香菇多糖的酶法提取.doc

香菇多糖的酶法提取 *吴佳慧，王林，高菲，尹若春( 安徽大学生命科学学院，安徽省微生物与生物催化工程技术研究中心，安徽 合肥，230039)摘 要 利用果胶酶、纤维素酶和漆酶对香菇进行酶解，固定料水比 ( 1 15) 和反应温度 ( 40 ) ，以酶解后多糖提取率为指标，考察不同浓度的 3 种酶对香菇多糖提取的影响。在单因素试验的基础上，采用响应面法建立香菇多糖酶法提取的二次多项数学模型，并验证了该模型的有效性; 探讨了果胶酶、纤维素酶、漆酶 3 个因子的交互作用及其最佳水平。响应面分析结果表明: 果胶酶、纤维素酶、漆酶显著影响香菇多糖的提取效果，在果胶酶浓度为 7. 11% ，纤维素酶浓度为 6. 82% ，漆酶浓度为 3. 69% 的优化条件下，香菇多糖的提取率达到 37. 07% 。关键词 香菇多糖，果胶酶，纤维素酶，漆酶，响应面香菇( Lentinula edodes) ，又名香蕈、冬菇，是世界上著名的食用真菌之一。据报道，香菇含有的香菇多 糖、香菇多糖蛋白等多种生物活性物质是理想的免疫 促进剂，且具有抑制癌症和抗肿瘤效果。其中香菇多 糖是一种宿主免疫增强剂和生物反应修饰剂，可抑制肿瘤的发生、发 展 与 转 移1，调 节 免 疫 功 能，并 能 增 强体液免疫和细胞免疫功能，具有抗逆转录病毒活性 和降血脂、抗衰老等功能2。目前，国内外学者对香菇多糖的制备、提取方法 等做了多方面的研究，主要的香菇多糖提取方法有热 水浸提 法、酸 浸 提 法、碱 浸 提 法、微 波 法、复 合 酶 ( 木瓜蛋白酶与纤维素酶) 解法、深层发酵培养法等3 5，传统的浸提法时间长、提取率低、能耗大6。为克服 传统提取方法的缺点，许多学者研究了亚临界水提取1. 1. 1试验材料香菇( 购买于当地市场) ; 果胶酶13 3 000 U / g、纤维素酶14 30 000 U / g、漆酶15 5 000 U / kg 购于合肥博美生物科技有限公司; 乙醇、蒽酮、98% 浓硫酸均为中国药品生物制品检定所产品。1. 1. 2主要仪器粉碎机，上海精 密科学仪器有限公司; 80 2 型高速冷冻台式离心机，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司; 723 型可见光分光光 度 计，上海菁华科技仪 器有限公司; HH 2 孔数显水浴锅、HH 4 孔数显水 浴锅，江苏金坛市环宇科学仪器厂; 移液枪，阿敏生物技术 有 限 公 司; 电 子 天 平，OhausNJ，USA。Corp. Pine Brook，1. 21. 2. 1试验方法香菇多糖的提取和测定及单因素试验法7、超临界 CO 萃取技术与热水浸提法8 9、超 滤2膜技 术 提 取 法10、纤维素酶协同超声 波 法11、响 应面法优化热水 浸 提 法12 等应用于香菇多糖的提取， 在一定程度上提高了提取率，有效保存了香菇多糖的生物活性。本研究采用果胶酶、纤维素酶、漆酶提取香菇多 糖，并对影响香菇多糖提取率的 3 种酶浓度进行响应 面分析，优化了复合酶的最佳配比。原料处理: 香菇烘干( 50 ) 粉碎过筛( 40目) 多糖提取原材料。试验流程: 称取 1 g 原料溶于 15 mL 水，室温浸 润 30 min，加入不同浓度的各种酶，40 水浴 2 h。经 抽滤去除残渣，得抽提液。多次抽提所得的抽提液在4 000 r / min 离心 10 min，将所得上清液合并，减压浓 缩到总上清液体积的 2 /5 1 /2，加 95% 乙 醇 到 乙 醇 含量为 30% ，4 静置 24 h; 离心，弃 去 沉 淀，取 上 清 液再加 95% 乙醇到乙醇含量达到 75% ，4 静 置 24 h; 离心，沉淀用 75% 乙 醇 水 溶 液 分 散，再 离 心，弃 去 上清液，以此法清洗沉淀，去除沉淀中夹带的少量单 糖和低聚糖。沉淀洗 2 次。再次离心后的沉淀用蒸 馏水溶解并定容到 25 mL，然后用蒽酮硫酸法比色法 测多糖含量。计 算 多 糖 提 取 率，提 取 率 / % = ( 多 糖1材料与方法1. 1材料与设备第一作者: 硕士研究生( 尹若春副教授为通讯作者) 。* 安徽省自 然 科 学 基 金 项 目 ( 090413083 ) 、安徽省高校优秀 青 年 人才 基 金 项 目 ( 2004jq114 ) 、安徽省教育厅 自 然科 学 基金 ( 2004kj022)收稿日期: 2011 01 11，改回日期: 2011 04 09按上述流程，分别用果胶酶、纤维素酶、漆酶进行单因素试验。其中各种酶的浓度梯度为 0、1% 、3% 、5% 、7% 、9% 、11% 。香菇多糖提取的响应面法实验设计161. 2. 2在单因素实验的基础上，以果胶酶，纤维素酶和漆酶为自变量，分别用 X1 ，X2 ，X3 表示，并以 1，0，+1 代表自变量低，中，高水平，根据 Box Benhnken 模型的中心组合试验设计原理17 18，进行响应 面 实 验设计。