悉生动物在基础医学研究中的应用与发展-最终版.doc

悉生动物在基础医学研究中的应用与发展基金项目 科技重大专项艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治，项目号2009ZX10004-402作者简介 朵建英（1984-），女，硕士研究生，从事悉生动物研究工作。 通讯作者 秦川，教授，博士生导师，研究方向：病理与病理生理学 Email：朵建英，魏强，秦川中国医学科学院 北京协和医学院医学实验动物研究所 北京 100021【摘要】 悉生动物携带明确的微生物、排除了未知生命体对实验对象的影响，具有独特的生物学特性；利用悉生动物建立的动物模型在生命科学研究，特别是比较医学研究中的应用，日益受到人们的重视。但对悉生动物尚缺乏系统、全面的研究，使其应用受到一定的限制。本文重点对悉生动物在微生物学和疫苗研发中的应用和进展进行介绍，希望进一步推动悉生动物在相应科研领域中的应用。【关键词】悉生动物；动物模型；应用The Application and Development of Gnotobiotic Animals in Basic Medicine Research Duo jianying, Wei qiang, Qin chuanInstitute of laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China【Abstract】Gnotobiotic animals are a kind of germ-known laboratory animals, which show different biological and immunological characteristics compared with conventional animals. Although gnotobiotic animals have got more and more focused in the researches of microbiolog and vaccine development, we should do more study to make clearly about gnotobiotic animals. This review introduces briefly the current use and knowledge in the field of gnotobiotic animal models and collects useful information for scientific research.【Key words】Gnotobiotic Animals; Animal model; Application悉生动物（Gnotobiotic Animal, GN）是指动物体内外所携带的生命体，如病毒、细菌、真菌、原虫和寄生虫是已知的，并饲育于不同的屏障系统内的动物1。悉生动物通常包括无菌动物(Germfree Animal, GF)、已知菌动物(Gnotophoric Animal, GNP)和无特定病原体(Specific Pathogen-free Animal, SPF)动物2。GNP动物来源于GF动物，GF动物接种一种或一种以上微生物（包括细菌、病毒或已知寄生虫），即成为GNP动物。随着生命科学研究的发展，对实验动物的要求也越来越高。近代比较医学主要是应用人工培育的各种实验动物（包括近交系、免疫缺陷以及悉生动物）建立各种模拟人类疾病的动物模型来进行研究。这就需要实验动物本身具备适合实验特殊需求的特性，所以遗体内生命体明确可控的GN动物就应运而生了。GN动物最主要的特征就是体内外不携带未知微生物，生活在无菌屏障系统中，排除了环境因素和未知生命体对实验的影响，还可以方便的转化为携带特定微生物的动物。除此之外，GN动物还具有其独特的生物学特征。利用GN动物建立动物模型进行如微生物与宿主、微生物间的相互作用、免疫发生发展机制等方面的研究，不但满足了特殊研究的目的，还有实验结果明确一致、动物用量少、统计价值高、长期实验存活率高等优点，利于对生命活动基本规律的研究和分析，已广泛应用于生命科学各领域3。基因工程悉生动物的出现也标志着现代比较医学研究中悉生动物的应用开始发挥重要作用。1. GN动物模型用于致病菌、寄生虫及其疾病研究(1) 消化系统疾病研究消化道正常菌群能帮助宿主抵抗外来或潜在致病菌在消化道中的定植能力，即正常菌群的屏障作用。由于消化道正常菌群的屏障作用，以及众多菌群的干扰，使很多致病菌的发病机制、传播途径甚至引发症状等研究受到了限制，GN动物的出现很好的解决了这一难题。利用GN动物建立致病菌研究模型，特别是胃肠道疾病模型，如炎性肠道疾病（IBD）和胃炎、胃溃疡等可以使致病菌对宿主作用及作用结果的研究从复杂的多因素分解成为确定的单因素，促进了微生物与宿主间分子机制的研究，为阐明疾病病因寻找治疗方法，研制治疗药物或疫苗提供更好的途径。人类炎性肠病（IBD）中最具代表的就是Crohns病和溃疡性结肠炎。IL-2和IL-10敲除小鼠非常适合作为炎症性肠病动物模型的使用。敲除IL-2和IL-10的CV小鼠自发性产生类似人的溃疡性结肠炎，SPF条件下仅有局部结肠产生炎症，而GF条件下无自发性炎症，说明肠道定植菌在IL-2和IL-10敲除小鼠自发性结肠炎发生和免疫激活方面是不可缺少的5。进一步的研究表明肠道菌群的种类较菌群本身对疾病病因具有重要性，肠杆科菌属，特别是大肠杆菌在发病组中数量较对照组多6。