中空多孔金属假体复合诱导因子对骨髓间充质干细胞生长及成骨分化的影响.doc

www.CRTER.org赵子春，等. 中空多孔金属假体复合诱导因子对骨髓间充质干细胞生长及成骨分化的影响中空多孔金属假体复合诱导因子对骨髓间充质干细胞生长及成骨分化的影响赵子春，李凌伟，曹志强，李钊伟，李春亮，齐圆圆(青海大学附属医院创伤骨科，青海省西宁市 810000)引用本文：赵子春，李凌伟，曹志强，李钊伟，李春亮，齐圆圆. 中空多孔金属假体复合诱导因子对骨髓间充质干细胞生长及成骨分化的影响J.中国组织工程研究，2016，20(25):3673-3679.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.25.004 ORCID: 0000-0002-1956-1583(赵子春)文章快速阅读：骨形态发生蛋白2对中空多孔金属假体支架内骨髓间充质干细胞生长及成骨分化的影响赵子春，男，1972年生，副主任医师，主要从事假体生物材料的应用研究和骨科创伤的临床研究。中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)25-03673-07稿件接受：2016-03-24接种于中空多孔钛合金假体支架上分别以含0，0.001，0.01，0.06，0.1 g/L骨形态发生蛋白2的DMEM培养基培养分离培养骨髓间充质干细胞培养0，6，12，24，48 h，采用MTT法检测细胞黏附情况；培养18 d，茜素红染色检测细胞成骨分化能力；培养0，6，12，24，48 h后，检测细胞迁徙能力 文题释义：诱导因子骨形态发生蛋白2：是转化生长因子超家族成员之一，具有诱导未分化间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖能力，促进成骨细胞分化成熟，参与骨和软骨生长发育及其重建过程，进而加速骨缺损修复。骨形态发生蛋白2在体内以前体形式合成，经蛋白酶切去除信号肽和前肽，得到由114个氨基酸残基组成成熟肽。成熟肽通过7对二硫键将其保守结构正确折叠。成熟肽同源或异源二聚体才具有生物活性。骨组织工程：指将分离的自体高浓度成骨细胞、骨髓基质干细胞或软骨细胞，经体外培养扩增后种植于一种天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人体逐步降解吸收的细胞支架或细胞外基质上，然后将这种细胞杂化材料植入骨缺损部位，在生物材料逐步降解的同时，种植的骨细胞不断增殖，从而达到修复骨组织缺损的目的。摘要背景：将骨形态发生蛋白与中空多孔钛合金复合，可提升材料与周围骨组织的亲和力。目的：观察骨形态发生蛋白2对中空多孔金属假体支架内骨髓间充质干细胞生长及成骨分化的影响。方法：将第3代SD大鼠骨髓间充质干细胞直接接种于中空多孔金属假体支架上，分别以含0，0.001， 0.01，0.06，0.1 g/L骨形态发生蛋白2的DMEM培养基培养，培养0，6，12，24，48 h，采用MTT法检测细胞黏附情况；培养18 d，茜素红染色检测细胞成骨分化能力。将Transwell培养池置于中空多孔金属假体支架上，上室加入5108 L-1的骨髓间充质干细胞悬液，下室分别加入含0，0.001，0.01，3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 0.06，0.1 g/L骨形态发生蛋白2的DMEM培养基，培养0，6，12，24，48 h后检测细胞迁徙能力。结果与结论：培养6-48 h，不同质量浓度骨形态发生蛋白2呈时间依赖性促进骨髓间充质干细胞的黏附；培养18 d，经不同质量浓度骨形态发生蛋白2干预后，骨髓间充质干细胞由梭形改变为多角形，细胞呈多层性、重叠性排列，形成大量钙化结节，茜素红染色呈鲜红色；培养6-48 h内，骨形态发生蛋白2可促进骨髓间充质干细胞的迁徙，且呈浓度、时间依赖性；结果表明：骨形态发生蛋白2可增强中空多孔金属假体支架上骨髓间充质干细胞在的黏附能力、成骨分化能力与迁徙能力。关键词：生物材料；骨生物材料；中空多孔金属假体支架；复合诱导材料；骨形态发生蛋白2成骨诱导因子；骨组织工程；骨髓间充质干细胞 Zhao Zi-chun, Associate chief physician, Department of Trauma Orthopedics, Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining 810000, Qinghai Province, China主题词：骨形态发生蛋白质类；假体和植入物；干细胞；组织工程Effects of hollow porous metal prosthesis combined with inducible