基因芯片的原理、制备及应用.doc

基因芯片的原理、制备及应用摘要：侠义上的生物芯片是将生物分子（寡聚核苷酸、cDNA、基因组DNA、多肽、抗原、抗体等）固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相介质上形成的生物分子点阵，可分为基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室三类，其中目前应用最广泛的生物芯片是基因芯片。基因芯片是基因突变分析、基因测序、基因表达研究中的高效手段之一。其制备有两种方法：原位合成法与交联制备法。基本原理是利用DNA分子可以变性、杂交的特性，通过基因芯片上固定的探针或样品DNA与游离的样品DNA或探针杂交来推断未知靶分子，杂交发生与否可采用荧光标记技术检测。高效、快速的基因芯片以其无与伦比的优势，已在医学、药学、分子生物学、环境科学及食品安全等领域显现巨大的应用价值，具有非常广阔的发展前景。关键词：生物芯片；基因芯片；原位合成法；交联制备法生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，它主要通过微电子等技术在固体芯片表面建立微型生化分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速与大量信息的检测。根据探针分子的不同、研究对象的差异和制作工艺的发展，可大致将生物芯片分为基因芯片（又称DNA芯片、DNA微阵列）、蛋白质芯片（又称蛋白质微阵列）、芯片实验室（lab-on-chip，又称微流控芯片）三大类（当然也有较新的组织芯片、细胞芯片、糖芯片等，但由于应用不如上述三大类广泛，此处不予列出），其中应用最广泛的是基因芯片。进入21世纪以来，随着人类基因组计划的完成，基因序列数据迅速增长。如何研究如此众多的基因在生命过程中担负的功能成为一个重要课题，基因芯片正是在这样的背景下应运而生。基因芯片是基因突变分析、基因测序、基因表达研究的高效手段之一，是生物芯片技术中最基础、发展最成熟以及最先进入应用和实现商品化的领域【1】。基因芯片是基于核苷酸互补杂交原理研制的，它是指将大量的探针分子固定于固相支持物上然后与标记的样品分子进行杂交反应，通过对杂交信号的监测分析获取样品分子的数量和序列信息。一、基因芯片的种类根据芯片的功能可将基因芯片分为基因表达谱芯片和DNA测序芯片；根据基因芯片所用的基因探针类型的不同，可以分为cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列两大类【2】；根据应用领域的不同可将基因芯片分为各种专用型芯片，如病毒检测芯片、表达谱芯片、指纹图谱芯片、诊断芯片、测序芯片、毒理学芯片等。二、基因芯片的原理生物芯片兴起于上世纪80年代末期，它将生命化学的工程转化为一种可控制的静态形式，进而对这种形式的表现结果用计算机进行检测与分析。基因芯片技术利用DNA分子可以变性、杂交的特性，通过DNA芯片上固定的探针或样品DNA与游离的样品DNA或探针杂交来推断未知靶分子，杂交发生与否可采用荧光标记技术检测。三、基因芯片的制作方法基因芯片的制备利用了微阵列技术可以将成千上万的信息密码集中于一块小玻片、硅片等固相载体上组成密集分子阵列的特点，即在控制条件下将大量DNA分子有规则地排列到载体上。其具体方法根据不同的基因芯片种类而不同，大致可以分为两类型：原位合成法与交联制备法。一是原位合成法，采用光导化学合成和照相平板印刷技术在载体（如玻片、硅胶片、各种有机高分子薄膜等）表面合成寡核苷酸探针。它按照预先设计的序列顺序有规律地在固相支持物上直接合成成千上万种不同的DNA片段。具体来看，原位合成法就是先将一小段核苷酸链的3端固定在预先处理的基片上，应用核酸合成的方法经过脱保护活化、偶联、戴帽和氧化等步骤逐个连接上新核苷酸单体【2-3】。原位合成法是目前制备高密寡核苷酸芯片最好的方法，主要有光控合成和标准试剂合成两种途径。其中光控合成技术利用光敏保护基保护核苷酸的5羟基，光照射使脱离保护，DNA的合成只发生在脱去保护基的地方，即为合成的区域。过程中由一系列光刻掩膜控制，具体根据预先设计的探针序列，采用“盖瓦”【4】策略进行固相合成。二是交联制备法【1】又称点样法，是利用手工或自动点样装置将预先合成或制备的寡核苷酸探针、cDNA或基因组DNA点样在一定序列顺序的经特殊处理的载体上，通过共价交联或非共价吸附（如多阳离子聚赖氨酸包被方法进行静电固定或紫外线照射产生共价交联等）固定核酸分子。具体来说，是用微量点样技术制作cDNA点阵芯片（CDA），以目的基因为模版，用PCR扩增。该法主要用于中、低密度芯片的制备，即用于达片段的DNA，也适用于小分子的寡核苷酸，主要包括接触法和喷墨法【2】。交联制备法制备方式直接，不需像原位合成那样复杂的技术且点样的样品可事先纯化，但制备过程中样品的用量大，浪费较多。四、基因芯片技术的应用基因芯片技术具有高通量、并行性及自动化等优点，现已经成为科学研究的热点之一。其作为生物技术的一个重要研究领域，具有潜在的经济和社会效益。目前基因芯片技术已经广泛应用于基因表达谱分析、疾病诊断、药物筛选、肿瘤标志物、多种病毒检测、环境监控、食品安全等多个领域，虽然在检测方面仍有待发展和完善兵器受到了许多相关技术的制约，但是仍然具有非常广阔的前景。1基因芯片在医学、生物学领域的应用在病毒感染快速诊断领域，DNA探针是检测特异、互补序列的有力工具。