其中 1 12 为析因实验，13 15 为中心试验，15 个试验点分为析因点和零点。图 2 纤维素酶对提取率的影响由图 3 可知，漆酶对提取率的影响呈现很有规律的梯度变化，在 浓 度 为 0% 3% ，随着酶浓度的增 大，提取率逐渐 升 高，并 在 3% 有 最 高 点 19. 01% ; 从3% 之后，随着浓度的增大，提取率稳步回落。因此，选取漆酶浓度区间为 1% 7% 。2结果与讨论2. 1香菇多糖提取的单因素试验影响香菇多糖提取的因素很多，本试验选定不同 浓度的果胶酶，纤维素酶，漆酶作为试验的因子，采用 单因素试验找出影响香菇多糖提取的关键因素。单 因素采用取 点 试 验，根 据 各 点 的数值来推知总体规 律。2. 1. 1不同浓度的果胶酶对提取率的影响如图 1 所 示，果胶酶对提取率的影响在浓 度 为0% 、1% 、3% 时 不 显 著，而 浓 度 增 加 到 7% 时 提 取 率显著提高，并达到最高点 23. 70% 。从 7% 开始，随着浓度的增大，提取率逐渐降低。因此，选取果胶酶的浓度区间为 2% 12% 。图 3 漆酶对提取率的影响2. 2香菇多糖提取的响应面分析与结果试验结果如表 1 所示。表 1因素水平表因素水平 10+ 1X1 ( 果胶酶 / % )X2 ( 纤维素酶 / % )X3 ( 漆酶 / % )21176412117图 1 不同浓度果胶酶对提取率的影响运用 SAS 软件响应面分析程序对实验结果进行回归拟和，得到二次多元回归模型为:2. 1. 2不同浓度纤维素酶对提取率的影响纤维素酶对提取率的影响在浓度为 0% 3% 不显著，而从 3% 5% 显著提高，并在 5% 时达到最高点; 之后随着浓度升高，提取率逐渐下降，但在 9% 时又显示升高趋势，从图 2 和数据上可以看出在浓度为3% 7% 时的最大差值为 7. 78，比浓度为 7% 11%时的最大差值 7. 22 大，说明在 3% 7% 区间里变化比在 7% 11% 区间变化要明显。因此，选取纤维素酶的浓度区间为 1% 11% 。Y = 36. 94 + 0. 30 X + 1. 17 X 0. 51 X 1239. 57 X X + 0. 48 X X 0. 56 X X 1112133. 35 X X + 0. 80 X X 1. 91 X X222333对该模型的方差分析见表 3。如表 3 所示，模型 Pr F = 0. 000 1，失拟项 Pr F= 0. 426 954，表明 模型回归极显著，失 拟 项 不 显 著。由表 4 可知相 关 系 数 R2 = 99. 83% 表明模型的相关 性很 好，调 整 相 关 系 数 = 99. 52% ，表 明 响 应 面 的2. 1. 3不同浓度的漆酶对提取率的影响2022011 Vo l. 37 No. 7 ( To ta l 283)食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES分离与提取99. 52% 的变化可以由此模型解释，模型 与 实 际 情 况拟合的很好。变异系数 CV 越低，试验的可信度和精确度越高，变异 系 数 CV = 1. 251 39，实 验 数 据 可 靠，分析结果可信。因此可以用此回归方程对实验结果进行分析和预测。表 4模型相关性分析相关系数 / %调整相关系数 / %变异系数99. 8399. 521. 251 39回归系数的显著性检验如表 5 所示。表 2 不同水平果胶酶、纤维素酶和漆酶提取香菇多糖的提取率表 5 回归系数的显著性检验项目效应( 系数)标准差tPr | t |因素X1X2X3X1 X1X1 X2X1 X3X2 X2X2 X3X3 X30. 301. 17 0. 51 9. 570. 48 0. 56 3. 350. 80 1. 910. 130. 130. 130. 190. 180. 180. 190. 180. 192. 349. 14 4. 01 50. 602. 64 3. 07 17. 744. 42 10. 130. 066 10. 000 30. 010 20. 000 10. 04590. 027 60. 000 10. 006 90. 000 2实验号X1X2X3( Y) 提取率 / %123456789101112131415 11 11 11 110000000 1 1110000 11 110000000 1 111 1 11100023. 1822. 8324. 2625. 8325. 3027. 0225. 0324. 5031. 4832. 5329. 2133. 4737. 0137. 2236. 59由表 5 可知，回归系数的显著性检验表明: X1 的Pr | t | = 0. 066 1( 0. 