高产淀粉酶菌株的筛选.docVIP

1 材料与方法1. 1 实验材料1. 1. 1 土壤来源: 采自温州市某面粉加工厂以及粮食加工厂附近土样。1. 1. 2 培养基配置: 淀粉培养基: 称取牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaC l 5 g、可溶性淀粉2 g 溶于900 m l蒸馏水中, 再加入25 g琼脂粉并搅拌至充分溶解, 调pH 至7. 2, 最后加蒸馏水定容至1000 m ,l 高压蒸汽灭菌; 种子培养基( LB): 除不加琼脂粉外, 其它成分和淀粉培养基配置相同。1. 1. 3 主要试剂和溶液的配制: 1% 3, 5- 二硝基水杨酸试剂: 精确称取1 g 3, 5- 二硝基水杨酸, 溶于20 m l 2 m ol/L氢氧化钠溶液中, 加入蒸馏水50 m ,l 再加入四水酒石酸钾钠30 g, 待溶解后用蒸馏水定容至100 m ,l 盖紧瓶塞, 隔绝CO2。0. 4 g /L淀粉缓冲溶液配制: 称取NaC l 4. 5 g、Na2HPO412H2O( AR) 28. 47 g 和KH2 PO4 6. 25 g 溶于约250 m l蒸馏水中, 加热至沸, 另取一小烧杯精确称取可溶性淀粉0. 2 g 加入蒸馏水约5 m l使溶液成糊状加入上述沸腾之溶液中, 用蒸馏水洗烧杯一并倒入。冷至室温, 加入37%甲醛溶液2. 5m ,l 调溶液pH 为7. 0 # 0. 1, 用蒸馏水稀释到500 m ,l 放置到冰箱保存。0. 1 m o l/L 碘贮存液: 溶解1. 8735 g 碘酸钾( KIO3 ) 及22. 5 g碘化钾( K I) 于约400 m l蒸馏水中, 缓慢加入4. 5 m l浓盐酸, 边加边搅拌, 用蒸馏水稀释到500 m ,l 充分混匀, 贮棕色瓶, 塞紧, 置冰箱保存。0. 1%麦芽糖溶液: 称取麦芽糖100 mg, 蒸馏水溶解并定容至100 m l。1. 2 实验方法1. 2. 1 初筛方法:称取土样5 g, 倒入装有45 m l蒸馏水并带有玻璃珠的锥形瓶中, 振荡混匀, 放入60! 水浴箱水浴1 h, 吸取土壤悬液1. 5 m l于装有150 m l LB 培养基的锥型瓶中,150 r /m in, 摇床振荡4 h。取1 m l此溶液进行倍比稀释, 分别把10- 3 10- 7这5个浓度的稀释液用棉签涂布于平板培养基表面, 待表面干燥后, 倒立, 放置37! 恒温箱培养16 h 18 h,待长出菌落后, 滴加卢戈碘液, 挑取有明显淀粉水解圈的单菌落, 进行四区划线。1. 2. 2 复筛方法: 将1 号, 2号, 3号菌株初筛四划法后在第四区出现的单菌落挑取各自最有代表性的菌落在平板上进行接种, 每个点3下, 将平板分成9个区域。用同样的方法, 把其余菌株也用此方法接种, 37! 培养16 h 18 h, 长出菌落后, 滴加卢戈碘液, 用游标卡尺分别测量水解圈直径D 和菌落直径d, 计算D /d的平均值。根据两者比值大小初步确定淀粉酶活性的高低, 同时对每号菌株都进行显微镜检查, 并将菌株保存。酶活性测定采用碘比色法和3, 5 - 二硝基水杨酸显色法进行测定。碘比色法采用全国统一操作规程(第三版) 5 略作修改, 操作如下: 取1. 5 m l待测菌液离心, 4000 r/m in, 30 m in。取试管3 支, 标明B0, B 及U ( B0: 空白管, B: 对照管, U: 待测管) , 分别加入0. 4 g /L的淀粉缓冲液1 m l( 已37! 预温)。U管中加入离心所得的上清夜100 ,l B0 管中加入蒸馏水100 l。混匀后放入37! 水浴箱准时水浴7. 5 m in, 取出加入碘应用液1 m ,l 摇匀, 此时B管中加入上清液100 l。各管再加蒸馏水6 m ,l 摇匀, 在660 nm 的波长下测其吸光度。酶活性单位定义: 100 m l上清液中的淀粉酶, 在37! 下15 m in水解5 mg 淀粉为1个酶活性单位。碘比色法酶活性单位计算: U=AB - AUAB0 803, 5- 二硝基水杨酸显色法测定结果查标准曲线。酶活性定义: 40! 实验条件下, 在5 m in 内水解淀粉产生1 m g麦芽糖的淀粉酶量为1个酶活性单位。1. 3 细菌鉴定参照%伯杰细菌鉴定手册& ( 第8版) 6 , 鉴定项目包括: 形态观察、革兰氏染色、木糖产酸、V - P试验、乳糖产酸、麦芽糖产酸、蔗糖产酸、D- 核糖产酸、淀粉水解等, 所用方法参见文献 7 。1. 4 酶动力学参数检测配制pH 值分别为5. 7、6. 4、6. 6、7. 0、7. 5的缓冲溶液, 在不同pH 缓冲液中测定淀粉酶活性, 确定最适pH; 分别在30! 、37! 、40! 、45! 、50! 条件下按淀粉酶活性的测定方法测酶活性, 确定最适温度。1. 5 产酶条件优化分别用配置的碳源( 淀粉) 浓度