2001年诺贝尔生理学奖.doc

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2001-key regulators of the cell cycle题目：控制细胞周期的关键物质2001 年10 月8 日, 瑞典皇家科学院宣布本届诺贝尔生理学医学奖授予发现“细胞周期中关键调节剂(key regu lato rs) ”的美国L eland H. Hartw ell以及英国R. T imo thy Hun t 和Pau lM. N u rse 3 位科学家, 他们共获奖金100 万美元。人体内亿万个细胞不断进行分裂, 以取代老化和死亡的细胞。探索正常健康细胞的分裂周期, 是近年来生物医学领域的一项最有意义的突破, 因为它有助于科学家了解增殖失控的细胞(如癌细胞) 出现了哪些异常。正是在这一重要领域, 3 位学者业绩斐然。他们的工作阐明了高等生物体内调节细胞周期。一 研究背景l 细胞周期包括一下几个阶段：G1SG2Ml 在G1期，细胞逐渐长大；尺寸到达一定程度的时候进入S期，l S期DNA开始合成，细胞复制遗传物质；l 在G2期，细胞检查DNA复制是否完成，为细胞分裂作准备；l 在M期，染色体分离，细胞分裂为两个子细胞，子细胞获得与父代完全相同的遗传信息。l 分裂完成后，子细胞进入G1期，开始下一轮细胞周期。 “细胞周期”( cell cycle)又称“细胞分裂周期”,是指细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的全过程。1882 年, Kiel大学的解剖学教授Flem2ming即在光学显微镜下观察到形态明显变化的动物细胞有丝分裂现象。此后,许多科学家做了大量的相关研究。但由于早期科学发展的局限性,当时的科学家们仅仅认为有丝分裂期是细胞增殖的主要活动期,因此将细胞活动分为分裂期和静止期(间期) 。他们更关注于有丝分裂时染色体的变化情况, 而对于细胞周期的分子调控机制研究甚少。直到20世纪50年代初, 才有可能研究细胞周期以及细胞分裂的分子调控机理。这些基本的调控机制在进化上十分保守，几乎在所有的真核生物中都是一致的。科学家用32 P标记的磷酸盐浸泡蚕豆苗,并在不同时间取根尖进行放射自显影的研究,发现遗传物质DNA的复制只发生于细胞间期的一段时间,这段时间与有丝分裂期前后各存在一个时间间隙。从而科学家明确提出了细胞周期的概念,并将它依次分为G1期、S期、G2期和M期。其中,从有丝分裂完成到DNA复制前的间歇时间称为G1 期,是细胞生长和DNA合成准备时期。当细胞进入G1 期后,细胞开始合成生长所需的RNA、蛋白质、糖类、脂质等,同时其体积在此期逐渐增大。DNA复制的时期为S期, DNA的含量在此期增加一倍。而从DNA复制完成到有丝分裂开始的这段间歇称为G2 期,此时细胞合成大量蛋白质,为有丝分裂做准备。M期则为细胞分裂期,细胞在此期分裂为两个子细胞,完成增殖。因此,在一个细胞周期中,细胞要经历细胞生长、DNA复制、分裂形成两个细胞并将染色体平均分配到两个子细胞的全过程。这个过程不仅仅是物质积累的过程,还是细胞装备、修饰、形成具有功能状态的结构的过程。后续的实验又进一步证明了在动植物细胞中细胞周期存在的普遍性,从而为细胞增殖的研究开创了新的方向。因此,细胞周期的揭示成为20 世纪50年代细胞生物学研究的重大发现之一。另外,科学家的研究还发现不同生物的细胞周期时间存在着差异,即使同一个体中的不同细胞,其细胞周期的长短也不相同。一般地, G1 期的时间变化较大,而S + G2 +M的时间变化则相对恒定。进入细胞周期的细胞是处于分裂状态的细胞,而另外一些细胞则处于不分裂的状态,这类细胞被称为休眠细胞,它们所处的时期为G0 期。