05) 表示 X1 的影响不显著，即单一的果胶酶对香菇多糖提取率的影响不显著; X2与 X3 的 Pr 值表现显著性，即单一的纤维素酶、漆 酶对提取率的影响是显著的; 交互项中 X2 X3 的交互作用是极显著的，说明纤维素酶和漆酶的交互作用很强，能极显著地影响实验; 而其他交互项 X1 X2 、X1 X3 的交互作用显著，说明果胶酶、纤维 素 酶、漆 酶之间的交互 作 用 显 著，能 显 著 影响香菇多糖的提取 率。图 4 图 6 反应了各因素对响应值的影响，由 3 组图可知，香菇多糖的提取率在果胶酶、纤维素酶、漆 酶设定的浓度范围内都有一个最大值。而且等高线 图的圆心越接近椭圆表示交互作用越强，等高线的稀 疏表示响应面图形的平陡。采 用 SAS 软 件 分 析，对回归方程中 X1 、X2 和 X3 求一阶偏导，得到响应面极 值点对应的各因素的水平分别为果胶酶浓度 7. 11% ，纤 维 素 酶 浓 度 6. 82% ，漆 酶 浓 度 3. 69% ，此 时香菇多糖最大理论提取率为 37. 07% 。采 用 上 述 最优条件进行香菇多糖提取实验，实际获得 3 组平行 实验平均多糖提取率为 35. 19% ，与理论预测值误差 仅为 5. 07% ，说明该模型预测性很好。用 响 应 面 法 来寻求提取香菇多糖的最佳酶浓度是可行的，具有实 践指导意义。表 3模型回归方程方差分析SourceDFSSMSFPr FX1X2X3X1 X1X1 X2X1 X3X2 X2X2 X3X3 X3模型一次项 二次项 交互项 误差 失拟项 纯误差 总和1111111119333532140. 7211. 022. 12337. 910. 921. 2541. 542. 5813. 53385. 6613. 86367. 054. 750. 660. 460. 20386. 320. 7211. 022. 12337. 910. 921. 2541. 542. 5813. 5342. 854. 62122. 351. 580. 130. 150. 105. 4983. 4816. 062 560. 376. 989. 45314. 7619. 53102. 55324. 6835. 01927. 0511. 990. 066 10. 000 30. 010 20. 000 10. 045 90. 027 60. 000 10. 006 90. 000 20. 000 10. 000 90. 000 10. 010 11. 480. 427 02011 年第 37 卷第 7 期(总第 283 期) 203图 4 果胶酶与纤维素酶交互作用对香菇多糖提取率影响的响应面图及等高线图图 5 果胶酶与漆酶交互作用对香菇多糖提取率影响的响应面图及等高线图图 6 纤维素酶与漆酶交互作用对香菇多糖提取率影响的响应面图及等高线图成分的目标。( 4) 漆酶，即使很小的用量 ( 3. 69% ) ，作 用 于 木 质素协同其他酶的效果显著。3结论( 1) 通过响应面分析法和 Box-Benhnken 设计，建立香菇多糖提取方法的二次回归模型有效简化了实验点。( 2) 响应面分析法优化的香菇多糖提取条件为: 固定料水比( 1 g 15 mL) 和反应温度( 40 ) ，果胶酶 浓度为 7. 11% ，纤维素酶浓度为 6. 82% ，漆酶浓度为3. 69% ，香菇多糖的提取率达 37. 07% 。提取率比使 用单一酶实验组大幅度提高。( 3) 构成香菇子实体的生物大分子包括纤维素，木质素、果胶物质以及活性多糖等。提高活性成分提取率，仅靠单一酶作用显然是难以实现，所以采用酶 有针对性的对不同底物降解，才可以达到既不破坏目标提取物生物活性又破坏子实体结构充分释放目标参 考 文 献1郭焱，郭巍，顾红樱 . 香菇多糖对小鼠免疫功能调节的影响J. 微生物学杂志，2002，22( 4) : 64.吕国英，范 雷 法，张 作 法，等 . 香 菇 多 糖 研 究 进 展J.浙江农业学报，2009，21( 2) : 183 188.梁敏，邬洪源 . 复合酶法提取香菇多 糖J. 高 师 理 科学刊，2008，28( 6) : 72 75.张楷正，杨跃寰，李光辉，等 . 香菇多糖提取方法研究进展J. 四川理工学 院 学 报: 自 然 科 学 版，2009，22 ( 6 ) :63 66.刘 小 丽，黄 晋 杰 . 微波辅助法提取香菇多糖的工艺 J. 食品研究与开发，2010，31( 3) : 14 17.23452042011 Vo l. 37 No. 7 ( To ta l 283)食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES分离与提取6Sham P W Y，Scaman C H，Durance T D. 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