蛋白质药物的PEG化学修饰.ppt

蛋白质药物的PEG化学修饰胡涛 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室 1 迅速被体内酶降解2 肾小球过滤清除3 抗原 抗体反应4 溶解度差导致沉淀 蛋白质药物在使用中出现的问题 体外聚乙二醇修饰 PEG化 1 增大药物分子量 避免被肾小球过滤 2 阻碍蛋白酶的降解作用 3 屏蔽药物的免疫位点 4 增加药物在体液中的溶解度 5 与药物间的化学键在体内随时间水解 缓慢释放药物 蛋白或多肽 偶联物 聚乙二醇 CH3 O CH CH n OH 生物医药生物能源生物材料生物化学品其它产品 生化工程 生物化学工程 BiochemicalEngineering 目录 PEG修饰的国内外研究进展PEG修饰剂的研发PEG修饰方法PEG修饰工艺的优化PEG修饰产物的质量控制 一 PEG修饰的国内外研究进展 国际上PEG修饰技术的研究进展 美国Rutgers大学Davis教授70年代的工作甲氧基PEG的应用美国Enzon公司美国最早从事PEG修饰蛋白质药物的公司美国Shearwaters公司各种PEG修饰剂的生产商美国罗氏 先灵宝雅 安进PEG药物 PEG INF PEG G CSF其它 辉瑞 默克 葛兰素史克 施贵宝 国内PEG修饰技术的研究进展 国家863重大机密项目 人工血液代用品的研制 1997 2000中国科学院重点项目 血液代用品和血液净化 2001 2005国家重大科技专项课题 创新药物和中药现代化 长效基因工程蛋白质和多肽制剂关键技术 2002 2005国家863重点项目课题 核酸和多肽的修饰和剂型化技术 2007 2010PEG修饰血红蛋白 I期临床 中科院过程所 凯正公司 PEG修饰G CSF III期临床 格兰百克 修饰粒细胞集落刺激因子 rhG CSF 延长半衰期修饰人肿瘤坏死因子消除副作用修饰白介素I受体拮抗剂 rhIL 1Ra 延长半衰期修饰牛胰核糖核酸酶 RNase 提高抗肿瘤活性修饰超氧化物歧化酶 SOD 提高半衰期修饰天冬酰氨酶 Aspartase 克服免疫原性提高半衰期修饰人干扰素 IFN 提高半衰期修饰血红蛋白 Hb 血液代用品修饰胰岛素提高半衰期 我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作 二 PEG修饰剂的研发 Sc PEG专利分析 以PEG OH为原料的必然途径 CH3OCH2CH2 OCH2CH2 nOH 光气 NHS CH3OCH2CH2 OCH2CH2 nO C O N NH2 G CSF CH3OCH2CH2 OCH2CH2 nO C NH G CSF O 单链修饰 SC PEG Roche公司的长效干扰素产品专利分析 同样是以PEG OH为原料的必然途径 双链修饰 新的修饰策略 采用新方法制备新的修饰剂 以PEG COOH CM PEG 为原料的必然途径 已获专利 CH3 OCH2CH2 nOCH2CH2OH CH3 OCH2CH2 nO CH2C O N NH2 G CSF 单链修饰 CH3 OCH2CH2 nOCH2COOH CH3 OCH2CH2 nO CH2C NH G CSF O CM PEG 我们的策略 以PEG COOH为原料的必然途径 CH3 OCH2CH2 nO CH2C NH O O O 双链修饰 CH3 OCH2CH2 nOCH2COOH Lysine O CH3 OCH2CH2 nO CH2C NH O CH2 3 CH2 CH C O N NH2 IFN CH3 OCH2CH2 nO CH2C NH O O CH3 OCH2CH2 nO CH2C NH O CH2 3 CH2 CH C NH IFN 1 PEG修饰剂的批量制备取得了成功 取得的主要进展 聚乙二醇修饰剂产品 三 药用蛋白的PEG修饰方法 创新技术 反应器技术和产物移走技术 振荡反应器 流加反应器 缓释反应器 固相反应方式 膜耦合反应方式 双水相反应方式 Q Yun R Yang T Chen J Bi G Ma ZSu J Biotechnology 2005 118 67 74 中国发明专利 申请号200510114930 0中国发明专利 申请号0410029577 1 修饰反应器设计 PEG pellet反应器 2 固相吸附法制备PEG修饰蛋白 固相吸附法与液相吸附法的比较 1峰 原蛋白 2峰 单修饰蛋白 3峰 多修饰蛋白 PEG INF的制备过程 G CSF PEG G CSF 3 PEG醛制备单修饰的药用蛋白 粒细胞集落刺激因子 G CSF MW 18 8kd 174aminoacids pI 6 1 1thiol 1N terminal 4lysines Halflife 5h Weeklyinjection 7times 三批PEG30 rhG CSF产品的制备 取得的主要进展 PEG化重组人生长激素 批产量1 10g PEG化降纤酶 批产量6000支 环孢素A眼用微乳制剂 批产量5000支 PEG化G CSF 2L修饰反应器计算机程序控制批产量 3g生产周期10天 修饰和剂型化产品质量达到国际先进水平 生产规模产品质量批次稳定性 123 1 2 3 1 2 3 A B C 以分子量为30kDa的PEG修饰rhG CSF为例 A 三批产品的SDS PAGE检测图谱 B 三批产品的高效凝胶过滤检测图谱 C 三批产品的园二色检测图谱 4 引入巯基的方法制备PEG修饰蛋白 2 PEGylation S NH 1 Thiolation HS CH2 3 C NH Hb N O O PEG S CH2 3 C NH Hb O