荧光纳米粒子探针的制备及其应用.doc

荧光纳米粒子探针的制备及其应用纳米技术和生物技术是21世纪的两大领先技术，在这两者之间存在着许多技术交叉。其中，纳米探针技术和传感技术就是纳米技术、生物技术与探针技术和传感技术相结合的产物，已经引起了人们的广泛关注。纳米材料是指在三维空间中至少有一维空间的尺度在1 nm-100 nm之间的物质。具有着独特的化学性质和物理性质，如表面效应、微尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应等，呈现出常规材料不具备的优越性能。将纳米材料引入生物探针和传感领域后，如何利用纳米材料构建纳米粒子探针和传感器、提高分析测定的灵敏度、稳定性和其它性能，建立不同分析对象的分析方法，使其在实际应用中真正得到更好和更广泛的应用，仍然是存在的一个问题。本研究建立了一种环境友好、制备方法简单、成本低廉的改良St?ber合成法和一种制备方法简单、成本低廉的沉淀聚合法，并利用其成功的制备了功能化的荧光纳米粒子和新型聚合物荧光纳米粒子，通过特定的生物修饰，作成荧光纳米粒子探针，实现了癌细胞的识别和检测；以反相乳液聚合法制备的荧光纳米粒子为标记物建立了高灵敏度测定临床疾病标志物IL-6、TNF-和毒素SEC1的免疫分析新方法；制备了电活性物质Ru(bpy)3Cl2掺杂的SiO2纳米粒子/Nafion、壳聚糖复合膜和电活性物质Ru(bpy)3Cl2掺杂的TiO2纳米粒子/Nafion复合膜修饰电极，据此构建了测定甲氧氯普胺、伊托必利和三丙胺的新型高灵敏度的电化学发光传感器。第一部分 荧光纳米粒子标记癌细胞成像第1章 荧光纳米粒子标记癌细胞成像研究进展就纳米粒子作为标记物在癌细胞成像中的研究进展进行了论文论述，内容主要包括量子点的性质及其在癌细胞成像中的研究；二氧化硅荧光纳米粒子的性质及其在癌细胞成像中的研究和多功能二氧化硅荧光纳米粒子在癌细胞成像中的研究。第2章 叶酸修饰的荧光纳米粒子探针在宫颈癌细胞成像中的研究利用改良St?ber合成方法制备了易于标记的二氧化硅荧光纳米粒子。该方法具有制备简单、成本低和环境友好等特点。并将叶酸对所制备的Ru(bpy)32+掺杂的二氧化硅荧光纳米粒子进行了修饰（叶酸修饰的Ru(bpy)32+掺杂的荧光二氧化硅纳米粒子，FCFNs），利用叶酸与宫颈癌细胞表面叶酸受体的特异性识别，结合荧光显微成像技术实现了宫颈癌细胞的识别和检测。实验结果表明，FCFNs具有光稳定性好，并能够有效、灵敏的识别宫颈癌细胞。这将使其在宫颈癌的临床诊断和疗效评价和叶酸受体的检测中得以应用。第3章 抗表皮生长因子抗体修饰的荧光纳米粒子探针在乳腺癌细胞成像中的研究在世界范围内，尽管肺癌是妇女死亡的最主要的疾病，但是在恶性肿瘤的临床诊断中，乳腺癌的诊断率仍然仅次于皮肤癌，位居第二位。本研究利用抗表皮生长因子（anti-epidermal growth factor，anti-EGF）抗体对由改良St?ber合成方法制备的荧光纳米粒子进行了修饰，并通过荧光显微成像技术方便的实现了对乳腺癌的检测和识别。该方法也可以适用于其它表达anti-EGFR的细胞系和组织的识别和检测。第4章 新型聚合物荧光纳米粒子探针的制备及其在卵巢癌细胞成像中的研究本研究以甲基丙烯酸为单体，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，丁基罗丹明B为荧光染料，利用沉淀聚合法非常容易的制备了一种新型聚合物荧光纳米粒子（PFNPs）。该PFNPs具有光稳定性好、泄漏率低和粒度均一的特点。