在正常情况下, G0 期细胞不合成DNA或进行细胞分裂,但在适当的刺激下可重新进入细胞周期,恢复增殖。细胞周期的揭示使人们进一步认识到:细胞周期是一个高度精确、有序的过程。细胞周期的调节,能保证细胞周期中各期按照正常顺序进行,并纠正细胞分裂过程中出现的任何错误。它的紊乱,将导致细胞增殖、分化异常,发生癌变,甚至死亡。这样就给科学家们带来了新的疑问:细胞周期的具体调节机制是什么? 对于这一问题,科学家们采用植物、微生物、软体动物、昆虫、两栖类动物和哺乳类等各种模型进行研究,以期揭示细胞周期的分子调控机制。细胞增殖调控问题仍是当前分子生物学研究的热点之一，众多学者在细胞生物学、遗传学和分子生物学不同领域中对细胞增殖的调控机制进行了深入的研究，主要包括两个方面的内容：一方面研究细胞是怎样启动和完成有关细胞增殖的生物学事件；另一方面研究细胞如何保证这些事件精确地按次序进行。近年来，科技界投入较大精力进行调控细胞周期进程的分子机制研究，已经取得突破性进展。在癌细胞中经常发现染色体的异变。在生物学和医学领域，了解细胞周期的调控机制是极其重要的。本年度的诺贝尔奖获得者在这方面做了很好的研究，他们在分子水平上研究了细胞周期中一个阶段是如何被调控进入下一个阶段的。二作者背景简介照片从左到右依次为：利兰德.哈德威尔（美国）、帝木斯 汉特（英国）、泊尔.诺斯（英国）.Dr. Leland Hartwell 1939年生于美国洛杉矶，1961年在加州理工学院获得学士学位，1964年在麻省理工学院获得博士学位，现任职于西雅图Fred Hutchinson癌症研究中心。 他因为发现了调控细胞周期的一族特异性基因而获得诺贝尔奖。其中一个名为“start”的基因在细胞周期的第一步中发挥中心作用。Hartwell还引入了“checkpoint”的概念，这对于细胞周期的理解是十分有帮助的。Dr. Paul Nurse 1949年生于英国，1970年在伯明翰大学获得理学学士学位，1973年在East Anglia大学获得博士学位，现就职于伦敦帝国癌症研究基金会。 他克隆并用遗传学方法和分子生物学方法研究了细胞周期中的一个关键调控因子CDK（cyclin依赖性激酶）。他证明了CDK的功能在进化上是极其保守的。CDK通过磷酸化其它蛋白质而推进细胞周期。Dr.Timothy Hunt 生于1943年，1965年在剑桥大学获得博士学位，现任职于伦敦帝国癌症研究基金会。 他因为发现cyclin而获奖。Cyclin是调控CDK功能的蛋白质。他发现cyclin在每一次细胞分裂中都会周期性地降解，这种机制对于细胞周期的调控十分重要。二 研究工作及成果1、酵母细胞周期基因的发现自20世纪60年代末起, Leland H. Hartwell就开始运用遗传学方法,借助单细胞生物芽殖酵母( Saccharomyces cerevisiae)便于分离、易于观察等优势,以其为模型进行了一系列的研究。在1970至1971年间,他通过大量的实验,分离出上百株细胞分裂周期( cell division cycle, cdc)突变株。这些突变株的共同特点是:当温度改变时,它们将出现各种细胞分裂异常, 并停滞于细胞周期的不同阶段。Hartwell通过这种方法在这些突变株中先后分离出上百个调控细胞周期的基因,它们的突变导致了细胞周期的异常。因此,这些基因被命名为细胞分裂周期基因( cell division cycle genes, cdc genes) 。在这些cdc基因中，最重要的是被命名为“启动”基因( start gene)的cdc 28基因,而其在G1 期中发挥作用的时间点被称为“启动点”(在高等真核生物中称为R点或限制点) 。