中国海洋大学基因工程L4第二章PCR技术.ppt

第二章PCR技术 一 PCR技术的诞生与发展 聚合酶链反应 PolymeraseChainReaction PCR 又称为PCR 扩增技术 是一种高效 快速 特异性的体外DNA聚合程序 1985年 美国PE cetus公司人类遗传研究室的 KaryMullis发明了具有划时代意义的PCR技术 1988年 美国PE cetus公司推出世界上第一台 PCR热循环仪 从而使PCR反应自动化 1993年 KaryMullis因发明PCR技术获得诺贝 尔化学奖 1995年 定量PCR仪诞生 使定量研究DNA靶序列成为现实 定义 在体外的无细胞体系中模拟天然DNA复制过程的使目的DNA的量增加的反应 二 原理 循环denature94 C30SannealingTm 5 Celongate72 Ccycle25 35 三 PCR反应成分1 引物 Primer 15 30nt设计原则 引物间 ACGC GAGC 引物内 AACTGTT GC 末端保守性 兼并碱基2 Taq酶 DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响 DNA聚合酶的保真性主要取决于其3 5 的核酸外切酶活性 它 负责对错误掺入的碱基进行校正 相关研究结果表明 DNA聚合酶的 出错率在每轮延伸每核苷酸1 6X10 6 2 1X10 4范围内 DNA聚合 酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性 与dNTP的结合特异性 磷酸二酯键的形成速率 焦磷酸的释放速率 碱基错误掺入之后的持续延伸性 3 5 的核酸外切活性的强弱 用于PCR的DNA聚合酶简介 KlenowThermusaquaticus72 C35 100nt s mol Thelargespringabove nearGreatFountainGeyser Yellowstone wasthesourceofthecultureofThermusAquaticus discoveredbyThomasBrock U Wisconsinin1968 TaqDNA酶的聚合出错率较高 2 1X10 4 因为它没有3 5 的 的核酸外切酶活性和校正功能 然而通过优化反应条件 可使Taq酶 的聚合出错率降低到原来的1 3 TaqDNA聚合酶催化的聚合反应的 的可能性 则TaqDNA酶还常常导致扩增产物的缺失突变 TaqDNA聚合酶 Thermusaquaticus 普遍错误类型是由AT转换为GC 如果模板DNA具有形成二级结构 避免稀释保存TaqDNA聚合酶 TaqDNA聚合酶在室温下也具有延伸引物的活性 HotStart TaqDNA酶在使用时应注意 用于PCR的DNA聚合酶简介 KlenTaqDNA聚合酶是一种N端缺失了的TaqDNA聚合酶 因而 没有5 的核酸外切酶活性 KlenTaqDNA聚合酶的Mg2 最佳浓度范围很宽 因此很容易优化 KlenTaqDNA聚合酶 Thermusaquaticus 在最佳反应条件下 KlenTaqDNA聚合酶出错率为5 1X10 5 性能略优于TaqDNA聚合酶 反应条件 用于PCR的DNA聚合酶简介 TthDNA聚合酶在Mn2 的存在下 能有效地反转录长度在1000碱 基以下的RNA TthDNA聚合酶在Mg2 的存在下 能由DNA模板合成DNA TthDNA聚合酶 Thermusthermophilus 好地克服RNA链中普遍存在二级结构的难题 TthDNA聚合酶在较高的温度下仍具有逆转录酶活性 因此能很 用于PCR的DNA聚合酶简介 Pfu是一种高保真的DNA聚合酶 出错率极低 PfuDNA聚合酶扩增出的产物带有平头末端 PfuDNA聚合酶扩增速度极快 达1 5 2kb min PfuDNA聚合酶 Pyrococcusfuriosus PfuDNA聚合酶的热稳定性很高 7 0X10 7 1 6X10 6 用于PCR的DNA聚合酶简介 VentDNA聚合酶具有3 5 的核酸外切酶活性和校正功能 因此 与其它DNA聚合酶 如Taq酶 相比 具有相对较好的高保真性 其 出错率为2 4X10 5 5 7X10 5 VentDNA聚合酶 Thermococcuslitoralis 度小于2kb时 扩增产物的长度与Mg2 的浓度并无关联 如果扩增长度大于2kb 则需要高于2mM的Mg2 而在扩增长 如果模板链中存在次黄嘌呤核苷或脱氧尿嘧啶核苷 VentDNA 聚合酶不能延伸引物 3 Mg2 4 模板 Template 制备和用量100bp 40kb实际 3 5k难于得到长扩增产物的原因 3 错配 高温下脱嘌呤 depurination 或脱嘧啶 deamination Taq不能通过pH7 0100 C1 100kb mindepu pH6 451 20 30kb min 反应添加剂 PCR循环参数 模板完整性 Taq酶自动脱落改进办法 发展新酶 pfu Vent 双聚合酶 消除错配 or合成能力强酶 Tth Tricine 三羟甲基甘胺酸 pH稳定性 5 PCRbufferTris Cl KCl6 dNTP20 200 mol L四 平台效应 PCR反应后期循环产物对数累积趋于饱和 伴随0 3 1pmol靶序列的增加 dNTP和引物快速掺入 浓度降低 酶与模板比例下降 变性温度高和温度循环 酶活力和dNTP稳定性下降 非特异性产物或引物二聚体与反应物的竞争 产物在高浓度时变性不完全 影响引物延伸 酶与PCR产物结合 使酶浓度下降 五 PCR反应的质量指标PCR反应的质量标准有 特异性 序列选择 有效性 序列产量 准确性 序列对错 上述三大标准并非由单一因素所决定 因此在PCR反应中必须对多种参数进行联合控制和改进 但由于PCR反应中的各参数往往是相互影响的 因此任何参数的改进不可能同时满足特异性 有效性 准确性 1234Template Primer1 Primer2 VerificationofPCRproducts 六 PCR污染控制设阴阳对照操作分区材料分装防汽溶胶加样顺序使用专门仪器重复 七 PCR技术应用1 点突变技术2 锚定PCR anchoredPCRA PCR 3 不对称PCR asymmetryPCR 引物比例1 1004 表达子PCR expression cassettePCRECPCR 酶切位点克隆噬菌体启动子单链探针蛋白质结合位点产物纯化 检测 PCR技术 点突变 A PCR 5 反向PCR inversePCR 6 原位PCR7 RAPD RandomAmplificationPolymorphicDNAs 原理 引物 条件 应用8 其它七 PCR扩增产物的分析凝胶电泳杂交微孔板夹心杂交法 特异性高 通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物间接地固定于微孔板上 