细胞与细胞工程

Cell CellEngineering SchoolofLifeSciences XiamenUniversity Dr GaoliangOuyang 欧阳高亮 Dr ShuyongLin 林舒勇 课程召集人 罗大mluo Fertilizedeggcanbedevelopedintoembryoandusedtoisolateembryonicstemcells 生命科学研究的范畴和层次 核心领域 生物学 动物学 植物学等 生物医学科学 疾病相关研究 小分子 生物大分子 细胞器 细胞 组织 器官 生物个体 群落 生态系统 Science Dec 2012 Science2012年度十大科学进展 心肌细胞肝细胞胰腺细胞 精子卵子 胚胎干细胞 饮食对肠道微生物组产生的作用 以及它们对患病风险的影响癌症免疫学研究黑色素瘤治疗方案 dabrafenib BRAF抑制剂 和trametinib MEK抑制剂 组合药物 干细胞试验的基础研究和临床研究单细胞测序技术人类连接组项目 HumanConnectomeProject 计划植物学基础研究 调控植物生长的分子遗传学机制 Science和Nature2013年度生命科学领域热点预测 Nature杂志则指出今年干细胞试验的基础研究和临床研究也许会取得新进展 其编辑认为一项利用人类胚胎干细胞 hESC 进行的早期临床试验应该在2013年会获得具有里程碑意义的研究结果 这个由著名的先进细胞技术公司进行的实验 正在将源自hESC的视网膜细胞注入36名患有两种形式的无法治愈的退行性失明的患者眼中 这是目前唯一一家获得美国食品与药物管理局 FDA 批准开展hESC治疗试验的公司 并且先进细胞技术公司希望FDA能够为其开绿灯 从而于今年在病人中对诱导自成熟细胞的干细胞进行测试 细胞工程 细胞工程是运用细胞分子生物学理论与技术 定向改造细胞乃至生物 用这种技术可以对细胞进行操作 达到定向改造生物的目的 是人们根据科学设计改变细胞的遗传基础 通过无菌操作 大量培养所需细胞 诱导形成组织甚至发育为完整个体的技术 迄今为止 人们已经从基因水平 细胞器水平以及细胞水平开展了多层次的大量工作 在细胞培养 细胞融合 细胞代谢物的生产和生物克隆等诸多领域取得一系列令人瞩目的成果 其中代表细胞水平的细胞工程研究也显示其巨大的应用前景 第一节细胞的特征细胞的基础知识细胞的生长 分化与死亡第二节动物细胞工程动物细胞培养单克隆抗体动物克隆干细胞工程 第一节细胞的特征 细胞是生命的结构和功能的基本单位 细胞是生命活动的基本单位 单细胞生物 一个细胞就是一个个体 而多细胞生物则由许多细胞成一个个体 我们所看到的生物体都是由多细胞所组成 在多细胞生物体中 由形态结构相似的细胞再组成组织 执行着生物体中的部分功能 第一节细胞的特征细胞的基础知识细胞的生长 分化与死亡第二节动物细胞工程动物细胞培养单克隆抗体动物克隆干细胞工程 根据细胞的内部结构 可将生物界的细胞分为两大类 原核细胞 prokaryotes 和真核细胞 eukaryotes 细菌 蓝藻和放线菌等由原核细胞构成的有机体称为原核生物 几乎所有的原核生物都由单个原核细胞构成 由真核细胞构成的有机体则称为真核生物 真核细胞大多存在于多细胞生物中 单细胞生物与多细胞生物在适应环境等方面各有千秋 一 细胞分类 一 细胞的基础知识 二 细胞的大小和形态 支原体 mycoplasma 巨型乌贼神经细胞 nervecell 蕨藻 caulerpa 细胞形态的多样性 硅藻 草履虫 无论各种细胞的大小和形态有多大的差异 它们都由一层具有一定生物学功能的细胞膜包裹在细胞外层 由于这层细胞膜将细胞内部和外部环境分隔开 使细胞内部的各种生命活动发生在特定的环境中保障了单细胞个体的生命活动和多细胞个体中不同功能细胞的相对独立性 使其成为生物体的功能单位 三 细胞的结构 结构简单 因而相对较小没有细胞核和大多数细胞器 恒定的内膜系统 细菌和古细菌两类三个结构区域 鞭毛或纤毛 胞外被膜和细胞质 I 原核细胞Prokaryoticcells 三大结构体系 生物膜系统 质膜 内膜系统 细胞器 遗传信息表达系统 染色质 体 核糖体 mRNA tRNA等细胞骨架系统 胞质骨架 核骨架 II 真核细胞 eukaryoticcells chromatid 具有核膜和由膜围成的各种细胞器 如内质网 高尔基体 线粒体 叶绿体 溶酶体等 内膜系统将细胞质分隔成不同的区域 即所谓的区隔化 compartmentalization 区隔化使细胞内表面积增加了数十倍 代谢能力增强 第一节细胞的特征细胞的基础知识细胞的生长 分化与死亡第二节动物细胞工程动物细胞培养单克隆抗体动物克隆干细胞工程 G0期 休眠期G1期 DNA合成前期S期 DNA合成期G2期 DNA合成后期M期 有丝分裂期 一 细胞增殖 二 细胞的功能 20h 细胞分裂三种方式 二 细胞分化 多细胞生物体是由各种各样形态和功能都不同的细胞群所组成 高等动 植物由受精卵细胞开始的胚胎发生过程随着细胞分裂次数的增加而使得早期胚胎的细胞数量也增加许多 其中有些细胞在形态 结构和功能上逐渐发生了差异 这种细胞之间差异的发生过程就是细胞分化 个体发育的过程就是细胞分化的过程 个体的各种器官和组织都是通过细胞分化形成的 囊胚 原肠胚 Examplesofnamesandtypesofcelldeath A I Electronmicroscopy J L phasecontrast A NormalHeLacells B treatedwithstaurosporintoinduceapoptosis or C