例如饮用HRP-HBV DNA探针在临床检验中诊断HBV感染者【5】。对63份HBsAgHBeAg和Anti-HBcELISA阳性血清及24份HBsAgAnti-HBc阳性、HbeAg阴性血清用HRP-HBV DNA探针进行检测，结果探针阳性率分别为100%（63）和58%（24）。在一系列的实验检测中显示出核酸探针技术的高灵敏性和在临检应用中的广阔前景。在P53基因突变检测领域。目前在对200多种不同的人类肿瘤研究中发现，近50%的肿瘤都存在P53基因突变，因此研究该基因突变与肿瘤的关系，可为诊断肿瘤开辟新的途径。采用基因芯片技术检测P53基因突变，具有快速且高通量的特点。目前Affymetrix公司已有可同时检测6500个已知人类基因的基因芯片，已有用于检测乳腺癌、卵巢癌等多种癌症的基因芯片。采用P53基因芯片，经实践检测，准确率高达98%以上【6】。在DNA指纹分析领域【5】，Schaap等人利用HRP（辣根过氧化物酶）和AP（碱性磷酸酶）标记两种DNA探针，先用HRP发光底物检测第一个杂交信号，再加入第二种底物，在检测第二个信号的同时消除第一个信号，结果利用一张杂交膜显示了两张DNA指纹图，分辨率明显提高。2基因芯片在食品卫生学领域的应用目前，全球食品安全形式十分严峻，主要表现在食源性疾病的持续上升，恶性食品污染事件连续不断，食品加工新技术和新工艺也带来不确定性危害。因此，将基因芯片这项高新技术应用于食品安全检测，以其自动化、微量化、高灵敏等优势，不仅可以确保食品安全，而且可以有效避免食品贸易纠纷，具有广阔空间。在食品中病原微生物的检测中，传统方法数天才可得到结果。利用基因芯片高通量筛选的特点，选取各种致病菌特异性的毒力因子作为检验的靶标，通过多重PCR的方法扩增多种致病菌【7】，同时标记PCR产物，然后经基因芯片杂交进行鉴定，可同时检测多种食源性致病菌。在对转基因食品的检测中，由于转基因作物生产、加工的转基因食品的安全性越来越受关注，其检测和鉴定越来越重要。国际上关于转基因产品的检测还没有统一的方法和标准，目前常用的检测方法有PCR检测法、化学组织检测法等。但这些方法只能对单个检测目标进行检测，且效率低、周期长、假阳性高，不适合对食品中大量不同的转基因成分的进行快速检测。而基因芯片通过设计不同探针阵列、使用特定分析方法可是该技术具有很高的应用价值，可检测出食品中是否含有转基因、何种转基因。因此，基因芯片也是食品安全检测中最具潜力的技术手段之一，是转基因食品检测的方向【8】。3基因芯片在环境科学领域的应用基因芯片以其特有的优势，目前已应用于检测土壤中微生物及鉴定微生物群落、检测水中的微生物、环境流行病学分析、环境医学等的研究领域。关于研究微生物与宿主的关系，Belcher【9】等用cRNA芯片研究了被感染的呼吸道上皮细胞及百日咳杆菌基因表达的变化，开辟了研究环境微生物与宿主关系的新道路。关于检测水中的微生物，德国一家水管理公司与芯片公司共同开发的基因芯片，可以提供的信息量十分巨大，可以比常规方法检测更多种的微生物并检测微生物的遗传信息，精确可靠，4小时内可得出结果，费用也远低于常规方法。该技术主要利用70mer长的寡核苷酸作为探针来检测河水、海湾等环境中的氮循环基因的多样性【10】，这些基因包括amoA，nifH，nirK和nirS等，是一种比现有水质控制更有效、快速和实惠的检测技术。在环境毒理学领域中基因芯片的应用更为广泛。已问世的专门用于环境毒理学检测的毒理学芯片可以快速大规模检测污染源及环境毒物、研究环境毒物对人体的影响以及进行低剂量的毒物实验等。其可靠性高、使用简单，因此具有很好的应用前景。五、基因芯片的应用前景 基因芯片作为生物芯片的重要类型，是一项即极有应用前景和开发价值的新兴技术，其产业化和规模化都指日可待。基因芯片发展的最终目标是将从样品制备、化学反应到检测的整个分析过程集成化以获得微缩基因芯片实验室。尽管目前基因芯片的发展仍旧处在萌芽期，但是国内外的研究领域已经对其投入了足够的重视。随着大量基因序列的确定，基因芯片技术为生物内部生命信息的处理和应用提供了可靠的手段，对推动农业、环境、人口健康等核心问题将发挥重大的作用。且随着纳米材料的研究，DNA芯片在纳米电子学中已有应用。在不久的将来，随着对其研究的不断深入和技术的不断完善，基因芯片一定会被更广泛地应用于各项领域，并对整个科学技术及社会的进步起到极大的推进作用，带领我们走向以全新思维方式进行科学研究的时代。参考文献：【1】 池晓菲, 舒庆尧. 生物芯片技术的原理与应用J. 遗传, 2001, 23(4): 370-374.【2】 范金坪. 生物芯片技术及其应用研究J. 中国医学物理学杂志, 2009, 26(3): 1115-1116.【3】 刘晓智, 陈騉, 王睿. 生物芯片技术研究进展及其应用前景J. 中国药学杂志, 2005, 40(22): 1684.【4】 Bertrand L, Asaph A, Mark S, Overview of DNA chip technology J. Molecular Breeding, 1998, 4: 277-289.【5】 沈彬, 张天浩, 张春平, 李宁, 王新宇. 生物芯片及其在医学和生物学中的应用J. 光电子激光, 2001, (127): 768.【6】 Ahrendt S A, et al. Proc, Natl. Acad. Sci. USAC. 1995,