. Entrapment efficiency was (67.41.3)%. The Zeta potential was(-23.51.5)mV . The release of curcumin in vitro conformed to Higuchi Equation. CONCLUSION: The selected preparation technique of Cur-SLN is rational and practicable. It provides experimental evidence for developing a new curcumin injection.KEY WORDS :curcumin; solid lipid nanoparticles; emulsion evaporation-solidification at low temperature; Physico-chemical property姜黄素(Curcumin)是我国传统中药姜黄(Curcumin long L.)的主要活性成分，近年来，对姜黄素抗癌作用的实验研究表明,姜黄素可抑制肿瘤细胞的生长1，且抗癌谱广,毒副作用小,是一种具有良好应用前景的抗癌新药。但姜黄素水溶性差，在机体内难吸收，易代谢（口服生物利用度低,大部分以原形排出体外约89%)在体外也容易被氧化2，由于上述原因，为姜黄素的临床应用带来了一定的难度。因此需要进一步研制开发姜黄素的新剂型，以提高其溶解度，增强其药理作用。 本试验研制的姜黄素固体脂质纳米粒（Cur-SLN），以固态的天然或合成类脂为载体，将药物包裹于类脂核中，减少了姜黄素与水分散相及外界环境的接触,提高了姜黄素的稳定性，同时解决了姜黄素不易溶于水的难题。为开发姜黄素稳定性好的，静脉注射给药新剂型提供了实验依据。1 仪器和材料Agilent 1100型高效液相色谱仪，配四元梯度泵、DAD检测器、G137PA自动脱气机标准自动进样器柱温箱色谱工作站(美国Agilent公司)；UV2800型紫外可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）；Zeta电位P动态激光粒度分析仪(BrookHaven)；JEM-1200EX型透射电镜(日本电子)；TG328A型电子分析天平(上海天平仪器厂)；SHJ-A水浴恒温磁力搅拌器（江苏金坛市金南仪器厂）；卵磷脂（国药集团化学试剂有限公司 批号 20080129）；姜黄素原料药（分析纯，上海三爱思试剂有限公司，批号：20060712）姜黄素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110752-20060209）；山嵛酸甘油酯（四川西普化工股份有限公司，批号：45070401）；泊洛沙姆188 (德国BASF公司,批号：WPHC625E)；甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯）（美国TEDIA公司）；其他试剂均为分析纯(市售)。2 方法和结果2.1纳米粒的制备取处方量的姜黄素、山嵛酸甘油酯、卵磷脂和10 mL乙醇置于25 mL梨形瓶中，于80的恒温水浴上加热使其充分溶解,构成有机相。另取泊洛沙姆188溶于30 mL水中，水浴加热至和有机相相同的温度，构成水相，将有机相在1000r/min搅拌下注人水相中，温度保持在(802)，搅拌使有机溶剂完全蒸发并使体系浓缩至约5 mL，可得黄色半透明纳米乳剂。将所得纳米乳剂在搅拌(1000rmin-1)下快速混于0-2的水中，继续搅拌2h即得姜黄素固体脂质纳米粒的混悬液。2.2 Cur-SLN的形态学及粒径,Zeta电位考察取Cur-SLN混悬液适量,加适量蒸馏水稀释, 然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，2.0%磷钨酸钠溶液负染，在透射电镜下观察粒径大小和形态并拍摄照片。结果，所制得的纳米粒为类球形实体粒子,且粒径均匀。透射电镜图详见图1。取新鲜制备的Cur-SLN样品,加水稀释至适当浓度,用激光散射粒度测定仪测定其粒径,及Zeta电位，得平均粒径为(1345)nm,且粒径分布较窄,基本呈正态分布。粒径分布详见图2。Zeta电位平均值为(-23.51.5)mV。据文献报道3，4，易发生团聚的系统电位在2011mV。Zeta电位结果表明本试验室制备的SLN的稳定性良好。 