当酵母细胞在早G1 期储存了足够的营养物质及能量,并满足了细胞体积生长到特定大小等一系列条件时, cdc 28基因将启动以促进细胞不可逆地通过“启动点”进入晚G1 期,并定向地进行DNA复制和有丝分裂。Hartwell发现,在“启动点”之前的早G1 期细胞可能因为营养物质不足等原因离开细胞周期进入G0 期,但在相同的情况下,“启动点”之后的晚G1 期细胞则有不少可以进入S期进行DNA复制。后来的学者根据这样的现象,以“启动点”为界,将G1 期分为早G1 期的生长因子依赖性阶段和晚G1 期的生长因子非依赖性阶段。当“启动”基因突变时,大部分酵母细胞将被阻断于G1 /S处,无法进行DNA的合成及后续的细胞分裂。后来的研究表明, cdc 28基因还可促进细胞从G2 期进入M期。2、高等生物中细胞分裂周期基因的发现PaulM. Nurse也是通过遗传学方法对细胞周期的调控进行研究的。但与Hartwell采用芽殖酵母为实验材料不同的是,Nurse 以裂殖酵母( Schizosac2charomyces pombe)为实验模型进行研究。在20世纪70年代中期,他在裂殖酵母的细胞中发现并分离出一个与细胞周期调控有关的基因cdc2,该基因编码一种分子量为34kD 的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其作用于细胞周期中的“启动点”和G2 /M控制点。当细胞具备了足够的生长因子信号时,该蛋白激酶中保守的苏氨酸和酪氨酸残基将被磷酸化,蛋白激酶被激活,促使细胞由早G1 期不可逆地通过R点进入晚G1 期,并定向进入S期进行DNA复制;或由G2 期进入M期,开始进行有丝分裂;而丧失cdc2功能的突变株在细胞分裂周期中则不能通过“启动点”和G2 /M控制点。Nurse还发现了4个基因可以影响cdc2基因的功能。其中,wee1基因的产物具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性,可以通过对cdc2的磷酸化而抑制其活性,而cdc25和nim1基因能通过去磷酸化使cdc2 恢复其活性。第4个基因suc1则可以与cdc2 结合,抑制激酶活性,阻止细胞进入或退出M期。后来的研究发现,芽殖酵母的cdc28基因与裂殖酵母的cdc2基因具有较高的同源性,它们在结构和功能上类似,并编码相似的蛋白质。这表明在这两种酵母中,细胞周期的调节机制是保守的。1987年, Nurse 通过基因工程的方法,从人的cDNA文库中分离出了人的cdc2基因,该基因编码的产物也是一个约34kD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其结构中有63%的氨基酸残基与酵母cdc2编码的蛋白激酶一致。同时,该蛋白激酶可以使丧失cdc2基因的酵母细胞突变株在细胞分裂周期通过“启动点”和G2 /M控制点。人的cdc2基因与裂殖酵母的cdc2基因在结构和功能上的相似性,说明了真核细胞的细胞周期调节机制在进化过程中是保守的。后来,这类基因编码的蛋白质被统称为“周期蛋白依赖性蛋白激酶”( cyciln2dependent kinase,Cdk) ,它们通过对其它蛋白质的磷酸化推动细胞周期的进行。通常,在单细胞真核生物中只有一种Cdk,在芽殖酵母中是cdc28,在裂殖酵母中是cdc2。然而,在多细胞真核生物中,参与细胞周期的Cdk则有多种。在人体细胞中主要有Cdk1 ( cdc2 ) 、Cdk2、Cdk3、Cdk4、Cdk5、Cdk6、Cdk7 (CAK)和Cdk8等。3、首个细胞周期蛋白的发现在20世纪80年代初, R Timothy Hunt与其同事利用35 S放射性标记的甲硫氨酸研究海洋无脊椎动物卵裂时细胞内蛋白质的变化情况。