研究CD4+记忆性T细胞对小鼠慢性结肠炎永久化的关系发现，抗原的持续存在是慢性感染中记忆性T细胞维持的必要条件7-9。艰难梭菌在正常菌群存在条件下很难在动物肠道内定植，一旦使用抗生素处理CV动物破坏其肠道菌群屏障后或使用GF小鼠进行接种，艰难梭菌很快就能定植，甚至产生毒素引发伪膜性结肠炎等疾病。利用引入仓鼠菌群的无菌C3H小鼠模型，证明由严格厌氧菌组成的菌群仍具有拮抗艰难梭菌的能力。由此证明了屏障菌群与艰难梭菌相互作用的可能机制以及滥用抗生素对引发伪膜性结肠炎的危险10。对于新兴出现的一些肠道致病菌的致病性研究，悉生动物模型是最合适的工具。口服感染肠出血性大肠杆菌（EHEC）可能导致严重肠炎, 多达10的病例有肠外并发症，即溶血性尿毒症（HUS）。Florian Gunze建立了悉生猪仔口服感染EHEC动物模型，此模型表现出和人类EHEC疾病非常类似的肠内、外病症，非常适合于人类EHEC诱导疾病病原学的研究，以及免疫和免疫反应试验等EHEC其他方面研究11。悉生仔猪幽门螺旋杆菌胃炎及胃溃疡模型是公认的用于人类急性细菌性胃炎研究的动物模型。模型有很多和人类疾病相似的方面，如感染持续期、专一性的胃内细菌定植、感染后淋巴浆细胞胃炎、以及感染后特定位点溃疡的发生 12-14。利用此模型成功研究了幽门螺旋杆菌引发胃炎的机制，证明细菌引发的免疫反应是从胃粘膜开始，并发展至全身粘膜的15。利用模拟人正常胃酸分泌和消除胃酸分泌细胞而增加与细菌粘附素结合细胞的转基因无菌小鼠，证明了胃酸的减少是幽门螺旋杆菌传播的危险因子。(2) 全身性疾病研究白色念珠菌是一种重要的机会致病菌，但对免疫功能低下的个体却会引发从粘膜感染到全身性感染的致命性疾病，如癌症患者和艾滋病人等。悉生仔猪白色念珠菌突变株C. albicans口服感染模型表现出很多和人类感染相似的症状，使致病菌体内致病机制和传播途径的研究得到了很好的发展，更适于白色念珠菌感染治疗方法临床前研究16。此外，GN动物模型还在寄生虫引起疾病的研究中发挥重要作用，特别是一些在体外很难培养的寄生虫，如肠胞虫属E. bieneusi。这种寄生虫引起的感染与AIDS患者慢性腹泻和消瘦有关，无法进行寄生虫的体内外培养大大限制了其感染研究的进展。利用悉生仔猪免疫力低下的特点，Kondova I 成功的将SIV感染恒河猴体内的E. bieneusi传播至仔猪体内，此模型的优点在于缩短了感染的潜伏期，增加了感染后寄生虫繁殖能力出现与人类AIDS病人相似的症状17为E. bieneusi的观察和宿主-病原体关系的研究以及疾病化学治疗方法的评价提供了可用的工具18。2. GN动物模型用于病毒感染及感染病研究GN动物排除了未知微生物对实验的干扰，解除了肠道微生物屏障作用，使得病毒对机体的入侵，特别是一些肠道病毒的感染变得较CV动物更为容易，所以利用GN动物建立病毒感染模型在临床和病理形态表现方面极为一致，不会出现由微生物群引起的附带变化，更加适合病毒的致病机理、传播途径等方面的研究。其中一直以来备受关注的就是轮状病毒（Rotavirus）的研究。(1) 轮状病毒发病机制的研究人们利用猴子、牛、狗、猪和兔19-23等动物进行过轮状病毒相关腹泻的生理病理学研究实验，但是它们大多费用昂贵且不易进行长期实验24。无菌乳大鼠模型在费用、腹泻强度和持续时间以及组织病理学变化方面与小鼠和兔子模型具有同等优势，它有别于其他小动物模型的最大优势在于此模型具有可见性临床表征，SA11感染无菌乳大鼠腹泻模型为A组轮状病毒的临床和病理学研究提供了良好的模式25。但是对于病毒引起的免疫反应方面的研究，由于成年小鼠对轮状病毒有抵抗性，所以小鼠模型只能用于病毒被动免疫方面的研究，对于主动免疫的研究，悉生猪是最合适不过的动物模型。猪与人类在生理学上很接近，新生仔猪由于胎盘屏障的作用不含有母源抗体，同时又具备免疫活性。无菌化后的仔猪保证了感染的是外源轮状病毒，同时排除了其他肠道病原体等不确定因素的影响，因此无菌猪用于轮状病毒感染可以观察到最初的免疫反应的发生、发展以及评价最初的抗体反应。同时悉生仔猪感染人轮状病毒后在观察发病机制和免疫反应方面较其他的动物模型有很多重要的优势：具有较长的病毒易感期以及和人类病毒感染相似的临床症状；在粘膜免疫的发展方面与人类似26,27。利用仔猪模型人们对病毒感染后的免疫反应进行观察，发现轮状病毒特异性IgA抗体在肠粘膜免疫中占优势，并且与血液中病毒特异性IgA抗体在一定时期内（感染后21天）呈现出一定的相关性28。(2) 轮状病毒病毒疫苗研究轮状病毒在小肠上皮细胞复制繁殖，引起绒毛空泡变性和腹泻29。因此，局部粘膜免疫在自然感染中抗病毒的作用非常关键，好的疫苗必须诱导粘膜免疫30,31。并且疫苗的预防效果可能很大程度上取决于其刺激肠内分泌IgA抗体产生的能力32。在人轮状病毒强毒株（Wa HRV）和减毒活毒株（Att HRV）诱导的主动和被动免疫的研究中证明可以将血清RV-IgA作为评价疫苗保护作用的指标33。这对新的轮状病毒疫苗的研发和评价有着重要意义。利用悉生猪感染人轮状病毒（HRV）腹泻模型对RV-DNA疫苗的各种免疫策略进行评价，包括1）先口服Att HRV，再肌肉注射两倍剂量的VP6DNA（Att HRV/VP6DNA2）；2）先肌肉注射两倍剂量的VP6DNA再口服Att HRV（VP6DNA2/Att HRV）；3）肌肉注射三倍剂量VP6DNA（VP6DNA3）。发现Att HRV/VP6DNA2免疫的猪血浆和肠粘膜病毒特异抗体水平最高，保护悉生猪免于腹泻的效果最好，这与prime/boost DNA疫苗联合重组病毒载体疫苗在抗HSV感染中的结果是一致的34，说明粘膜免疫的诱导需要活疫苗在粘膜某个位点的“prime”。