treatedwiththapsigargintoinduceautophagy Galluzzietal 2007 D Apoptotic and E necroptoticJurkatcells Degterevetal 2005 F Paraptotic293Tcells Sperandioetal 2000 copyright 2000 NationalAcademyofSciences USA G Necroticand H autophagiciBMKcells Degenhardtetal 2006 Mathewetal 2007 I Ras expressingU251glioblastomacellsshowingmacropinosomes J H Overmeyer A Kaul E E Johnson W A Maltese unpublisheddata J Dictyosteliumcells vegetative K undergoingvacuolarautophagiccelldeath and L undergoingnecroticcelldeath Laporteetal 2007 凋亡 自吞噬 凋亡 坏死 自吞噬 坏死 凋亡 apoptosis 程序性死亡 坏死 necrosis 自吞噬 autophagy 衰老 senescence 三 细胞衰老和死亡 Hayflick sLimit humancellsderivedfromembryonictissuescanonlydivideafinitenumberoftimes 50 inculture Fibroblast Division20times 50times 细胞衰老 LimitlessReplicativePotential Humansomaticcellshaveafinitereplicativepotential oncecellsprogressedthroughacertainnumberofdoublings cellswillstopgrowing aprocesstermedsenescence Lossofproliferativecapacitywithage Apoptosisandnormalmorphogenesis Mousepaw 细胞死亡控制失效的后果 该死的不死 肿瘤不该死的死了 退行性疾病 AD Parkinson sDisease TumorsasComplexTissuesThetumormicroenvironmentisregulatednotonlybycancercellsbutalsobyendothelialcells immunecellsandstromalelements HanahanD WeinbergRA Cell 2000 四 肿瘤 Cellcyclecheckpoint Tumorinvasion metastasiscascade 肿瘤侵袭转移 CancersResultFromgeneticMutation Alterationinthecell sDNAsequenceEpigeneticchange achangeinthepatternofgeneexpressionwithoutachangeintheDNAsequence ChemicalcarcinogensIonizingradiationsViruses Agentsthatgiverisetocancer Many butnotall cancer causingagentsdamageDNA FungaltoxinaflatoxinB1 Themorepotentonesarerelativelyinertchemicallyandbecomedamagingonlyaftertheyhavebeenchangedtoamorereactiveformbymetabolicprocesses Metabolicactivationofacarcinogen ZhouBB etal NatRevDrugDiscov 2009 Cancerstemcells CSCs alsoknownastumorinitiatingcellsortumorigeniccells refertoasmallsubsetoftumorcellsthathavestem likecellproperties theabilitytoself renew differentiateintoheterogeneouspopulationsofcancercells andseednewtumorsinaxenotransplantsystem Cancerstemcell 肿瘤干细胞 第一节细胞的特征细胞的基础知识细胞的生长 分化与死亡第二节动物细胞工程动物细胞培养单克隆抗体动物克隆干细胞工程 体外培养细胞的基本类型 形态 成纤维样细胞和上皮样细胞根据细胞能否在支持物上生长 分为贴附型和悬浮型 成纤维样细胞 上皮样细胞 悬浮型细胞 第二节动物细胞工程 一 动物细胞培养 细胞培养的基本设备 无菌室 无菌操作台 二氧化碳培养箱 倒置显微镜 细胞计数仪 透射电子显微镜 激光扫描共聚焦显微镜 培养瓶 培养皿 培养板 培养液 第一节细胞的特征细胞的基础知识细胞的生长 分化与死亡第二节动物细胞工程动物细胞培养单克隆抗体动物克隆干细胞工程 二 单克隆抗体 1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合 