他们发现在海胆受精卵卵裂的过程中,一类在未受精的卵中几乎没有出现过的蛋白质开始合成。而且这类蛋白质的含量在细胞周期中呈现周期性变化:在细胞周期自G0 期进入G1 期时开始合成, G2 /M时达到高峰,M期结束后突然下降,下一轮细胞周期时其又重新合成、积累、再下降。如此反复地进行周期性的合成与降解。他们把这类蛋白质称为“细胞周期蛋白(Cyclin) ”。Hunt首先在一种名为Lytechinus p ictus的加利福尼亚海胆中发现了两种Cyclin,这两种Cy2 clin分别被命名为Cyclin A和Cyclin B。后来, Hunt在其它物种中也发现了Cyclin的存在,再次证明了细胞周期的分子调控机制在进化过程中是保守的.4、细胞周期调控的分子机制细胞周期的精确调节依赖于细胞周期驱动、调控和细胞周期监控检测机制。而三位科学家的重大发现促使了细胞周期调控分子机制的阐明。在多细胞真核生物中,参与细胞周期调控的核心蛋白分子主要分为3大类,分别是:Cdk、Cyclin及“细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子”(Cdk inhibitor, CKI) 。其中, Cdk是细胞周期调节的中心环节, Cyclin是Cdk的正调节因子, CKI是Cdk的抑制因子。(一)细胞周期的驱动和调控机制作为“细胞周期发动机”, Cdk在细胞周期的调节中起关键作用。各种Cdk在细胞周期的各个特定时间被激活,通过磷酸化底物,驱使细胞完成细胞周期。这就是细胞周期的驱动机制。如在关键的G1 期的启动中,Cdk起着核心的作用。当细胞受到生长因子的刺激,从G0 期进入早G1 期,并在Cdk2Cyclin复合物的作用下,通过R点,生成有活性的E2F, E2F作为转录激活因子促进DNA复制相关基因的表达,使细胞进入S期在整个细胞周期过程中,细胞内各种Cdk的含量是恒定的,即活化的Cdk与非活化的Cdk的总量不变,改变的只是它们之间的比例。这个比例的改变主要受三方面的调节:首先, Cdk只有通过与特定的Cyclin形成二聚复合物才能发挥作用。在结构上,所有的Cyclin分子均有一个相对保守区域,称为细胞周期蛋白盒(Cyclin box) ,其主要功能是与Cdk结合而改变Cdk的蛋白质构象,激活Cdk的蛋白激酶活性,具有激酶活性的Cdk使周期蛋白特定的氨基酸残基磷酸化,使后者的三维构象发生变化,从而引起一系列的链式反应,调控细胞周期进程。其次,除必须与相应的Cyclin结合外, Cdk的激活还需要在其保守的苏氨酸和酪氨酸残基上发生磷酸化。这个磷酸化是由Cdk激活激酶(Cdk2activa2ting kinase, CAK,即Cdk7 /Cyclin H)完成的。CAK可以磷酸化Cdk1的Thr2161位点,使其活化(Cdk4/6为172位点, Cdk2为160位点) ,改变Cdk的分子构象,促进Cdk 与Cyclin 结合。上文提及的Wee1基因可通过对Cdk1的Tyr215和/或Thr214位点(Cdk4 /6的Tyr17、Thr14位点)磷酸化,抑制Cdk1的活性;而Cdc25基因的产物却可将上述抑制性位点脱磷酸化,对Cdk1的激活非常必要,所以促进了细胞周期的进程。同时, Cdc25本身亦是活化的Cyclin2Cdk复合物的磷酸化靶底物。磷酸化后的Cdc25的磷酸酯酶活性更强,故Cdc25与Cyclin2C复合物之间形成一个正反馈环,快速促使Cyclin2Cdk复合物活性达到生理性高峰。最后, Cdk的活性可被Cdk抑制蛋白(CKI)抑制。CKI通过直接结合Cdk,或与Cdk2Cyclin复合体作用,抑制Cdk的作用,调节细胞周期。