这为RV-DNA疫苗prime-boost免疫策略42提供了可能性。进一步的研究发现口服Att HRV后，免疫刺激复合物（ISCOM）或者乳酸杆菌可以作为重组口服疫苗的佐剂，使加强免疫发挥更大的效果35,36。（3）免疫机制研究为深究其原因，需要运用GF动物模型对免疫发生、发展、消退等机理进行研究,，GF动物是研究免疫发生、发展、消退，免疫病患、过敏反应等机理的最理想动物模型1。无菌和普通小鼠的比较研究表明微生物促进着粘膜IgA的产生37。最近的研究表明这种作用的研究已经可以精确到单一的菌群，Siegfried Hapfelmeier 等用所构建的E.coli HA107三重突变株感染无菌小鼠建立了一种可逆的肠道微生物定植的无菌小鼠模型，该模型小鼠即使在使用1010CFU的E.coli HA107连续6次攻击后也可在72h内转变为无菌状态，克服了以往肠道内大量复杂菌群对研究单一菌群对粘膜免疫产生sIgA的影响的干扰，使得以确定量的活菌经口免疫动物，并观测此刺激对引起的单一、持续性的免疫反应的发生、作用效力直至消退的影响成为可能。研究表明肠道粘膜IgA变化谱随着肠道内细菌的成分改变，连续的抗原刺激不会引发系统性免疫中常见的“prime-boost”效应，但是却观察到特异性IgA对当前肠道微生物的诱导作用呈阶段性累加的反应，由此，抗体的所有成分就可以和存在菌群的成分相对应了38。这不仅解释了上述RV-DNA疫苗的免疫策略需要先以一个活疫苗的刺激来引发机体免疫反应，而且给基因亚单位疫苗的设计带来了新的思路。3. GN动物用于其他疾病治疗制剂的研究和制备 （1）GN动物用于微生态制剂作用机理研究利用GF动物的研究表明，哺乳动物肠道正常细菌对其出生早期肠道的正常发育和肠粘膜免疫系统的发育成熟有着重要的作用39。这些正常菌群与宿主之间经过长期的进化形成了有益或必要的关系，并成为宿主内环境中不可缺少的一部分，影响着宿主的免疫功能、营养吸收、代谢功能乃至生长发育。一旦这种内环境的稳态被打破，就会影响到宿主的健康。用微生态制剂来调整肠道菌群的微生态平衡，达到以菌制菌，防病治病的目的是一种行之有效的方法40。利用悉生动物模型人们发现益生菌对消化道疾病的预防作用可能与益生菌对各种生长因子的促进作用有关41。益生菌一旦摄入就成为肠道微生物群的一部分，主要通过修复肠道正常菌群参与机体脂类代谢50、甚至是药物代谢51,52，因此，微生态制剂通过调整肠道微生物正常化，在机体代谢性疾病治疗方面也发挥作用。（2）GN动物用于益生菌治疗作用研究益生菌（Probiotics）是应用和使用最广的一类微生态制剂，是一类摄入后对宿主的健康和生理状况产生积极作用的生理活性细菌制剂，通过胃肠或定植于结肠或在肠道繁殖，调整肠道菌群而提高机体免疫力。目前使用最广的就是乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB），包括双歧杆菌、乳酸杆菌等。益生菌在消化道相关疾病，如急性肠道感染尤其是病毒性肠炎、抗生素相关性腹泻42,43、坏死性小肠结肠炎（NEC）44、过敏性肠综合症（IBS）、结肠癌、泌尿生殖道感染和肿瘤、湿疹、食物过敏、乳糖耐受不良45,46等疾病的治疗和预防方面的作用已经得到部分证实：例如某些双歧杆菌株和罗伊乳杆菌可以阻止出血性大肠杆菌对无菌小鼠的感染47,48。益生菌作为病毒疫苗佐剂使用的研究在悉生动物中也得到证实，嗜酸性乳酸杆菌促进了口服轮状病毒疫苗在悉生仔猪中的免疫作用，可能作为一种新的安全的婴儿口服疫苗佐剂36。（3）GN动物在微生态制剂有效性和安全性评价中的作用微生态制品作为一种并能补充微生态内涵和调整微生态失调的活的微生物制剂，已经得到了越来越广泛的应用。目前我国活菌微生态制剂至少有十几种49，但是微生态制剂还缺乏统一的质量标准，产品的稳定性也有待提高，要对微生态制品的疗效、副作用和剂型等基本问题进行研究，最适合的实验动物就是GN动物。首先GN动物口服用于制备微生态制品的生理性细菌后可以观察到其是否在体内定植、定植数量、定植时间，以及对宿主正常菌群的影响等，从而可用于益生菌的筛选；其次益生菌在理论上存在着四类副作用45：系统感染；有害的代谢活性；对易感个体过分的刺激；基因转移。利用GN动物模型建立评价指标对微生态制剂进行安全性评价是非常重要的。最后，要使微生态制剂发挥最大的作用，有必要研究合适的施用技术、剂量和剂型，利用GN动物能更好的观察到微生态制剂在动物体内引起的变化，利于制剂的研发。综上所述，悉生动物从一出现就在微生物学研究方面发挥着重要的作用，利用它进行的微生物与宿主和微生物间相互关系的研究已经十分广泛。随着比较医学的发展，利用悉生动物进行的细菌、病毒和寄生虫等引起的人类疾病的致病机理及治疗方法方面的研究也越来越受到重视。特别是在病毒疫苗的研究方面，悉生动物由于其体内抗体分泌细胞水平低，在特异性抗原刺激后反应迅速，数量增加多并保持对抗原刺激的较高特异性，是疫苗研制和评价的良好工具，尤其是对于通过粘膜途径感染或传播的病原体，如各种肠道致病菌、肠道病毒、牛诺沃克类病毒、幽门螺旋杆菌等。在轮状病毒疫苗研究工作中，利用悉生动物模型证明可以将血清RV-IgA作为评价疫苗保护作用的最有效指标33，借鉴这一经验，人们或许可以在其他病毒疫苗的研制和评价中找到新的途径和方式。运用悉生动物模型，人们还发现了粘膜免疫和系统免疫的不同之处，为粘膜疫苗的设计及口服疫苗的给药方式提供了新的思路。