PEG N O 2 iminothiolane NH2 Hb Sangart公司是一家私营的生物制药公司 主要从事氧载体的研发和产业化 Hemospan MP4 PhaseI SwedenStatus CompletePhaseIb II SwedenStatus CompletePhaseII SwedenStatus CompletePhaseII USAStatus EnrollmentCompletePhaseIII EuropeStatus EnrollmentComplete 该PEG修饰产物的凝胶过滤分析 四 PEG修饰工艺的优化 PEG修饰反应参数的优化 建立反应动力学 包括位点反应动力学和蛋白分子反应动力学 优化反应时间优化反应的pH值优化PEG与蛋白的摩尔比优化反应体系 蛋白分子的修饰反应动力学 WeijunLi ZhiguoSu Quantitativelyinvestigatingmonomethoxypolyethyleneglycolmodificationofproteinbycapillaryelectrophoresis J Biochem Biophys Methods 2004 59 65 74 PEG修饰的位点反应动力学 PEG醛修饰药用蛋白的优化反应 单修饰产物的分离纯化 P1P2 分离产物分析 P1凝胶过滤分析 膜耦合修饰工艺制备PEG化药用蛋白 五 PEG修饰产物的质量控制 IEF和SDS PAGE鉴定PEG修饰蛋白 1 2 3 4 Iodinestain Comassiebluestain SDS PAGE IEF 1 Marker 2 HbA 3 Hb4 Propyl PEG5K 6 Hb5 Propyl PEG5K 6 Hb 1 HbA 2 Hb3 Propyl PEG5K 6 Hb4 Propyl PEG5K 6 Hb RP HPLC分析胰蛋白酶切片段 质谱分析胰蛋白酶切片段 MALDI TOF TOF分析PEG修饰位点在Val 1 PEG修饰蛋白的结构鉴定 圆二色光谱鉴定 荧光光谱鉴定 RP HPLC分析PEG修饰蛋白 蛋白质修饰剂及其制备方法和用途 中国发明专利 ZL01141745 5制备分枝型聚乙二醇的新方法 中国发明专利 ZL02120740 2带PEG长尾的蛋白质修饰剂的制法和用途 中国发明专利 ZL031100736 8聚乙二醇羧酸的制备方法和其用途 中国发明专利 ZL200310113367 6重组人复合干扰素 聚乙二醇偶联物的制备及其偶联产物 中国发明专利 ZL200410029577 1一种蛋白质交联剂及其交联方法 中国发明专利 ZL03105003 4一种分级分离制备血红蛋白偶联物的方法 中国发明专利 ZL99106228 0一种二醇聚合物 动物血红蛋白偶联物的制备方法 中国发明专利 ZL99106229 9一种二醇聚合物 动物血清白蛋白偶联物的制备方法 中国发明专利ZL00123696 2分子量均一的聚合物血红蛋白的制备方法 中国发明专利ZL01136190 5 血红蛋白 人血清白蛋白偶联物制备血液代用品及其制备方法 中国发明专利 ZL03109622 0 蛋白质修饰国家发明专利11项 已授权 PEG修饰的SCI论文 QYun TChen GZhang JBi GMa ZSu Anovelpolyethyleneglycolderivativesuitableforthepreparationofmono PEGylatedprotein BiotechLett 27 213 217 2005QYun RYang TChen JBi GMa ZSu ReproduciblepreparationandeffectiveseparationofPEGylatedrecombinanthumangranulocytecolony stimulatingfactorwithnovel PEG pellet PEGylationmodeandion exchangechromatography JBiotech 2005 118 67 74QYun MHe WXing JBi GMa ZSu Anoveltetrafunctionalreagentforsimultaneousintramolecularandintermolecularcross linkingofbovinehemoglobin BiotechLett26 1359 1363 2004 XLi FMeng GMa ZSu Asimpleandefficientmethodforsynthesisofcarboxymethylatedpolyethyleneglycol JChemRes Inpress JZhang YZhao ZSu GMa SynthesisofMonomethoxyPoly ethyleneglycol withoutDiolPoly ethyleneglycol JApplPolymSci 105 3780 3786 2007 JZhang ZSu GMa SynthesisandCharacterizationofHetetotelechelicpoly ethyleneglycol swithaminoacidatoneendandhydroxylgroupatanotherend JApplPolymSci inpress CZheng JBi GMa ZSu PolyethyleneGlycolImprovesConjugationofBovineHemoglobinandHumanSerumAlbumininaControlledRatio Arti