高中生物精品教学课件：52多聚酶链式反应扩增DNA片段2人教版选修.ppt

多聚酶链式反应扩增DNA片断 分子生物学研究中最强大的实验技术之一 其本质是在体外模拟胞内DNA分子复制的过程 美国科学家穆利斯 K B Mullis 发明了PCR技术 1993年诺贝尔奖 基础知识 DNA分子的结构 C H O N P 1 元素组成 脱氧核苷酸 2 基本单位 通常将DNA的羟基 OH 末端称为3 端 而磷酸基团的末端称为5 端 3 多脱氧核苷酸链得形成 4 DNA分子的双螺旋结构 DNA分子是由的 即一条链为3 5 另一条链为5 3 脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则结构 与交替连结 排列在外侧 构成基本骨架 排列在链的内侧 两条链上的碱基通过连结起来 形成碱基对 碱基对的组成有特定的规律 即腺嘌呤一定与配对 一定同胞嘧啶配对 双螺旋 两条反向平行 脱氧核糖 磷酸 碱基 氢键 胸腺嘧啶 鸟嘌呤 DNA的复制 2 时期 有丝分裂间期或减数第一次分裂前的间期 3 场所 细胞核 主要 线粒体 叶绿体 1 概念 由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程 4 基本条件 酶 解旋酶 DNA聚合酶能量 ATP原料 四种脱氧核苷酸模板 DNA的两条链 边解旋边复制 过程 5 复制特点 半保留复制 结果 6 遵循原则 碱基互补配对原则 7 精确复制的原因 8 复制的意义 DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代 从而保持了遗传信息的连续性 规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板 碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行 小结 胞内DNA复制的基本知识 PCR 多聚酶链式反应 2 TaqDNA聚合酶特性 高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题 促成了PCR技术的自动化不能从头合成DNA 只能从DNA母链的的3 端开始延伸DNA链 或者总是从子链的5 端向3 端延伸因此 DNA复制需要引物 1 定义 是一种体外迅速扩增DNA片段的技术 能以极少量的DNA为模板 在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝 3 PCR原理 在80 100 C的温度范围内 DNA的双螺旋结构将解体 双链分开 这个过程称为变性 当温度缓慢降低后 两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链 PCR利用了DNA的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解聚与结合 现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器 4 需要为PCR反应提供的物质 缓冲液 DNA模板 分别与两条模板链相结合的两种引物 四种脱氧核苷酸 耐热的DNA聚合酶 同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 它具有特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化等突出 5 PCR技术的特点 6 细胞内和细胞外DNA复制环境的区别 PCR过程需要的引物不是RNA 而是人工合成的DNA单链 其长度通常为20 30个脱氧核苷酸 7 细胞内复制和PCR不同点 PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶 而是通过对反应温度的控制来实现的 8 PCR的重要应用 广泛应用于遗传病的诊断 刑侦破案 古生物学 基因克隆和DNA序列测定等 1 PCR仪 设备及用具 实质上一台能够自动调控温度的仪器 实验操作 2 微量离心管 一种薄壁塑料管 总容积为0 5ml 3 微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体 其上的一次性吸液枪头用一次更换一次 1 准备 2 移液 实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂 混合后盖严微量离心管口的盖子 用手指轻轻弹击管壁 3 混合 过程 将微量离心管放在离心机上 离心约10s 4 离心 离心目的 使反应液体集中在离心管底部 提高反应效果 将离心管放入PCR仪上 设置好PCR仪的循环程序 5 反应 PCR一般经历三十多次循环 每次循环可以分为三个基本步骤 变性 复性和延伸 变性 模板DNA解旋 模板DNA经加热至900C以上 一定时间后 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 使成为单链 以便于它与引物结合 为下轮反应作准备 复性 退火 模板DNA经加热变性成单链后 温度降到500C左右 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 延伸 DNA模板 引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料 以母链为模板 按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理 合成一条新的DNA链 PCR循环第一步 高温变性 PCR技术高度灵敏 为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验 PCR操作时要注意做到 6 注意事项 隔离操作区 所用微量离心管 枪头 缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌 分装试剂 简化操作程序 使用一次性枪头 理论上DNA扩增数目的计算 课题成果评价 1 一条DNA 复制n次 DNA为2n 2 a条DNA 复制n次 DNA为a 2n 实验中DNA含量的测定 1 原理 可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果 DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰 峰值的大小与DNA的含量有关 对照调零 以蒸馏水作为空白对照 在波长260nm处 将紫外分光光度计的读数调节至零 取DNA稀释液100uL至比色杯中 测定260nm处的光吸收值 计算 DNA含量 g 50 260nm的读数 稀释倍数 50 1 g ml的DNA在厚度为1cm比色杯中的吸光值为0 02 2 过程 稀释 2uLPCR反应液 加入98uL蒸馏水 即将样品进行50倍稀释 光吸收 波长 nm 260 240 220 280 0 1 0 2 比色杯 课题延伸 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 它具有特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化等突出特点 PCR仪加热使 变性 复性使引物与模板DNA 延伸需将反应温度升至中温 在 的作用下 以 为原料 以 为复制的起点 合成新链 如此重复改变反应温度 经 三个阶段为一个循环