随着微生态制剂概念的提出，近年有关肠道微生态平衡与疾病之间关系的研究，特别是通过重建和调整肠道微生态平衡来延缓和改善疾病进程方面的研究越来越受到人们的重视。由于微生态制剂需要在消化道发挥作用，合理应用悉生动物打开了解释单一或复合菌株在调节肠道功能中发挥作用的成功通道，并为微生态制剂的有效性、安全性评价提供了良好的工具。另一方面，虽然GN动物在生命科学各个领域的应用取得了很大成功，而且悉生动物作为一种稳定可靠的实验工具会得到越来越广的应用，但是国内对GN动物的研究开展的较晚，我们对它的认知，包括动物种类的研究开发、生理生化指标的确定1、动物不同代数的生物学特性等方面，尚缺乏系统、全面的研究，使其应用受到一定的限制。所以当前GN动物基础性研究的继续进行以及积极开展是为GN动物今后的应用打下结实基础必不可少的。参考文献：1 王荫槐，王钜编著，悉生动物学，辽宁大学出版社。2 王荫槐，高虹，悉生动物简介，实验动物科学与管理, 1999, 16(3), 32-37.3 中国医学科学院实验动物研究所，中国协和医科大学实验动物学部协编，悉生动物技术。5 Rance K. Sellon, Susan Tonkonogy, Michael Schultz, et al. Resident Enteric Bacteria Are Necessary for Development of Spontaneous Colitis and Immune System Activation in Interleukin-10-Deficient Mice . Infect Immun. 1998, 66(11): 52245231.6 Schuppler M, Ltzsch K, Waidmann M, Autenrieth IB. et al. An abundance of Escherichia coli is harbored by the mucosa-associated bacterial flora of interleukin-2-deficient mice. Infect Immun. 2004, 72(4):1983-1990.7 Scheller, L. F., and A. F. Azad. Maintenance of protective immunity against malaria by persistent hepatic parasites derived from irradiated sporozoites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92: 40664068.8 Belkaid, Y., C. A. Piccirillo, S. Mendez, E. M. Shevach, and D. L. Sacks. CD4CD25 regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature, 2002, 420: 502507.9 Guy-Grand, D., Griscelli, C., and Vassalli, P. The gut-associated-lymphoid system: Nature and properties of the large dividing cells. Eur. J. Immunol. 1974, 4, 435443.10苏文金，Bourlioux P,对引入仓鼠菌群的C3H无菌小鼠拮抗艰难梭菌定居实验模型的研究，中国微生态学杂志，1990,2,2:24-27.11 Florian Gunzer, Isabel Hennig-Pauka, Karl-Heinz Waldmann, et al. Gnotobiotic Piglets Develop Thrombotic Microangiopathy After Oral Infection With Enterohemorrhagic Escherichia coli，Am Jclin Pathol 2002;118:364-375.12 Eaton, k., Morgan, D., Krakowka, S., et al, Campylobacter pylorivirulence factors in gnotobiotic piglets. Infect Immun.1989,57,1119-1125.13 Bertram, T.A., Krakowka, S., Morgan, D.R., et al. Gastritis associated with infection by Helicobacter pylori: comparative pathology in hunmans and swine. Rev. Infect. Dis. 1991,13(8),S714-S722.14 Krakowka, S., Eaton,K.A., Helicobacter pylori infection in gnotobiotic piglets: a model of human gastric bacterial disease. In:Tumbleson, M., Schook,L (Eds), Advances in Swine in Biomedical Research, 1996,2, 779-810.15 Krakowka S, Eaton KA. Helicobacter pylori-specific immunoglobulin synthesis in gnotobiotic piglets: evidence for the induction of mucosal immunity in the stomach. Vet Immunol Immunopathol. 