factors on growth and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cellsZhao Zi-chun, Li Ling-wei, Cao Zhi-qiang, Li Zhao-wei, Li Chun-liang, Qi Yuan-yuan (Department of Trauma Orthopedics, Affiliated Hospital of Qinghai University, Xining 810000, Qinghai Province, China)AbstractBACKGROUND: Bone morphogenetic protein in combination with hollow porous titanium alloy can improve the affinity with surrounding bone tissues. OBJECTIVE: To observe the effects of bone morphogenetic protein 2 on growth and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells cuftured on a hollow porous metal prosthesis scaffold.METHODS: Passage 3 Sprague-Dawley rat bone marrow mesenchymal stem cells were directly inoculated onto a hollow porous metal prosthesis, and then the scaffold was cultured in DMEM medium containing 0, 0.001, 0.01, 0.06 and 0.1 g/L bone morphogenetic protein 2, respectively. At 6, 12, 24 and 48 hours after inoculation, cell adhesion was detected by MTT assay. Cell osteogenic differentiation was detected by alizarin red staining at 18 days. Besides, Transwell culture was put on the scaffold, and 5x108/L bone marrow mesenchymal stem cells were added into the upper chamber, and DMEM medium containing 0, 0.001, 0.01, 0.06 and 0.1 g/L bone morphogenetic protein 2 were added into the lower chamber to observe cell migration capability after 0, 6, 12, 24 and 48 hours culture.RESULTS AND CONCLUSION: After 6-48 hours of inoculation, different mass concentrations of bone morphogenetic protein 2 promoted adhesion of bone marrow mesenchymal stem cells in a time-dependent manner. After 18 days of inoculation, bone marrow mesenchymal stem cells induced by different mass concentrations of bone morphogenetic protein 2 changed from fusiform to polygon, and arranged in a multilayer and overlapped form. Numerous calcified nodules could be found, which were stained red by alizarin red. Additionally, within 6-48 hours of culture, bone morphogenetic protein 2 could promote the migration of bone marrow mesenchymal stem cells