胰岛素生产流程图.ppt

胰岛素 E Coli 生产流程 人胰岛素 碳水化合物代谢和体细胞供能 一级结构 51个氨基酸双链 A 21 B 30 分子量 5734g mol等电点 5 4 胰岛素产生受损导致糖尿病 人胰岛素的制备方法 人胰腺提取 原料来源有限通过单个氨基酸化学合成 生产成本太高猪胰岛素转化或 半合成 成本高 来源少基因工程菌发酵 双链 Genentech 开发 EliLilly放大 胰岛素原 82个氨基酸 胰岛素的前体 分泌法 Yeast NovoNordisk产业化 细胞内法 E coli 表达121 82个氨基酸的Trp LE Met proinsulin包涵体 EliLilly产业化 E Coli胰岛素原法转化流程 市场分析和设计基础 2005 糖尿病人数 美国1800万 全世界1 5 2 0亿 年增长率3 4 胰岛素年销售额35 40亿美元 由NovoNordisc EliLilly和SanofiAventis三家垄断每个患者每年购买胰岛素的花费 250 750每个病人每年平均用量 0 5克纯胰岛素对1 5 2 0亿患者 年需求75 100吨纯胰岛素目前年产量20 30吨纯胰岛素设计年产量 1800kg纯胰岛素 满足350万人年工作330天 每48小时生产一批次 每年160批次每批次发酵液体积 37 5立方米 发酵罐空罐体积 50立方米 人重组胰岛素 E coli 生产流程 发酵工段初回收工段反应工段终纯化工段 通气量 0 5VVM 空罐体积 50立方米前接2级种子罐发酵周期 18小时发酵温度 37度终菌密度 30克 干重 升包涵体含量 干重的20 终保温 10度 发酵工段 初回收工段 物料温度保持10度 三个平行的碟片式离心机收获菌体 菌液从37000L浓缩到9165L菌泥 菌体收率98 加与菌泥等体积的缓冲液 96 4 w wWFI注射用水 0 7 EDTA 和2 9 TRIS base 稀释 有利于菌体碎片与包涵体分离 三次高压匀浆机破菌释放包涵体压降800bar 终物料体积 1400L 用前面的碟片式离心机回收包涵体收率98 加2倍体积的清洗剂 0 66 Triton X100 洗涤包涵体 反应工段 溶解包涵体 玻璃反应釜内加终浓度为300g L 5M 的尿素 溶解变性蛋白 和40g L的2 巯基乙醇 减少二硫键的结合 反应时间 8小时溶解收率 95 包涵体内Trp LE Met proinsulin含量 80 w w WFI透析6小时 收率98 去除尿素和2 巯基乙醇 过滤去除细小颗粒 保护后续层析柱 终体积5200L 再次离心 去除菌体碎片和可溶性蛋白共用前面回收工段的碟片离心机 反应工段 嵌合蛋白被CNBr溴化氰裂解为121个氨基酸的Trp LE Met和82个氨基酸的Proinsulin 70 甲酸溶液30倍过量加入CNBr 理论摩尔比1 1 收率95 反应时间 12小时反应温度 20度利用前面溶解反应釜 在CNBr沸点35度旋转真空蒸发1小时 会产生少量有毒氰化物气体 现场应准备次氯酸盐 亚硫酸分解的目的是打开胰岛素原和二硫键 给半胱氨酸加上SO3部分 pH9 11 50 w w 6M 盐酸胍 0 35 碳酸氢铵 3 硫酸钠 1 5 过硫酸钠 反应时间12小时 收率95 WFI透析至盐酸胍浓度为20 w w 共用前面包涵体溶解过程的透析器 反应工段 再折叠 三个平行阳离子交换层析床纯化proinsulin 床直径 140cm床高度 25cm填料 SPSepharoseFF GE洗脱液 29 w w尿素 1 5 NaCl 69 5