随后将PFNPs与抗Her-2单克隆抗体进行交联，制备得到抗Her-2单克隆抗体修饰的PFNPs探针，并利用其对卵巢癌细胞进行了识别和荧光显微成像检测。第二部分 纳米粒子标记荧光免疫分析第1章 纳米粒子标记荧光免疫分析的研究进展就荧光免疫分析中常见的荧光纳米标记物：半导体量子点、二氧化硅荧光纳米粒子、高分子荧光纳米微球、稀土元素氧化物纳米粒子、上转换荧光纳米粒子和脂质体荧光纳米粒子在荧光免疫分析中的研究进行了评述。第2章 Ru(bpy)3Cl2掺杂SiO2纳米粒子标记荧光免疫分析法测定白介素-6生物分子修饰的纳米粒子在许多领域有着广泛的应用。本文利用Ru(bpy)3Cl2掺杂SiO2纳米粒子为标记物建立了一种高灵敏度测定白介素（IL-6）的荧光免疫新方法。基于IL-6抗原与抗IL-6单克隆抗体交联的Ru(bpy)3Cl2掺杂SiO2纳米粒子之间的特异性捕获作用和“三明治”免疫夹心法实现了IL-6的测定。在最佳实验条件下，荧光强度和IL-6浓度在20.01250.0 pg/mL范围内成线性，检出限为7 pg/mL。回归方程为IF = 7.66 + 32.50 IL-6（ng/mL）（R = 0.9980）。对78.0 pg/mL的IL-6进行11次测定的RSD为3.2%。此外，还利用荧光显微成像技术对纳米粒子标记荧光免疫法检测IL-6进行了研究。结果表明，本方法在IL-6检测中具有灵敏度高，操作简便和精密度高的特点，并成功的用于人血清中IL-6含量的测定。第3章 Ru(bpy)3Cl2掺杂SiO2纳米粒子标记荧光免疫分析法测定金葡萄球菌肠毒素本研究以功能化荧光纳米粒子为标记物，利用双抗体夹心免疫分析反应原理，建立了一种高灵敏度检测金黄色葡萄球菌肠毒素（SEC1）的荧光免疫分析新方法。首先，以Ru(bpy)3Cl2（Rubpy）为荧光染料，正硅酸乙脂（TEOS）和（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APS）为硅源进行共水解，利用反相微乳液聚合法制备了功能化荧光纳米粒子。再利用共水解在纳米粒子表面产生的氨基实现了功能化荧光纳米粒子与抗SEC1单克隆抗体的交联，然后利用双抗体夹心法对SEC1进行了测定。在最佳实验条件下，荧光强度与SEC1浓度在1.075.0 ng/mL范围内呈良好线性关系，检出限为0.3 ng/mL（3）。回归方程为IF = 24.58 + 0.64 SEC1（ng/mL） （R = 0.9991）。对25.0 ng/mL SEC1测定11次的RSD为2.5%。此外，还探索了应用荧光显微镜成像技术以功能化荧光纳米粒子为标记物，利用双抗体夹心法对SEC1的测定。实验结果表明，该检测SEC1的方法具有抗体易于标记，方法简单，测定灵敏高和精密度好的优点。并将其成功的应用于检测实际样品中的SEC1含量。第4章 Ru(bpy)3Cl2掺杂SiO2纳米粒子标记荧光免疫分析法测定肿瘤坏死因子结合免疫分析的特异性和荧光纳米粒子标记技术的高灵敏度优点，建立了一种测定肿瘤坏死因子（TNF-）的荧光免疫分析新方法。首先，利用反相乳液聚合法制备了Ru(bpy)3Cl2掺杂SiO2纳米粒子（RuDFSNs），然后将抗TNF-单克隆抗体标记在RuDFSNs上，并用荧光免疫分析法，将抗TNF-单克隆抗体标记的RuDFSNs用于人血清样品中TNF-的测定。在最佳实验条件下，荧光强度和TNF-浓度在1.0 250.0 pg/mL范围内成线性，检出限为0.1 pg/mL。