成功建立了单克隆抗体技术 而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖 每个B淋巴细胞仅专一地产生 分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体 而肿瘤细胞可以无限增殖 因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体 单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体 单克隆抗体的应用 分子细胞生物学基础研究疾病的定向治疗 肿瘤免疫疗法 风湿性关节炎等 疾病的早期诊断 超过150亿美元的市场 第一节细胞的特征细胞的基础知识细胞的生长 分化与死亡第二节动物细胞工程动物细胞培养单克隆抗体动物克隆干细胞工程 三 动物克隆 生物学上 克隆指的是低等生物无性繁殖产生遗传信息完全一致的群体的自然存在的过程 生物技术领域 克隆指的是复制 拷贝 DNA片段 分子克隆 细胞 细胞克隆 应用于干细胞 乃至生物体 生殖克隆 的手段 生殖克隆一般指创造遗传特性上完全一致的多细胞个体的过程 是一种无性繁殖 人为创造 体细胞核移植 利用显微外科技术 将一个体细胞核移植到一个去核的卵细胞中 再植入母体子宫 便可不经授精而发育 胚胎分裂 胚胎孪生 自然存在 个别雌性昆虫 甲壳类和蜥蜴 成熟个体的复制 克隆研究的历史及现状 Hansspemann 1869 1941 1928年进行了首次核移植实验1935年获诺贝尔生理医学奖1938年预言了克隆高级生物的可能性 德国胚胎生物学家 thefatherofcloning HansSpemann的蝾螈核移植实验 1938年Spemann和他的学生发现 把发育早期的蝾螈细胞核移植到去除了细胞核的发育晚期蝾螈胚胎中 胚胎细胞可以继续发育成为一个完整的蝾螈 1952年Briggs和King用囊胚细胞核克隆了蝌蚪 RobertBriggs 1911 1983 ThomasKing 1921 2000 Thefirstclonedvertebrate 囊胚细胞 分化早期的胚胎细胞 1962年JohnGurdon用肠细胞 分化终末细胞 核克隆青蛙 JohnGurdon 1933 紫外线照射 未受精卵 移核卵 提取肠上皮细胞核 注入细胞核 囊胚 囊胚 不分裂 畸形胚 成蛙 细胞可以 重编程 克隆技术的基础 1979年KarlIllmensee宣布运用核移植法成功克隆了3只小鼠 但该结果没有得到科学界公认 1986年丹麦科学家SteenWilladsen成功利用胚胎细胞克隆出一头绵羊 这是首次证实的通过核移植技术克隆哺乳动物 哺乳动物的克隆 1995年7月苏格兰Roslin研究所的IanWilmut和KeithCampbell运用早期分化的胚胎细胞克隆出了两头绵羊 命名为Megan和Morag 这被看作是多莉诞生的前奏 1996年7月5日第一个用成年体乳腺细胞克隆产生的哺乳动物 绵羊多莉 Dolly 诞生 RoyalMuseuminEdinburgh Wilmut A E Schnieke J McWhir A J KindandK H Campbell Viableoffspringderivedfromfetalandadultmammaliancells Nature 1997 385 810 813 克隆羊多莉引发的动物克隆热 牛 05 07 1998 日本 猴 14 01 2001 美国 猫 14 02 2002 美国 骡 29 05 2003 美国 小鼠 05 12 1999 美国 骆驼 8 04 2009 阿联酋 1 遗传素质完全一致的克隆动物将更有利于开展对动物 人 生长 发育 衰老和健康等机理的研究 2 有利于大量培养品质优良的家畜 3 经转基因的克隆哺乳动物 将能为人类提供源源不断的廉价的药品 保健品以及较易被人体接受的移植器官 4 科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异种克隆 即借腹怀胎的新领域 这无疑将大大促进对濒临灭种的哺乳动物的保护工作 克隆技术将对21世纪产生的重大影响 第一节细胞的特征细胞的基础知识细胞的生长 分化与死亡第二节动物细胞工程动物细胞培养单克隆抗体动物克隆干细胞工程 Stemcellsarepowerfultoolsinbiologyandmedicine Whatcanscientistsdowiththesecellstoexploittheirincrediblepotential AdaptedfromPrinciplesofBiologypublishedbyNatureEducation JAMESKING HOLMES SCIENCEPHOTOLIBRARYAmouseembryoisheldinplaceduringnucleartransfer Theegg sgeneticmaterialhasbeenremovedandanadultcellnucleusisinjectedinitsplace 四 干细胞工程 Pluripotent cantransformintoanyoneofthe220celltypesinthehumanbody Self renewal onestemcellcanalsodividetoproducemillionsmorestemcells 1 WhatareStemCells innearlyallanimals fromtinywormstomiceandhumans