超速离心高效液相色谱测定血清高密度脂蛋白和低密度脂蛋白胆固醇：一种候选参考方法.pptVIP

超速离心 高效液相色谱测定血清高密度脂蛋白和低密度脂蛋白胆固醇 一种候选参考方法 董军国汉邦陈文祥 卫生部老年医学研究所 HDL C降低和LDL C升高 是明确的心血管病独立危险因素心血管病防治工作需要准确的HDL C和LDL C测定结果建立和保证HDL C和LDL C常规测定结果的准确性需要可靠的参考方法 HDL C和LDL C准确测定必要性 美国疾病控制与预防中心 CDC 定量法 D 1 006超速离心分离极低密度脂蛋白 VLDL 制备底部组分 BF 包括IDL LDL HDL和Lp a 等 用肝素 锰离子试剂沉淀BF中的 脂蛋白 制备HDL组分分别用AK胆固醇参考方法测定BF胆固醇 BFC 和HDLC 自BFC中减去HDLC得LDL C 包括IDL和Lp a 样品量大 5mL 其应用受到可得样品量限制LDL和HDL的分离采用化学沉淀法 影响因素较多样品制备需多部手工容量操作 费时 技术要求高受超速离心转头品种的限制 每次分析最多18个样品由于脂蛋白的不稳定性 样品制备过程 约需24 28小时 本身造成HDL C和LDL C的变化 定量法存在的问题 血清脂蛋白胆固醇的体外再分布 超速离心法 各类脂蛋白的定义方法 在分析化学上可能也是最可靠的脂蛋白分离方法 是一种物理分离方法 影响因素最少 电泳法 很难用于精密脂蛋白分析 沉淀法 沉淀剂和沉淀条件多种多样 影响因素多 较难实现一致的特异性 脂蛋白的分离方法 超速离心中的定量操作困难 繁琐 样品量大部分Lp a 在HDL密度范围内 造成HDL测定偏差 超速离心法 结合精密胆固醇分析 参考方法 血清脂蛋白的密度分布 LDL HDL VLDL Lp a Lp a 是二硫键连接的LDL apo a 复和体 还原剂可使Lp a 解离为LDL Lp a 和apo a Lp a 密度与LDL相近 或略小于LDL 若能建立条件 使Lp a 解离 又不改变HDL的密度性质 则可实现HDL的超速离心分离 Lp a LDL apo a 复合体 不同密度下ME对超速离心BFC的影响 ME对血清脂蛋白密度的影响 样品溶液中ME浓度对1 063密度下超速离心BFC的影响 取来自不同个体的血清49份在1 063背景密度及ME 0 05mol L 存在和不存在下超速离心 测定BFC BFC1 063ME 和BFC1 063ME 用免疫比浊法测定Lp a 质量用DCM测定HDLC HDLCDCM ME解离Lp a 有效性 BFC1 063ME 与BFC1 063ME 之差与Lp a 的关系 r 0 848 BFC1 063ME 与BFC1 063ME 之差与HDLC的关系 r 0 093 BFC1 063ME 与HDLCDCM之差与Lp a 的关系 r 0 414 P 0 005 Lp a 可与 脂蛋白发生非共价键结合此种结合不能被超速离心完全解离脯氨酸可以消除Lp a 与其他脂蛋白的非共价结合在d 1 150背景密度下试验脯氨酸的作用 在ME存在下 无脯氨酸时约10 的Lp a 免疫原性分布在顶部在ME存在下 含脯氨酸时顶部组分中无Lp a 免疫原性提示血清经ME作用后 部分游离apo a 仍与某些脂蛋白以非二硫键形式结合 这种结合可被脯氨酸解离 脯氨酸可以解离Lp a 与其他脂蛋白的非共价键结合 脯氨酸存在下BFC1 063ME 与HDLCDCM之差与Lp a 的关系 r 0 232 P 0 05 用ME使Lp a 解离为游离apo a 和Lp a Lp a 用脯氨酸解离Lp a 或apo a 与脂蛋白的可能非共价键结合1 063密度下超速离心 将HDL BF1 063 与其他脂蛋白分离1 006密度下超速离心 将HDL和LDL BF1 006 与VLDL分离用HPLC测定BFC1 006和BFC1 063HDLC BFC1 063LDLC BFC1 006 BFC1 063 含IDLC和Lp a C 方法原理 超速离心密度液配制 密度液I 含0 1M脯氨酸的溴化钠溶液 使密度为1 006密度液II 含0 1脯氨酸和0 05MME的溴化钠溶液 调节溴化钠浓度 使密度为1 0666 两种密度液 0 8ml 与血清 0 05ml 混合后分别给出背景密度1 006g ml和1 063g ml 标准溶液和内标溶液配制 胆固醇乙醇溶液 浓度0 646 1 293 2 586 5 172 7 758mmol L豆甾醇乙醇溶液 浓度5 17mmol L 作内标溶液 密度液及标准溶液配制 样品制备 用稀释器的稀释功能加入血清样品 体积为0 05ml 和稀释剂 密度液 体积为0 8ml 超速离心条件 20 23000rpm 离心18 5h离心管切割 用离心管切割器在离心管中液体的中间位置切割离心管 取下部离心管 内含1 006g ml背景密度下的BF BF1 006 和1 063g ml背景密度及ME存在下的BF BF1 063 进行胆固醇分析HDLC BFC1 063LDLC BFC1 006 BFC1 063 超速离心分离脂蛋白组分 高效液相色谱测定胆固醇I 将内含不同BF的下部离心管 置10 ml具盖试管中标准溶液0 05ml 用0 5ml乙醇冲入10 ml具盖试管中向各试管中加乙醇 8 9mol L氢氧化钾 9 1 4ml各管加内标0 05ml 用0 5ml乙醇冲入10 ml具盖试管中水平式振荡器振荡20min50 水解2h 高效液相色谱测定胆固醇II 400ulAcetone 20 l 4MH2SO4 4MCrO3 vortex RT5min 0 5mlHexane 0 5mlwater Vortex 5min 200ulsupernatantdrydownforchromatography 0 5ml水解液 0 5mlH2O 1mlHexane Vortex 20min 0 5ml Hexane 挥干 高效液相色谱分离胆固醇和6 氯豆甾醇 超速离心法HDLC BFC1 063ME 与HDLCDCM的关系 r 0 998 血清平均值 mmol L 平均批内CV 总CV HDLCLDLCHDLCLDLCHDLCLDLC 1 3422 8970 670 480 961 122 2022 7780 600 781 010 921 2924 1480 910 451 730 650 8802 8741 210 682 070 82 超速离心HPLC法测定血清HDLC和LDLC的精密度 用超速离