in a concentration-and time-dependent manner. In conclusion, bone morphogenetic protein 2 can enhance the adhesion, osteogenic differentiation and migration of bone marrow mesenchymal stem cells cultured on the hollow porous metal prosthesis.Subject headings: Bone Morphogenetic Proteins; Prostheses and Implants; Stem Cells; Tissue EngineeringCite this article: Zhao ZC, Li LW, Cao ZQ, Li ZW, Li CL, Qi YY. Effects of hollow porous metal prosthesis combined with inducible factors on growth and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(25):3673-3679.3677ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction人工关节中生物固定假体材料的稳定性，主要依赖于假体界面骨组织细胞的生长，以维持长期的机械稳定性1-2。然而长期随访研究发现，由于假体材料表面骨生长程度及范围的限制，无菌性松动率仍较高，导致其应用范围受到一定程度的限制。近年来，研究的重点是如何提高假体置入后骨组织的生长及假体周围骨着床的能力及范围，以获得更加长期稳定的生物学效果，成为人工假体组织迫切需要解决的关键问题3-5。目前非骨水泥固定人工关节慢慢走入人们的视线，采用微孔技术及成骨诱导因子促进骨组织细胞的生长，以扩大假体周围骨质的生长及分化，对骨组织工程修复起到重要作用。若能够通过假体置入并在其壁上打多个微孔，可利于内外营养物质的流通及输送，加入成骨诱导剂后，不仅可提升假体内成骨细胞的生长存活，还可提高假体与骨组织面的结合稳定性及范围，有助于生物固定假体材料与骨质达到真正的融合6-7。组织工程为中空人工关节假体的开发提供了有力的研究依据和条件8。早前的骨组织工程支架材料多为生物可降解性材料，此类材料主要由有机聚合物和无机材料构成，可模拟天然骨组织细胞生长的基质环境，具有良好的骨诱导活性及生物相容性，用于临床骨缺损修复。但由于其生物力学强度有限，在骨组织替代和修复过程中强度不够，因此造成人工关节假体的承载力受到一定的限制。目前，将金属材料的刚性支撑与骨组织工程成骨诱导再生相结合，应用于人工关节置换方面的研究尚少9-12。近年来的关注点主要在支架材料与生长因子对骨质诱导的作用上，对于如何选择诱导剂和载体来提高细胞和材料之间亲和力方面的研究不多13-14。因此，实验在组织工程学原理的指导之下，利用中空多孔金属假体支架材料作为骨组织工程再生工程的支架，观察假体界面骨髓间充质干细胞的生长及分化情况，并探讨应用成骨诱导因子骨形态发生蛋白2之后对支架内骨髓间充质干细胞成骨活性的影响。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 观察性实验。1.2 时间及地点 实验于2014年6月至2015年6月在青海大学医学院神经分子实验室完成。1.3 材料 实验动物：8周龄清洁级雄性SD大鼠15只，体质量(20010) g，由青海大学医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2013-0020。实验过程符合2006年科学技术部发布的关于善待实验动物的指导性意见，对动物处置符合动物伦理学要求。 中空多孔金属假体材料：钛合金，长10 mm，直径6 mm，内径5 mm，材料两端封闭，在壁上的对称位置打孔，横向6排，每排5个1 mm的小孔，将羟基磷灰石喷涂在材料内外界面上，见图1。实验中应用的主要试剂及仪器：试剂及仪器来源骨形态发生蛋白2美国Sigma公司DMEM培养基，胎牛血清美国Gibco公司Transwell 24孔培养板Biolegend公司PBS、流式试剂盒武汉博士德生物有限公司细胞培养超净台苏州净化公司细胞培养箱美国Queue systems公司电子显微镜日本奥林巴斯公司高转速冷冻离心机德国BiofugeStratos公司冰箱日本松下公司高压消毒箱美国Tuttnauer公司流式细胞仪美国伯乐公司计算机图像分析系统澳大利亚Rotor-gene公司MTT试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司1.4 实验方法 骨髓间充质干细胞的分离、培养：参考文献15的方法分离培养SD大鼠股骨骨髓间充质干细胞，加入 2 g/L的型胶原酶，以DMEM培养基悬浮组织，置37 恒温培养箱中消化1.5 h，弃消化液，PBS清洗3次，加入含血清培养基后，置体积分数5%CO2、37 饱和湿度的孵箱中培养。