embryonicstemcellsadultstemcellsinducedpluripotentstem iPS cells 2 TypesofStemCells EmbyonicStemCellsVS AdultStemCells StemCells FlexiblefriendsNature483 S22 S26 Inthepastdecade scientistshavealsolearnedtomakestemcellsfromregularmature differentiatedcells Thesecellsarecalledinducedpluripotentstemcellsbecausescientistsforcethemtobecomepluripotentevenaftertheyhavereachedadifferentiatedstate Byturninguptheexpressionofjustafewgenes scientistscanforceaskincell forexample toretraceitsdevelopmentalpathwaybackwardsallthewaytoaflexiblepluripotentstate InducedPluripotentStemCells 3 MedicalApplications Stemcellscanteachusaboutthebiologyofpluripotentcells howthehumanbodydevelops andwhathappensduringdisease Theyarealsoatoolfordevelopingsaferwaystodesignandtestnewmedications theyarethebasisforregenerativemedicine usingstemcellstorepairdamagedtissue ThediscoveriesofGurdonandYamanakahaveshownthatspecialisedcellscanturnbackthedevelopmentalclockundercertaincircumstances Althoughtheirgenomeundergoesmodificationsduringdevelopment thesemodificationsarenotirreversible Wehaveobtainedanewviewofthedevelopmentofcellsandorganisms ResearchduringrecentyearshasshownthatiPScellscangiverisetoallthedifferentcelltypesofthebody Thesediscoverieshavealsoprovidednewtoolsforscientistsaroundtheworldandledtoremarkableprogressinmanyareasofmedicine iPScellscanalsobepreparedfromhumancells Forinstance skincellscanbeobtainedfrompatientswithvariousdiseases reprogrammed andexaminedinthelaboratorytodeterminehowtheydifferfromcellsofhealthyindividuals Suchcellsconstituteinvaluabletoolsforunderstandingdiseasemechanismsandsoprovidenewopportunitiestodevelopmedicaltherapies Fromsurprisingdiscoverytomedicaluse 皮肤细胞 iPS 神经细胞 心肌细胞 肝细胞 精子 卵子 Whyisatherapeuticcloningapproachimportant Bygrowingnewbodypartsfromexistingonesfromthesamepersonwecanavoidtransplantrejectionproblems Byusingcellsre engineeredor cloned fromourselveswecanbecomeourowntransplantsource similartobankingbloodforourselvesbeforeasurgicaloperation PeopleintheUSaffectedbydiseasesthatmaybehelpedbystemcellresearch ConditionNumberofPersonsAffectedCardiovasculardiseases58MillionAutoimmunediseases30MillionDiabetes16MillionOsteoporosis10MillionCancer8 2MillionAlzheimer sdisease4MillionParkinson sdisease1 5MillionBurns severe 0 3MillionSpinalcordinjuries0 25MillionBirthdefects150 000 peryear Total128 4Million DatafromthePatients CoalitionforUrgentResearch