图1 Cur-SLN的透射电镜照片 (29000) 图2 Cur-SLN的粒径分布图 Fig.1 Electron microscope photo of Cur- SLN Fig.2 The size distribution of Cur-SLN2.3 药物含量测定2.3.1 色谱条件 色谱柱为：ZORBAX SB-C18柱（5m，4.6250mm）；流动相:甲醇:乙腈:（5%醋酸）=55%:20%:25% 流速:1.0mLmin-1; 检测波长:433nm; 进样量:20L2.3.2 色谱条件专属性试验色谱条件：同2.3.1姜黄素标准品：3.2gmL-1的姜黄素标准液(A) ； Cur-SLN样品溶液：取Cur-SLN0.5mL置于50mL量瓶中，以甲醇定容（B）；空白对照液：取空白纳米粒0.5mL置于50mL量瓶中，以甲醇定容(C)。结果表明：辅料对Cur-SLN样品中姜黄素测定无干扰。色谱图详见图3。 (A) (B) (C)图3 HPLC色谱图：(A ) Cur标准品；(B) Cur-SLN；（C）空白SLNFig.3 HPLC：（A）Cur ;（B）Cur-SLN; (C) blank SLN2.3.3 标准曲线的制备 精密称取姜黄素标准品2mg，置25 mL的量瓶中，用甲醇溶解并定容，得姜黄素储备液。精密吸取不同体积的储备液，稀释成浓度分别为32，16，8，3.2，0.8,0.2 gmL-1的标准溶液，分别进样20L进行色谱分析,以峰面积(A)为纵坐标,药物浓度(C)为横坐标,得标准曲线方程为A=4.752+132.3C (R=0.9999 )。结果表明姜黄素在(0.2-32gmL-1)浓度范围内与峰面积的线性关系良好。2.3.4 回收率试验分别精密吸取80gmL-1溶液0.1mL1mL4mL,置于10mL容量瓶中,各加入0.5mL空白SLN,加甲醇适量,超声溶解,室温甲醇定容,配成药物浓度分别为0.8832 g/mL溶液。每种浓度平行测定3次,分别与在相同色谱条件下测得的相应浓度Cur对照品的峰面积对比。结果计算其 绝对平均回收率依次为103.4% (RSD=0.61%,n=3)、102.2%(RSD=0.70%,n=3)、99.74%(RSD=1.06%,n=3)。2.3.5 精密度试验取上述样品溶液,一日内3次,测定日内精密度;每日测定一次,连续测3d,测定日间精密度。经计算低、中、高3种不同浓度的日内RSD(%)值依次为0.23、1.65、0.18;日间RSD(%)值依次为1.89、0.89、0.21。上述结果表明,该分析方法的回收率和精密度均符合方法学要求。2.4 包封率的测定 吸取0.5 mLCur-SLN混悬体系上葡聚糖凝胶G-50(Sephadex G-50)柱，用蒸馏水洗脱，接取带乳光流分, 甲醇定容到50mL，再精密量取5mL加甲醇定容至10 mL；另取0.5 mL样品直接加甲醇溶解并定容到50mL，移取5mL用甲醇定容到l0 mL。将2种样品分别用HPLC测定出Cur的含量后，按下式计算包封率。包封率=W包W 总 (W包为Cur-SLN混悬液通过Sephadex G-50后测得的姜黄素含量；W总为Cur-SLN混悬液直接破乳定容后测得的姜黄素)。2.5 正交设计试验及方差分析在单因素试验的基础上发现，投药量，乳化剂和载体材料的用量对包封率有较大的影响。因此，选择投药量(A)、泊洛沙姆188 ( B)、山嵛酸甘油酯(C)和卵磷脂(D)的用量4个因素进行正交试验，在单因素考察的基础上，确定4因素3水平，以包封率为考察指标，按L9(43)正交试验设计表设计，筛选最佳处方组成和制备工艺。因素水平与正交试验结果详见表1和表2。表1正交设计的因素和水平Tab. 1Factors and levels of orthogonal designfactorsABCDLevels(mg)投药量泊洛沙姆188山嵛酸甘油酯卵磷脂1614014020028200200320310320260400 表2正交试验的结果 Tab. 2Results of orthogonal experimentNO.ABCDEN（%）1111127.82122240.13133354.34212340.05223141.66231267.47313223.68321328.29332137.9K140.7330.4741.1335.77K249.6736.6339.3343.70K329.9053.2039.8340.83R19.7722.731.807.93 表3方差分析结果Tab. 