在24 h首次换液后，1 000 r/min离心 5 min，弃上清后采用完全培养基进行重悬，计数板计数之后，将细胞浓度调整到5109 L-1，接种在培养瓶中，每3 d换液1次，待细胞长至90%-95%融合，以0.25%胰蛋白酶消化传代，将5105个细胞数接种于25 mL培养瓶，标记为P1，以后每三四天换液，待细胞达到融合生长后继续传代，在含体积分数5%CO2培养箱中进行贴壁培养，运用倒置显微镜观察细胞生长状况和形态变化，使用P3代细胞进行下一步实验。 中空多孔金属假体材料与细胞共培养16：将生长状态良好的P3代骨髓间充质干细胞以5107 L-1的细胞浓度种植于中空多孔金属假体材料内，每天在倒置相差显微镜下观测细胞状态并拍照，待细胞70%-80%融合，PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛15 min固定，5 min Giemsa染液染色，双蒸水冲洗，显微镜下拍照。40 g/L多聚甲醛固定细胞之后，以体积分数3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶15 min，使用PBS洗3次，0.5%曲拉通打孔15 min，PBS洗3次，5% BSA封闭30 min，甩干，不洗，滴加兔多克隆抗体CD44、CD34、CD105，4 过夜后，PBS洗5次，滴加生物素标记二抗羊抗兔，PBS洗5次，常温30 min，滴加SABC-FITC，SABC-CY3室温30 min之后，PBS洗5次，Hoechst33258染核5 min，抗荧光淬灭封固剂封固，荧光显微镜拍照17。 骨形态发生蛋白2对骨髓间充质干细胞黏附能力的影响：取P3代骨髓间充质干细胞，以1104孔的密度接种至中空多孔金属假体材料上，细胞贴壁后，弃掉原有培养基，分别加入含0.001，0.010，0.060，0.100 g/L骨形态发生蛋白2的DMEM培养基100 L进行培养，对照组只加含等量胎牛血清的DMEM培养基，在培养0，6，12，24，48 h，加入5 g/L MTT试剂20 L，37 孵育 4 h，弃掉原有培养基，再加入150 L DMSO，持续振荡混匀10 min，通过酶标仪检测490 nm的吸光度A值，以表示黏附的细胞数量，实验重复3次，取平均值。 骨形态发生蛋白2对骨髓间充质干细胞向成骨分化的影响：取P3代骨髓间充质干细胞，以5108 L-1的细胞浓度接种于含中空多孔金属假体材料的10 cm2培养皿内，对照组不加入骨形态发生蛋白2，实验组分别加0.001，0.010，0.060，0.100 g/L的骨形态发生蛋白2 100 L，连续诱导18 d，去掉培养液，用PBS洗2次。用40 g/L多聚甲醛固定10 min，用ddH2O洗3次。然后加入2%茜素红(pH=4.1)，室温孵育15 min，去掉茜素红染液，ddH2O洗3次，倒扣培养板在滤纸上吸干水分，扫描仪扫描记录存图。然后在倒置显微镜下观察照相。 骨形态发生蛋白2对骨髓间充质干细胞体外迁移的影响：取P3代骨髓间充质干细胞，于种板前1 d血清饥饿12 h，常规消化、离心收集细胞，以含体积分数0.2%胎牛血清的DMEM培养液制成5108 L-1的单细胞悬液。将Transwell培养池置于中空多孔金属假体材料上，分别将含0，0.001，0.010，0.060，0.100 g/L骨形态发生蛋白2的DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)500 L放于下室，上室加入细胞悬液100 L(约5104细胞)，置于37 、含体积分数5% CO2的孵箱内。培养0，6，12，24，48 h后，PBS洗2次，用棉球小心擦去上室内细胞，运用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗2次，30 min 0.1%结晶紫染色，PBS洗2次，以去掉多余染料，最后通过显微镜下观察拍照。若在小室内有多余水分需要采用棉签吸掉，用1%十二烷基硫酸钠500 L 溶解细胞 30 min。完全溶解之后，取100 L细胞裂解液，再次放入96孔细胞培养板中，通过酶标仪测定570 nm吸光值，以了解细胞体外迁移能力。1.5 主要观察指标 各组中空多孔金属假体材料上骨髓间充质干细胞的形态变化、成骨分化能力、黏附能力及体外迁移能力。1.6 统计学分析 所有采集的数据应用SPSS 21.0统计软件进行分析。