2002, 25;88(3-4):173-182.16 Andrutis KA, Riggle PJ, Kumamoto CA, Tzipori S. Intestinal lesions associated with disseminated candidiasis in an experimental animal model. J Clin Microbiol. 2000,38(6):2317-23.17 Tzipori, S., A. Carville, G. Widmer, et al. Transmission and establishment of a persistent infection of E. bieneusi derived from a human with AIDS in SIV-infected rhesus monkeys. J. Infect. Dis, 1997,175:10161020.18 Kondova I, Mansfield K, Buckholt MA, et al. Transmission and serial propagation of Enterocytozoon bieneusi from humans and Rhesus macaques in gnotobiotic piglets. Infect Immun. 1998 , 66(11):5515-5519.19 Petschow, B. W., R. E. Litov, L. J. Young, and T. P.McGraw. Response of colostrum-deprived cynomolgus monkeys to intragastric challenge exposure with simian rotavirus strain SA11. Am. J. Vet. Res. 1992. 53:674678.20 Mebus, C. A., and L. E. Newman. Scanning electron, light, and immunouorescent microscopy of intestine of gnotobiotic calf infected with reovirus-like agent. Am. J. Vet. Res. 1977. 38:553558.21 Johnson, C. A., T. G. Snider, W. G. Henk, et al. A scanning and transmission electron microscopic study of rotavirus-induced intestinal lesions in neonatal gnotobiotic dogs. Vet. Pathol. 1986,23:443453.22 Yuan, L., L. A. Ward, B. I. Rosen, et al. Systemic and intestinal antibody-secreting cell responses and correlates of protective immunity to human rotavirus in a gnotobiotic pig model of disease. J. Virol. 1996,70:30753083.23 Conner, M. E., M. K. Estes, and D. Y. Graham. Rabbit model of rotavirus infection. J. Virol. 1988,62:16251633.24 Burns, J. W., A. A. Krishnaney, P. T. Vo, et al. Analyses of homologous rotavirus infection in the mouse model. Virology 1995, 207:143153.25 C. Guerin-Danan, J. C. Meslin, F. Lambre, et al. Development of a Heterologous Model in Germfree Suckling Rats for Studies of Rotavirus Diarrhea Journal of Virology, November 1998, 72, 11: 9298-9302.26 Kim, Y. B. Developmental immunity in the piglet. Birth Defects. 1975,11:549557.27 Phillips, R. W., and M. E. Tumbleson. Swine in biomedical research. Plenum Press., 1986,(1);437440. 