目前将CKI分为两大家族,第一大家族是具有广泛抑制Cdk作用的“Cdk 抑制蛋白/激酶抑制蛋白”(Cdkinhibition p rotein /kinase inhibition p rotein, C IP /KIP) 家族, 包括P21cip1 ( cyclin inhibition p rotein1) 、P27kip1 ( kinase inhibition p rotein 1) 、P57kip2等,能抑制大多数Cdk 的激酶活性, P21cip1 还能与DNA聚合酶的辅助因子PCNA ( p roliferating cell nuclear antigen)结合,直接抑制DNA的合成 22 。第二大家族为具有特异性抑制作用的“Cdk 4抑制因子”( inhibitor of cdk 4, Ink4)家族,包括P16 ink4a、P15 ink4b、P18 ink4c、P19 ink4d,特异性抑制Cdk42Cy2clin D1、Cdk62Cyclin D1复合物而抑制其对pRb的磷酸化作用,使游离的E2F与未磷酸化的pRb结合,从而使依赖于E2F转录的基因不能转录,因此间接地抑制包括DNA合成在内的多种生化反应,抑制细胞周期进展。因此,正常的细胞周期需要Cdk的正调节因子Cyclin与负调节因子CKI的精确协同与平衡,一旦这种平衡失稳就会造成细胞的失控性增殖,发生癌变。(二)细胞周期的监控机制“检测点”机制在20世纪80年代末, Hartwell为细胞周期调控机制的阐明做出了另一个重大的贡献。他研究了酵母细胞对放射性的敏感程度,在此基础上提出了检测点( checkpoint) ”的概念。他认为细胞周期是高度有组织和精确的时序调控过程,它严格地沿着G1 SG2 M的顺序循环运转,为保证这一过程的正常进行,细胞形成一套检验细胞周期中DNA合成和染色体分配的机制,即“细胞周期检测点”。这些监测机制可以检测到DNA结构的受损或复制不全,还能检测到细胞分裂过程中所需的蛋白复合物的缺失。当发生这些影响细胞周期正常运行的事件时,检测点相关的信号转导通路将被激活,它们可以使Cdc 2p酪氨酸残基持续的磷酸化而抑制Cdk的活化,从而阻止有丝分裂期的发生;或通过其它机制在有丝分裂期的较晚时期阻断细胞周期的继续进行。在哺乳动物细胞中,当DNA损伤时,还可通过p53基因的作用将细胞周期阻断于S期。阻断细胞周期的进行后,“检测点”机制采取诱导基因转录、促进DNA 的修复等有效的补救措施以排除故障。当故障排除后,细胞周期才能恢复运转。当损伤过大,细胞无法修复时,检测点将启动细胞凋亡程序以清除那些带有病变倾向的细胞,减少对机体的危害。除了DNA损伤检测点外, Hartwell还发现了其它多个检测点,包括有丝分裂中期到后期的检测点,中心体复制检测点等。到目前为止,科学家将所发现的细胞周期检测点分为三种,第一种即是DNA损伤检测点,它包括两个关键性检测点: G1 /S转换点和G2 /M转换点。G1 /S转换点在酵母中称start点,在哺乳动物中称R点( restriction point) ,控制细胞由静止状态的G1 进入DNA合成期; G2 /M转换点则是决定细胞一分为二的控制点,它保证DNA复制的完整。第二种检测点是DNA复制检测点,其在S期中负责DNA复制的进度。第三种为纺锤体组装检测点,其在分裂期起作用,检测纺锤体有无组装、染色体是否正确排列并与纺锤体连接,以及染色体是否正确分配等。这些检测机制保证了DNA在分子水平上的精确复制及在细胞水平上的精确分离。检测点对细胞周期进程进行严格的监督, 使DNA复制和有丝分裂准确无误地进行,保证遗传的稳定性。