其中对符合正态分布资料的数据采用 s表示，遵循正态分布而且方差齐性，两两比较采用LSD检验，P 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 中空多孔金属假体材料内的细胞形态及Giemsa染色 镜下可见P3代骨髓间充质干细胞形态均一，呈梭形、旋涡状生长，生长旺盛(图2A)；经Giemsa染色后可见细胞胞浆丰富，呈梭形，细胞核染成紫红色，细胞质染成蓝紫色(图2B)。P3代骨髓间充质干细胞表面抗原CD34阴性表达，表面抗原CD44(CY3，红色荧光)、CD105(FITC，绿色荧光)阳性表达(图3)。2.2 骨髓间充质干细胞向成骨的分化 对照组细胞培养21 d后，细胞内可见脂滴，脂滴变大并合并呈串珠状(图4A)；而加入含不同质量浓度骨形态发生蛋白2培养基培养18 d后，细胞形成大量的成骨细胞，细胞形态由梭形改变为多角形，细胞呈多层性、重叠性排列，并形成大量钙化结节，茜素红染色呈鲜红色(图4B)。2.3 骨髓间充质干细胞的黏附能力 同一时间点(6-48 h)，与对照组比较，不同质量浓度的骨形态发生蛋白2均可增强骨髓间充质干细胞的体外黏附能力(P 0.05)，见表1。2.4 骨髓间充质干细胞的体外迁移 同一时间点(6- 48 h)，与对照组比较，不同质量浓度的骨形态发生蛋白2均可增强骨髓间充质干细胞的体外迁移能力(P 0.05)，不同质量浓度骨形态发生蛋白2呈浓度依赖性增强骨髓间充质干细胞的体外迁移能力(P 0.05)，见表2。3 讨论 Discussion将非骨水泥型生物固定人工关节应用于承重功能关节时，无论设计怎么变化，人工关节假体均为实心结构，这种实心结构即使在界面与周围骨质充分整合的情况下，其截面与结合部位也是非常有限的，因此需要提高假体与骨质的融合度，使两者的结合力更加稳定和持久18-23。实验提出采用中空多孔假体置入骨腔的方法，将骨质接触部分设计为中空体，复合骨诱导物质，使周围的骨质通过多孔材料的小孔长入假体组织的空腔之中，使两者之间达到更好的融合，目前对于中空材料的研究国内少见，其材料选择和工艺的制作处于进展研究阶段，也是目前骨组织工程生物力学研究的热点之一24-25。目前骨组织工程支架的选择将注意力放在生物可降解材料上，由于该材料具有良好的生物相容性，可很好地修复组织，免疫排斥较低，利于断端的愈合，但存在强度不足的问题，在承载超过负荷时，可降解支架材料并未表现出足够的支撑力26-30。纵观回顾整个人工关节材料的发展历程，金属材料在其中起到不可替代的作用，随着骨组织工程再生引导作用的不断深入，将金属刚性支撑材料应用于人工关节的研究显示出其独特的优势，具有更加稳定的结合力和促进骨组织再生的能力31-33。间充质干细胞具有定向分化的潜能，已有大量研究证实该类细胞可向假体支架空隙内生长，作为骨转化的种子细胞，已在骨缺损替代中取得了良好的治疗效果，接种在已塑形的聚乳酸-聚乙醇酸胶原海绵上表现出良好的成骨分化能力34-36。已有研究证实了骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。另外大量研究表明，在存在或不存在生长因子的情况之下，骨质均具有向金属内空隙生长的特性37。有 AB图1 中空多孔钛合金假体材料Figure 1 Hollow porous metal prosthesis图4 骨形态发生蛋白2对中空多孔金属假体材料内骨髓间充质干细胞成骨分化的影响(茜素红染色，200)Figure 4 Effect of bone morphogenetic protein 2 on osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells in the hollow porous metal prosthesis (alizarin red staining, 200)图注：图中A为未加入骨形态发生蛋白2干预，细胞内可见脂滴，脂滴变大并合并呈串珠状；B为加入骨形态发生蛋白2干预后，形成大量的成骨细胞，细胞形态由梭形改变为多角形，细胞呈多层性、重叠性排列，并形成大量钙化结节，茜素红染色呈鲜红色。B A图2 中空多孔金属假体材料内的骨髓间充质干细胞(100)Figure 2 Morphology of bone marrow mesenchymal stem cells in the hollow porous metal prosthesis (100)图注：图中A为P3代骨髓间充质干细胞，形态均一，呈梭形、旋涡状生长，生长旺盛；B为经Giemsa染色后，细胞胞浆丰富，呈梭形，细胞核染成紫红色，细胞质染成蓝紫色。