第二讲 正常和肿瘤组织细胞的培养(200910).ppt

第二讲正常和肿瘤组织细胞培养 温州医学院检验医学院陶志华 内容 正常组织细胞培养上皮细胞的体外培养血管内皮细胞的体外培养肾小管上皮细胞的培养巨噬细胞的培养淋巴细胞的培养肿瘤细胞培养 上皮组织的体外培养 上皮细胞的基本特征 1 上皮组织的形态结构群体依赖性 populationdependence 接触抑制 contactinhibition 2 上皮细胞的极性贴壁依赖性细胞 贴壁生长生长基质3 上皮细胞间的连接 体外培养的上皮组织细胞的生长生物学 1 形态学结构 均质性 透明性很强 结构不明显 2 体外培养上皮组织的生长与增殖特征 1 体外培养的特殊条件 a 防范微生物污染b 生长基质的基质c 特殊的培养基M199RPMI1640DMEMFamF12无血清培养基d 去成纤维细胞 2 体外培养上皮细胞的形态学变化 3 体外培养上皮细胞的生存状态 体内 机体自身神经和内分泌因素体外 促细胞增殖因子和促细胞分化因子 细胞增殖态细胞分化态 体外培养上皮组织细胞的观察与检测 1 一般形态学观察光镜 形态 轮廓 生长情况等 细胞规则 明亮而饱满 细胞轮廓不清电镜 桥粒 形态结构特征 细胞间关系培养液pH变化 颜色变化 培养物的污染情况 透明度变化 2 组织化学与免疫组织化学观察与检测酶类 碱性磷酸酶琥珀酸脱氢酶特异性抗原标记物 角蛋白 上皮细胞膜抗原VIII因子 晶体蛋白 唾液酸糖蛋白 血管内皮细胞的体外培养 人脐静脉内皮细胞的培养 组织来源 婴儿脐带培养用液 M199 20 FCSD Hanks0 1 胶原酶溶液培养用具 1 主要材料 2 培养方法 分离细胞培养法 1 关于接种材料的制备取材与消化消化酶 浓度 时间 2 排除成纤维细胞传代去除法加肝素培养法 90u ml 刮除法 3 关于培养液 4 关于传代培养 5 讨论 1 光镜检查 2 透射电镜检查 W P小体 3 VIII因子相关抗原的免疫组化检测 6 内皮细胞的鉴定 肾小管上皮细胞的培养 1 主要材料 a 细胞来源 b 无血清培养液 基础培养液 DMEM HamF12 1 1 添加物 胰岛素5 g ml转铁蛋白5 g ml硒5 g ml氢化可的松36ng mlT34ng mlEGF10 g ml c 消化液 0 2 胰蛋白酶d 细胞筛网 80和100目 2 原代培养 切取1cm3外层肾皮质 剪碎成1mm380目研磨冲洗 于100目上收集肾小管节段0 2 胰蛋白酶消化 调整细胞数接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养每隔3 4天 更换培养液 3 传代培养 4 培养结果 3d长出细胞5 7d进入对数生长期7 9d融合成单细胞层5 鉴定 抗角蛋白抗体染色 6 注意事项 a 分离方法 b 鉴定方法 巨噬细胞的培养 巨噬细胞的培养 动物 小鼠 大鼠 兔 人培养基 EagleMEMRPMI1640HamF12常用的巨噬细胞 肺泡和腹腔巨噬细胞 获取巨噬细胞的方法 一 肺泡巨噬细胞支气管肺泡灌洗法支气管镜肺泡灌洗法 二 腹腔巨噬细胞1 小鼠腹腔巨噬细胞的获取 1 主要材料 实验动物 6周龄小鼠培养液 10 FCSRPMI1640 巨噬细胞的纯化 1 原理 巨噬细胞黏附能力强 贴壁快特点贴附培养时间贴附培养温度2 方法 常规差速黏附处理 低温差速黏附处理 巨噬细胞的接种和培养 一 主要材料 培养液 RPMI1640等 10 40 FCS 抗生素 二 实验步骤 a 冷分离b 调整细胞浓度 2 4 106 mlc 接种培养 三 培养结果 大小 20 50 m形态 菱形 星形 圆形功能 吞噬功能增殖情况 不增殖 存活1 3周 四 巨噬细胞的鉴定1 吞噬实验 加入0 001M finalcon SiO2吞噬泡2 