3Results of variance analysis因素偏差平方和自由度均方FPA587.92293.9113.50.05B829.32414.6160.10.05D96.83248.4218.690.05误差5.18022.590注:根据直观分析法的结果,以C因素作为误差列进行方差分析, F0. 05(2, 2)=19由表2中的极差值R可得知各因素影响的主次顺序是BADC，说明泊洛沙姆188用量, 主药量,卵磷脂用量及山嵛酸甘油酯用量的影响依次减弱。由方差分析的结果得知A、B因素有显著影响(P0. 05)。选取显著因素的最高水平,并综合直观分析的结果,初步确定最佳处方为由此得出各因素的最优化组合A2B3C1D2。最佳处方：主药用量8mg, 泊洛沙姆188用量320mg , 山嵛酸甘油酯140mg, 卵磷脂用量320mg。2.6 验证性试验按照优化后的处方制备3批Cur-SLN,测定粒径，Zeta电位和包封率,结果见表4。表4Cur-SLN的平均粒径, Zeta电位和包封率Tab. 4Mean size，Zeta potential and the encapsulation efficacy of Cur-SLNNod(粒径) /nmU(Zeta电位) /mV包封率/%1129-23.566.32138-25.068.73136-22.167.11345-23.51.567.41.32.7体外释放度取Cur-SLN制剂2m L，置于透析袋中，除去袋内气泡，固定于200m L的0.5%吐温80生理盐水中，袋上沿距液而约lcm, 释放介质的温度控制在(370. 5)，置于电磁搅拌器中速搅拌，分别于不同时间点取样2mL，然后补加相同体积的释放介质。将样液过滤(0. 45m) , 取过滤液20uL进样，HPLC测定释放介质中药物浓度，计算累积释放率。结果见图4。 图4 Cur-SLN的体外释药曲线Fig.4 Releasing curves of Cur-SLN in vitro结果表明，在释放条件下，前12时释药速率较快，随后缓慢释放，经过96h药物累计释放约80%.把累计释放度与时间的平方根( t1/2)回归，发现两者有明显的相关性。Cur-SLN的释药符合Higuchi方程Q=7.778t1/2+5.159(R=0.9930)。3 讨论3.1 姜黄素分子结构中含有双键，酚羟基及羟基等多个活性基团，其化学反应性较强。故在选择处方中的其它成分，考察制备条件时都应该不影响姜黄素的稳定性。据文献报道5大豆卵磷脂的不饱和脂肪酸含量和脂肪酸的不饱和度高，容易被氧化，对姜黄素的稳定性会产生较大影响。故本试验选择蛋黄卵磷脂。3.2 载体材料山嵛酸甘油脂的熔点为：69-74，制备过程的温度应高于此。结合本实验室前期考察姜黄素光、热稳定性，及单因素考察制备工艺的结果，确定80避光条件下乳化2h,不影响姜黄素的稳定性。3.3 在低温固化纳米粒时发现，固化降温过程应该迅速，降温时间过长易导致微乳液滴的聚集，使形成的粒子粒径增大，而纳米粒体系的稳定性下降。固化过程温差越大，纳米粒越不易粘连，越有利于脂质的固化6。3.4 本试验选用山嵛酸甘油脂为载体制备的Cur-SLN具有较高的包封率，原因可能：在熔融状态下，载体材料与药物的相容性较好；山嵛酸甘油脂是二十二烷酸的单甘脂、双甘脂及三甘脂的混和物，与单一脂质材料为载体相比，能提高包分率7。3.5 研究该类制剂体外释放时，为模拟体内条件，常选pH7.4的磷酸盐缓冲液或生理盐水做释放介质。由于Cur在碱性条件下稳定性差8故本实验选择生理盐水作释放介质。但Cur难溶于水，为达到漏槽条件，可在介质中加入一定的表面活性剂以增大其在水中的溶解度。综合考虑不同表面活性剂对姜黄素稳定性的影响8最终确定以含0.5% Tween80的生理盐水作释药介质。3.6 Cur-SLN的体外释药曲线符合Higuchi方程，释放过程可分为两个阶段 ：前期释药速率较快，可能原因是药物分子一部分吸附在纳米粒的表面，或者富集在纳米粒的外层。而纳米粒表面也结合了较多表面活性剂，有利于表面药物的溶出。后期药物释放速度缓慢，可能药物以固态溶液的形式分散在脂质中，药物随着脂质材料的的熔融而释放，故表现为持续，缓慢的释药过程。REFERENCES1 XU DH,WANG S,JIN J, et al. 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