图3 骨髓间充质干细胞表面抗原免疫荧光鉴定(400)Figure 3 Identification of surface antigens of bone marrow mesenchymal stem cells by immunofluorescence method (400)图注：图中A-C分别为CD105、CD44、CD34表面抗原表达，CD34阴性表达，表面抗原CD44 (CY3，红色荧光)、CD105(FITC，绿色荧光)阳性表达。CB A表1 骨形态发生蛋白2对中空多孔金属假体材料内骨髓间充质干细胞黏附能力的影响 (s，A)Table 1 Effect of bone morphogenetic protein 2 on adhesion of bone marrow mesenchymal stem cells in the hollow porous metal prosthesis 骨形态发生蛋白2质量浓度0 h6 h12 h24 h48 h0 g/L0.620.050.620.060.680.080.650.070.670.040.001 g/L0.520.561.000.29a1.330.33a1.590.97a1.950.75a0.010 g/L0.700.581.060.45a1.450.44a1.680.29a1.850.88a0.060 g/L0.650.791.020.36a1.350.42a1.590.29a1.920.79a0.100 g/L0.680.281.070.31a1.450.26a1.640.29a1.900.81a表注：与0 g/L比较，aP 0.05。表2 骨形态发生蛋白2对中空多孔金属假体材料内骨髓间充质干细胞体外迁移的影响 (%)Table 2 Effect of bone morphogenetic protein 2 on migration of bone marrow mesenchymal stem cells in the hollow porous metal prosthesis in vitro表注：与0 g/L比较，aP 0.05。骨形态发生蛋白2质量浓度0 h6 h12 h24 h48 h0 g/L5.455.666.636.385.750.001 g/L7.3736.62a45.45a55.63a65.13a0.010 g/L5.7145.14a58.65a68.17a74.24a0.060 g/L9.2363.38a70.57a83.06a89.86a0.100 g/L7.9281.21a86.75a92.64a97.12a研究在骨假体界面上实施转化生长因子1的诱导成骨分化作用，不仅使关节假体周围松质骨之间的间隙被填充，还达到了骨组织与假体表面很好的融合作用38，认为成骨诱导因子对界面骨质由骨内膜间质细胞向骨组织和纤维组织分化具有重要的作用。实验发现，随着时间的延长与骨形态发生蛋白2质量浓度的增加，骨髓间充质干细胞的体外黏附能力、外迁移能力明显加强。采用中空多孔钛合金材料复合骨形态发生蛋白蛋白，可促进多载体系统骨诱导和骨腔内生长效应，但对于如何寻找载体和诱导物，以提升材料与周围骨组织的亲和力，设计孔径的大小及间隔还有待于进一步的研究39-40。实验经过不同时间点的诱导培养之后，发现中空多孔假体支架复合成骨诱导因子后，其表面细胞呈现梭形生长，出现了明显钙化结节形成，体外实验证实了该中空多孔假体支架复合诱导材料有利于骨髓间充质干细胞的生长，通过中空多孔的间隙注入生长因子，填充了植入宿主骨的潜在间隙，给骨修复生长提供了充足的空间，另外增加成骨生长因素加快了成骨的形成。综上，在前人研究的基础上，将骨组织工程方法与多孔中空金属假体的理念相结合，为更加牢固的生物固定型人工关节和金属骨置入研究提供了更加丰富的实验依据。感谢：感谢青海大学医学院神经分子实验室老师们提供的技术支持。作者贡献：赵子春行实验设计，实验实施为李凌伟，实验评估为曹志强，资料收集为李春亮和齐圆圆，赵子春成文，李钊伟审校。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验方案经青海大学大学动物实验伦理委员会批准，批准号为5692541。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家审核，符合本刊发稿宗旨。作者声明：文章第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Spagnoli A.Mesenchymal stem cells and fracture healing.Orthopedics.2008;31(9):855-856.2 Knight MN,Hankenson KD.Mesenchymal 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