Washington DC accordingtoPerry Ref 267 NATURE NEWSChina sstem cellrulesgounheededHealthministry sattemptatregulationhashadlittleeffect Nature484 149 150 12April2012 It sboomtimeforfirmssellingstem celltreatments suchasthosederivedfromumbilicalblood LIUHAIFENG XINHUAPRESS CORBIS NATURE NEWSStem celltherapytakesoffinTexasAboominunprovenproceduresisworryingscientists Nature483 13 14 01March2012 Celltexhoststhelargeststem cellbankintheUnitedStates TYLERRUDICK 4 DevelopmentoftheStemCelltechnique Source WherearetheStemCells 自然胚胎克隆人胚胎 核移植 混种胚胎 核移植体细胞诱导多能干细胞 体细胞转分化 In1868 GermanbiologistErnstHaeckelfirstusedtheterm stemcell todescribeazygote Researchershavebeenworkingwithmouseembryonicstemcellssince1981 thefieldtookoffin1998 whenresearchersisolatedhumanembryonicstemcellsforthefirsttime 最早的人类多能干细胞是从体外受精的临床病例中得来的多余胚泡 这个里程碑式的事件是JamesThomson领导的UniversityofWisconsin Madison的实验室在1998年的成果 3 1IsolationandcultureofStemCells 3 2ObjectionstoStemCellReasearch 2008纽卡斯尔大学将从人类皮肤细胞中提取的DNA注入来自母牛卵巢的卵子 卵子的所有遗传物质基本上都被去除 3 3InterspeciesEmbryos 2003上海第二医科大学盛慧珍教授研究组将人的体细胞核植入去核的兔卵细胞中 3 4AdultStemCells donotraisetheethicalquestionsthatembryonicstemcellsdobecausenoembryosareneededexistinverysmallnumbersoftenburieddeepinthetissuemainlyusedfortwotreatments bone marrowtransplantstorebuildapatient simmunesystem andskingraftstoreplaceskinoveraburnorotherinjuryotherapplicationsforadultstemcells usedrugstoactivateapatient sownadultstemcellstoperformthenecessaryrepairs Foralongtime scientiststhoughtthatonceacelldifferentiated itcouldneverregainitspluripotency Theyassumedthatitmustbesetinitsidentitybecauseithadsomanygenesturnedonandoffinwaysparticulartothatcelltype In2006 however KazutoshiTakahashiandShinyaYamanakaofKyotoUniversityinJapanprovedotherwise Theyturnedmouseskincells specifically fibroblasts intostemcells Thesewerethefirstinducedpluripotentstem iPS cells 3 5InducedPluripotentStemCells Thefirstdirectreprogrammingofadulthumanfibroblasts IanWilmutScottishCentreforRegenerativeMedicine UniversityofEdinburghIn2007issuesofCellandScience Yamanakaandcolleagues Takahashietal 2007 andYuandcolleagues Yuetal 2007 demonstratethatexpressionoffourspecifictranscriptionfactorsgivesadulthumanfibroblastsmanyofthecharacteristicsofhumanembryonicstemcells Refinementsofthisprocedurewillmakeitpossibletoproducepluripotenthumancelllineswithoutuseofanembryo Thereareprofoundscientificandsocialimpli