扫描电镜样品制备.doc

以大肠杆菌为例：1.固定及脱水生物样品的精细结构易遭破坏，因此在进行制样处理和进行电镜观察前必需进行固定，以使其能最大限度地保持其生活时的形态。而采用水溶性、低表面张力的有机溶液如乙醇等对样品进行梯度脱水，也是为了在对样品进行干燥处理时尽量减少由表面张力引起的其自然形态的变化。将处理好的、干净的盖玻片，切割成46 mm2的小块，将待检的较浓的大肠杆菌悬浮液滴加其上，或将菌苔直接涂上，也可用盖玻片小块粘贴菌落表面，自然干燥后置光学显微镜镜检，以菌体较密，但又不堆在一起为宜；标记盖玻片小块有样品的一面；将上述样品置于1%2%戊二醛磷酸缓冲液（pH7.2左右）中，于4冰箱中固定过夜。次日以0.15%的同一缓冲液冲洗，用40%、70%、90%和100%的乙醇分别依次脱水，每次15 min。脱水后，用醋酸戊脂置换乙醇。另一种与之类似的样品制备方法是采用离心洗涤的手段将菌体依次固定及脱水，最后涂布到玻片上。其优点是：在固定及脱水过程中可完全避免菌体与空气接触，从而可最大程度地减少因自然干燥而引起的菌体变形；可保证最后制成的样品中有足够的菌体浓度，因为涂在玻片上的菌体在固定及干燥过程中有时会从玻片上脱落；确保玻片上有样品的一面不会弄错。2.干燥将上述制备的样品置于临界点干燥器中，浸泡于液态二氧化碳中，加热到临界点温度（31.40，72.8个大气压）以上，使之气化进行干燥。样品经脱水后，有机溶剂排挤了水分，侵占了原来水的位置。水是脱掉了，但样品还是浸润在溶剂中，还必需在表面张力尽可能小的情况下将这些溶剂“请”出去，使样品真正得到干燥。目前采用最多、效果最好的方法是临界点干燥法。其原理是在一装有溶液的密闭容器中，随着温度的升高，蒸发速率加快，气相密度增加，液相密度下降。当温度增加到某一定值时，气、液二相密度相等，界面消失，表面张力也就不存在了。此时的温度及压力即称为临界点。将生物样品用临界点较低的物质置换出内部的脱水剂进行干燥，可以完全消除表面张力对样品结构的破坏。目前用得最多的置换剂是二氧化碳。由于二氧化碳与乙醇的互溶性不好，因此样品经乙醇分级脱水后还需用与这两种物质都能互溶的“媒介液”醋酸戊脂置换乙醇。3.喷镀及观察将样品放在真空镀膜机内，把金喷镀到样品表面后，取出样品在扫描电镜中进行观察。悬浮状细菌样品需要先离心清洗，沉降在有膜的盖玻片上，戊二醛、锇酸固定，梯度乙醇脱水，干燥处理再喷金观察。如果是培养的爬片，直接清洗固定脱水干燥处理，喷金后就可以观察了。处理过程中需要注意的是：样品一定要清洗干净，避免培养液覆盖在细菌表面影响观察效果，可以用生理盐水或者PBS清洗；可以选用Formar膜（制备相对复杂，但沉降效果较好），也可以用镀金膜的盖玻片（制备方便，沉降效果一般）；沉降时间要适度，太短的话沉降的细菌较少，贴附也不紧密，时间太长的话细菌形态会受影响；再有就是在戊二醛固定过程中可以把盖玻片轻轻左右晃动几次，使之分布均匀，以避免沉降的细菌团聚在一起；在脱水干燥过程中应尽量避免脱水剂对盖玻片的直接冲击，可从周围贴壁加入脱水剂。用0.1 mol/L pH7.0的无菌磷酸盐缓冲液将冻干菌粉复水，5000 r/min离心10 min，弃去上清液。样品在2.5%的戊二醛溶液中4固定过夜后涂片，依次用20%、40%、60%、80%和95%的乙醇溶液梯度脱水处理