28 Wei-Kang Chen, Thomas Campbell, John VanCott et al. Enumeration of isotype-specific antibody-secreting cells derived from gnotobiotic piglets inoculated with porcine rotaviruses Veterinary Immunology and Immunopathology 1995, 45(3-4): 265-284.29 Kapikian, A. Z., and R. M. Chanock. 1990. Rotaviruses, p. 13531404. In B. N.Fields and D. M. Knipe (ed.), Virology, 2nd ed. Raven Press, New York.30 Conner, M. E., D. O. Matson, and M. K. Estes. Rotavirus vaccines and vaccination potential, Rotaviruses.1994,285338. 31 Saif, L. J., and D. J. Jackwood. Entericvirus vaccines: theoretical considerations, current status, and future approaches, In L. J. 1990,313329. 32 金奇.轮状病毒.医学分子病毒学.北京:科学出版社，2001:540-565.33 D Wood and WHO Informal Consultative Group. WHO informal consultation on quality, safety and efficacy specifications for live attenuated rotavirus vaccines Mexico City, Mexico, 8-9 February 2005. Vaccine, Dec 2005; 23(48-49): 5478-5487.34 Eo SK, Gierynska M, Kamar AA, et al. Prime-boost immunization with DNA vaccine: mucosal route of administration changes the rules. J Immunol 2001;166:5473-5479.35 Iosef C, Van Nguyen T, Jeong K et al. Systemic and intestinal antibody secreting cell responses and protection in gnotobiotic pigs immunized orally with attenuated Wa human rotavirus and Wa 2/6-rotavirus-like-particles associated with immunostimulating complexes. Vaccine. 2002, 20(13-14):1741-53.36 Wei Zhang, Marli S.P. Azevedo, Ke Wen, et al. Probiotic Lactobacillus acidophilus enhances the immunogenicity of an oral rotavirus vaccine in gnotobiotic pigs. Vaccine, 2008, 26(29-30):3655-3661.37 Shroff, K.E. et al. Commensal enteric bacteria engender a self-limiting humoral mucosal immune response while permanently colonizing the gut. Infect. Immun. 1995, 63, 39043913.38 Hapfelmeier S, Lawson MA, Slack E,et al . Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 2010, 328(5986):1705-1709.39 Lora V Hooper, Bacterial contributions to mammalian gut development. Trends in Microbiology, 2004, 12 (3): 129-134.40 夏朝霞.金双歧临床应用与研究.广东医学，2000，6（21）:2215.41 Fordjour L, DSouza A, Cai C,et al. Comparative effects of probiotics, prebiotics, and synbiotics on growth factors in the large bowel in a rat model of formula-induced bowel inflammation. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2010 ,51(4):507-13.42 Raza S, Graham SM, Allen SJ, et al. Lactobacillus GG promotes recovery from acute nonbloody diarrhea in Pakistan. Pediatr Infect