然后 再利用一生物素等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一区域的特异性进行一次杂交 显色后即可判断结果 反向PCR Figure10 16 Vectorette bubblelinker PCRpermitsamplificationofuncharacterizedsequencesflankingaknownDNAsequence Notethatthevectorettescontaincomplementarysequencesattheirendsbutunrelatedsequenceswithinthebubble ArestrictionfragmentcontainingaknownsequenceAflankedbyuncharacterizedregionsXandYisligatedtoavectorettelinkercontainingasuitableoverhangatoneend PCRamplificationoftheuncharacterizedsequenceXisthenpossibleusingaprimerspecificfortheknownDNAsequence A andaprimerspecificforoneofthestrandsofthebubbleinthevectorettelinker B ThevectorettelinkerprimerBcannotprimeDNAsynthesisinitiallyasthereisnosequencetowhichitcanbind itisidentical notcomplementaryinsequencetoonestrandofthebubble andunrelatedinsequencetotheother However primerAinitiatessynthesisofacomplementaryDNAstrandwhichwillcontainasequencecomplementarytooneoftheuniquesequenceswithinthebubblelinker Asaresult primerBcanbindtothisnewlysynthesizedstrandandinitiatenewstrandsynthesistostartaPCRreaction TheflankingsequenceYcansimilarlybeisolatedinanotherreactionusingasuitableA specificprimerandabubble specificprimerderivedfromthestrandoppositetothatusedformakingprimerB 3 Figure10 19 Alu PCRpermitsamplificationofDNAsequenceslocatedbetweentwocloselypositionedbutoppositelyorientatedAlurepeats A PrimerscanbedesignedfromtheAluconsensussequencetohybridizetosequencesateitherterminusoftherepeatelement withthe5directionpointingawayfromtherepeatelement B AsinglesuchprimercanbeusedinaPCRreactiontoamplifysequenceslocatedbetweentwoAlurepeatswhichareinoppositeorientation andarrangedsuchthatthetwoboundprimersareconvergent e g PCRwithprimer2alonecanamplifysequenceXbutnotYorZ primer1alonecanamplifysequenceYbutnotXorZ Acombinationofprimers1and2should intheory permitamplificationofsequencesbetweenrepeatsinthesameorientation Inpractice PCRamplificationmaybedifficultorimpossibleifthedistancebetweentherepeatsistoogreat PCR ELISA EnzymeLinkageImmunosorbentassay SchematicofPCRELISAprocedure Step1 LabelingofPCRproductwithdigoxigeninduringanamplificationreactioninthepresenceofdigoxigenin 11 dUTP DIG dUTP Step2 DenaturationofPCRproductandhybridizationtoabiotin labeledcaptureprobe ThecaptureprobespecificallyrecognizesaninternalsequenceofthetargetDNA Step3 Immobilizationofbiotin labeledhybridonastreptavidin coatedmicroplate followedbywashesthatremoveunhybridized non specificamplificationproducts Step4 Detectionofboundhybridswithperoxidase conjugatedanti digoxigeninantibody Anti DIG POD andthecolorimetricperoxidasesubstrateABTS 颜色互补分析 颜色互补分析法是利用三原色原理 当不同DNA片段 A和B 同时扩增时 用引物5 端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记 A片段引物标记绿色的荧光素 B标记红色的罗丹明 如果仅有一条片段被扩增 扩增产物激发后 只有一种颜色 红色或绿色 如果两条不同大小的片段均被扩增 可通过电泳分离 紫外激发后可观察到不同颜色的两条带 如果两条被扩增片段大小相同 电泳后可见一条红绿互补色 黄色带 如果不用电泳法分离扩增片段 通过一定手段除未掺入引物 亦可观察到扩增产物的颜色 此时 扩增产物无论大小 只要均被扩增 就可见一条红绿互补的黄色条