抗胰蛋白酶消化能力试验 0 25 胰蛋白酶消化20min 再用吸管反复吹打细胞变园但不脱落3 细胞化学试验 ACP酶染色 棕黑色NSE酶染色 紫蓝色 淋巴细胞的培养 各类淋巴细胞的主要特征 表面标志 1 表面受体 TCRSRBCRFcRMRMeaslesviruseR T淋巴细胞 MHCCD 2 表面抗原 B淋巴细胞 1 表面受体BCRFcRCR丝裂原受体EBVR2 表面抗原MHC抗原CD抗原 CD19 20 21 23 45 血淋巴细胞的分离 一 单个核细胞的分离 密度梯度离心法 二 纯淋巴细胞的制备 1 玻璃黏附法2 羰基铁粉法 三 T B淋巴细胞的分离 1 T细胞花环沉降法2 尼龙毛柱分离法 四 大颗粒淋巴细胞的分离 五 FACS仪分离 六 免疫磁珠法 三 血淋巴细胞的体外培养应用 一 淋巴细胞转化试验 二 B细胞产生Ig的检查 三 T细胞介导的细胞毒试验 四 NK细胞毒性试验 五 K细胞毒性试验 六 LAK细胞的制备 七 TIL细胞的制备 八 淋巴细胞的体外长期培养 1 用IL 2建立T淋巴细胞克隆2 用EB病毒转化B淋巴细胞3 用B细胞生长因子建立B淋巴细胞株 肿瘤细胞体外培养 肿瘤细胞在体外的生长生物学特性 1 肿瘤细胞永生性的保持2 形态学变化3 细胞具有更高的增殖能力4 细胞表面形状的改变5 接触抑制减弱或消失6 悬浮生长特性7 成瘤性的特性 RPMI1640 10 20 FCS 0 03 谷氨酰胺 上皮性癌细胞或悬浮性肿瘤细胞DMEM 199 MEM 肉瘤细胞的培养F12 L 15 上皮性癌细胞的培养 如肝癌细胞 加 2g LNaHCO320mmol LHEPES 肿瘤细胞体外培养常用的培养基 一 培养液的种类和选择 二 培养液特殊添加剂 常用的促细胞生长因子及使用的终浓度添加剂终浓度BSA10 5mol mlTRF5 10ug mlInsulin5ug ml氢化可的松10 6mol mlEGF5ng mlFGF5ng mlNGF5ng ml 肿瘤组织细胞的原代培养 一 取材转移癌标本 原发癌标本 二 植块培养法建立细胞培养档案 病理切片 免疫组化 HE染色 步骤 三 分散细胞培养法1 组织细胞分离 机械分散法胶原酶分散法2 接种密度 1 106 ml4 5ml 25cm2培养皿或培养瓶 四 含肿瘤细胞的体液培养法 五 原代培养的一般结果 成纤维细胞的生长淋巴细胞巨噬细胞上皮性癌细胞植块周边的细胞细胞间隙 1 刮除法2 差速黏附法3 酶消化法4 磁珠法细胞分选 六 去除成纤维细胞的方法 1 不同培养方法的生长情况2 传代 3 原代培养过程中避免污染和耐心操作 七 注意事项 二 肿瘤细胞的传代 一 首次传代 二 继续传代 肿瘤细胞的克隆培养法 1 集落克隆法 a 不锈钢圈法b 滤纸法c 吸管吹打法2 单个细胞克隆培养法a 有限稀释法b 毛细管分离法c 盖玻片法 肿瘤细胞体外生长的形态学与细胞学特征 1 形态学特征 2 肿瘤细胞生长曲线和倍增时间 肿瘤细胞的核型和异常生长特性 1 染色体数目及核型2 永生性3 异质性4 动物接种成瘤性 细胞系的鉴定 一 细胞系鉴定的内容 1 鉴定细胞系的纯度2 细胞系的稳定性3 细胞学特征4 微生物污染检测5 染色体稳定性6 有无细胞系 株 交叉污染 四 细胞系的同工酶谱分析 1 用途 a 种属来源b 细胞特征的指标c 恶化程度的指标d 检测细胞系有无交叉污染LDHG6PDNP 动力学法电泳区分法层析法电聚焦分离法免疫法 2 检测方法 已建立细胞的鉴定 管理和使用 组织起源和已传代数冻存液细胞活力培养液 培养基 血清 抗生素等溶解后细胞生长特征接种存活率细胞形态 肿瘤细胞培养的应用 一 肿瘤细胞对组织浸润的体外研究二 人恶性肿瘤细胞的动物移植瘤研究三 肿瘤细胞的体外分化实验四 培养肿瘤细胞的凋亡诱导研究五 肿瘤