它们的缺失将导致细胞在没有正确完成前一时相就进入下一时相,细胞将出现严重的遗传性损伤甚至癌变,最终导致机体死亡四、研究发现的意义 Leland H. Hartwell、R Timothy Hunt和PaulM.Nurse三位科学家的重大贡献促进了人们对细胞周期调控分子机制的了解,使人们可以借助对有丝分裂细胞周期的分子调控机制,去了解减数分裂、细胞分化等过程的分子机制,并为细胞生长、组织器官发育、肿瘤发生机制等多个科学领域的研究奠定了坚实的基础。这其中受益最多的,应该是肿瘤领域的研究。目前研究表明,肿瘤的发生是因为细胞的生长和增殖失去了控制。细胞的生长或增殖的失控与细胞基因尤其是原癌基因的异常和/或抑癌基因的失活有很大关系。由于基因的异常导致细胞的周期调控紊乱,而导致染色体的缺失、重排或不平均的分配到子细胞,最终引起细胞的增殖失控及癌变。因此,细胞周期调控因子的发现在癌症的预防、诊断及治疗方面具有深远的实践意义。但到目前为止,真核细胞的细胞周期的分子调控机制仍未被完整地阐明,在今后的10到20年中,科学家们将更加关注于一些更为细节的问题。它的完全阐明将有望为肿瘤的治疗提供一个新的途径。此外,人们对细胞周期的不同步骤之间是如何联系的,以及高等真核细胞与酵母细胞的周期调控机制之间的区别等问题仍存有不少疑问。这些问题都需要人们进一步去实践,去探索。我们期待在不久的将来,细胞周期的调控机制能被人们完整地揭示、理解,以期更深刻地认识生命活动的本质,更好地探索胚胎有序发育、成熟、组织再生与衰老、机体健康与疾病、肿瘤的发生发展,并为肿瘤的治疗提供新的思路。他们的这些发现为何具有重要意义? 因为缺陷性细胞周期调控将导致遗传物质从亲代细胞不充分地复制到两个新子细胞。染色体的部分缺失或重组改变, 是癌细胞演变的重要条件。如细胞含有过量的CDK 分子, 也可能破坏细胞周期, 引起这些后果。已经证实, 在某些人类肿瘤如乳腺癌中, CDK 分子与周期素的水平均见升长高。因此, 凡能抑制CDK 分子活性的治疗手段会具有抗癌疗法的前景。五个人总结1.在方法学上，他们首先考虑的是如何最有效地解决科学问题、取得研究突破，所以均采用了离“应用”似乎相距甚远却利于解决问题的低等生物作为研究材料。如芽殖酵母、裂殖酵母。 2.学术研究应避免“急功近利”3.从20世纪60年代末,哈特韦尔开始研究到或得诺贝尔奖，历经30多年。进展在三位科学家研究的基础上,人们又相继做了很多工作,进一步探索细胞周期的分子调控机制。这其中包括了对细胞周期是如何保持精确的时相性和次序性的研究。从细胞周期的驱动可以看到, Cy2clin2Cdk复合物的活性调控决定了细胞周期的进程。Cyclin2Cdk复合物的活性不仅受前文已提及的Cdk亚基的磷酸化、CKI的结合以及编码Cdk的调控因子的基因转录的调控,它还与Cyclin周期性的出现和消失有关。在Cyclin的结构中有一个毁灭盒( destruction box) ,在Cyclin的自身降解中发挥重要作用,保证了Cyclin周期性消失,使细胞周期正常运行。研究表明,调控细胞周期的蛋白程序性降解是由泛素蛋白酶体系统执行的,即泛素激活酶( E1、E2) 、泛素连接酶(E3) ,其中限速步骤为泛素连接酶催化的泛素转移反应。在G1 期和S期,起主要作用的酶复合物是SCF ( Skp12Cdc53 / cullin2F2box p roteincomplex) ,其泛素化降解G1 /S2Cyclin和一些调控S期起始的CKI。在M期,促后复合物( anaphase2p romoting comp lex, APC) 发挥作用,泛素化并降解M2Cyclin和其它调控有丝分裂的蛋白质。另外,细胞周期检测点的分子机制也是科学家们关注的重点。由于检测点机制能检测出细胞周期过程中极其细微的错误,同时通过目前尚未完全明确的信号转导方式完成错误信号的输入并启动修复工作。它的完全阐明将有望为肿瘤的治疗提供一个新的途径。因此, Polo 样激酶(