对浓度为2.0、20.0、200.0 pg/mL的TNF-样品5次平行测定的日内和日间精密度分别为4.9%、4.4%、4.6%、6.1%、5.9%、5.3%。采用标准加入法对方法进行了评价，对人血清样品测定回收率为95.5105.0%。此外，还利用荧光显微成像技术对纳米粒子标记荧光免疫法检测TNF-进行了研究。结果表明，本方法在TNF-检测中具有灵敏度高，操作简便和精密度高的特点，并成功的用于人血清中TNF-含量的测定。第三部分 纳米粒子修饰电极电化学发光传感器第1章 纳米粒子修饰电极电化学发光传感器的研究进展重点就纳米粒子修饰电极电化学发光的研究进展进行了论述，主要包括碳纳米管、纳米金、纳米二氧化硅和纳米二氧化钛这几类纳米物质在修饰电极电化学发光中的研究及Ru(bpy)3Cl2掺杂SiO2纳米粒子在电化学发光中的研究进行了综述。第2章 Ru(bpy)32+搀杂的SiO2纳米粒子/Nafion复合膜修饰电极电化学发光传感器测定甲氧氯普胺本文利用Ru(bpy)32+搀杂的SiO2纳米粒子/Nafion复合膜对玻碳电极进行了修饰，基于盐酸甲氧氯普胺（MCP）对固定化的Ru(bpy)32+的电化学发光信号的增强作用，构建了一种高灵敏度测定MCP的电化学发光传感器。对该电化学发光传感器的特性和测定MCP的分析特性进行了详细的研究。在最佳实验条件下，MCP的浓度在2.010?81.010?5 mol/L（R = 0.9989）范围内与电化学发光强度有良好的线性关系，检出限为710?9 mol/L，对1.210?6 mol/L的MCP测定的RSD为3.2%（n = 11）。该电化学发光传感器已经成功地用于药物制剂和尿样中MCP的测定。加标回收实验结果表明该传感器测定MCP的回收率为97.0104.4%。并利用统计检验对电化学发光传感器测定结果与标准方法测定结果进行了分析，结果表明两者之间无明显的差异。第3章 Ru(bpy)32+搀杂的SiO2纳米粒子/壳聚糖复合膜修饰电极电化学发光传感器测定伊托必利利用Ru(bpy)32+搀杂的SiO2（RuDS）纳米粒子/壳聚糖复合膜修饰电极建立了一种测定伊托必利的电化学发光传感器。首先利用改良的St?ber合成法制备了RuDS纳米粒子，并利用透射电镜、电化学和荧光方法对Ru(bpy)32+搀杂的SiO2纳米粒子进行了表征。结果表明，Ru(bpy)32+掺杂在纳米粒子中仍然保持着其电化学活性，并且由于纳米粒子的保护作用降低了Ru(bpy)32+分子的泄漏。并对Ru(bpy)32+搀杂的SiO2纳米粒子/壳聚糖复合膜修饰电极电化学发光传感器测定伊托必利的分析特性进行了详细的研究。在最佳实验条件下，伊托必利的浓度在1.010?82.010?5 g/mL（R = 0.9978) 范围内与电化学发光强度有良好的线性关系，检出限为310?9 g/mL，对浓度为8.010?8 g/mL的伊托必利测定的RSD为2.3%（n = 11）。该电化学发光传感器已经成功地用于药物制剂和尿样中伊托必利的测定。结果表明，该电化学发光传感器具有高的灵敏度和好的稳定性。第4章 新型Ru(bpy)32+搀杂的TiO2纳米粒子/Nafion复合膜修饰电极电化学发光传感器的研究利用反相乳液聚合法制备了电活性成份Ru(bpy)32+掺杂的二氧化钛纳米粒子，然后将Ru(bpy)32+掺杂的二氧化钛纳米粒子/Nafion复合膜对玻碳电极进行了修饰，建立了Ru(bpy)32+掺杂的二氧化钛纳米粒子/Nafion复合膜修饰电极化学发光传感器。利用透射电镜、扫描电镜和电化学方法对纳米粒子和复合膜进行了表征。结果表明，Ru(bpy)32+掺杂的二氧化钛纳米粒子呈球形，