微生物学复习提纲.doc

第六章 微生物的生长及其控制1细胞生长 营养物质（环境中）跨膜 营养物质（原料、胞内） 合成细胞成分 细胞有规律增长 菌体增重 2繁殖：菌体重量增加到一定程度，细胞开始分裂进入分裂阶段。3个体生长 个体繁殖 群体繁殖4群体繁殖 = 个体生长 + 个体繁殖5所以：生长是繁殖的基础，繁殖是生长的结果。第一节 测定生长繁殖的方法一、测生长量 （细胞量）适合于所有的微生物 直 测菌丝长度丝状真菌 接 称干重 （离心法或过滤法） 间 比浊法 用光密度（OD值）表示菌悬液的浓度不适合丝状菌 接 生理指标法 二、测繁殖数（细胞数）适合于单细胞微生物 直 比例计数法 接 血球计数板法 （全菌计数法）既包括活菌又包括死菌 间 液体稀释法 （MPN法） 接 平板菌落计数法（涂布法、浇注法）活菌计数法一、微生物生物量的测定方法1. 湿重法 收集微生物菌体，或将微生物培养液离心，收集细胞沉淀物，然后称重。较为简便，但含水量不定，准确度差2. 干重法 将微生物菌体或离心得到的细胞沉淀物置100105的烘箱中干燥至水份去除，然后再称重。3.含氮量测定法一般微生物细胞的含氮量比较稳定，可以用凯氏定氮法等测其总量，再乘以系数6.25即为粗蛋白含量，蛋白含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。 。4 比浊法 根据细菌悬浮液的吸光度测定其数量。 比浊法：样品中由于菌体细胞对光的消散作用而呈浑浊，细胞数目越多，对光的消散作用越强，浑浊度越高。浊度可以用比色计或分光光度计测量，以光吸收值来表示。单细胞生物在一定的范围内的光吸收值的大小与液体中细胞数目及细胞物质量成正比，因而可用做溶液中总细胞的计数。检测时需用直接显微镜计数或平板活菌计数法制作标准曲线。 该方法缺点是灵敏度差，优点是简便、快速、不干扰或不破坏样品。 检测时可使用侧臂三角瓶在不同的培养时间重复测定样品的浊度，因而广泛地用作生长速率的测定。二、微生物细胞数目的检测方法1、血球计数板法A血球计数板法:利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。B缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；C优点：操作简便，计数直观。2、稀释平板计数法 细菌样品做10倍梯度稀释，取相应稀释度的样品涂布到平板上，或与融化的固体培养基混合、摇匀，培养菌落。优点：传统计数方法。对设备要求不高。稀释平板计数法：对活菌的计数方法 1）涂布法 2）浇注法稀释度的选择 应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，再乘稀释数进行报告。 若有两个稀释度，其生长菌落数均在30300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数，若其比值大于2，则报告其中较小的数字。 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数再乘稀释数进行报告。 若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则按稀释度最高的平均菌落数再乘稀释数进行报告。 若所有稀释度的平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30，以最接近30或是300的平均菌落数再乘稀释数进行报告。 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1再乘最低稀释数进行报告，即报告为 10个。第二节 微生物的生长规律一 典型生长曲线典型生长曲线：将少量单细胞纯菌接种到一定量的液体培养基内，在适宜的温度下培养，并定时取样测定活菌的数目和重量的变化，以活菌个数的对数或活菌重量为纵坐标，以培养时间为横坐标作图，所得的曲线即为典型生长曲线。这种培养方式为间歇培养或分批培养：初始状态下含有限的营养物和微生物。1.迟缓期将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延迟期、适应期。迟缓期的特点：分裂迟缓、代谢活跃延滞期的特点:a生长速度为零；b细胞体积急剧增大; c细胞内的RNA增高; d合成代谢活跃e易产生诱导酶; f对外界不良环境条件敏感影响延滞期长短的因素与实践意义 接种龄: 对数期“种子”，延滞期较短；延滞期或衰亡期“种子”,延滞期较长； 接种量：接种量大，延滞期较短；接种量小，延滞期较长； 培养基成分:培养基成分丰富的， 延滞期较短；培养基成分与种子培养基一致, 延滞期较短；2.对数期 对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。特点： 生长速率最快，细胞呈指数增长；世代时短；代谢旺盛，细胞成分平衡发展； 群体的生理特性较一致。一影响指数期的因素 菌种： 不同菌种的代时差异极大 营养成分：营养越丰富，代时越短 营养物浓度：影响微生物的生长速率和总生长量 培养温度：影响微生物的生长速率二指数期的实践意义 是代谢、生理研究的良好材料 是增殖噬菌体的最适宿主菌龄 是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄 G+染色鉴定时采用此期微生物三几个重要的参数：1繁殖代数（n）：世代数；2生长速率常数（R）：生长速度，单位时间的世代数；3代时（G）：分裂一次所需要的时间；4 G=1/R四细菌研究中常用的三个参数：1繁殖代数（n）,2生长速率常数（R）,3代时(G)3.稳定期 A原因：由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数量)，结束对数生长期，进入稳定生长期。 B获得更多的菌体物质或代谢产物采取措施：补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等 。C特点：1 生长速率常数R等于0；2 菌体产量达到了最高值；3合成次生代谢产物；4细胞内出现储藏物质，芽孢菌内开始产生芽孢。D稳定期的实践意义：a是发酵生产中以菌体为终产品的最佳收获期；b某些代谢产物特别是次生代谢产物发生在此阶段 某些细菌的芽孢也发生在此阶段，故又称作代谢产物合成期；c放线菌的的抗生素在此阶段大量形成。d导致了连续培养原理的提出和工艺技术的改进。4.衰亡期 现象：细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。特点：1 R为负值；2细胞的形态发生变化，出现不规则的衰退形；3细胞畸变，菌体开始自溶。产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡。二、丝状微生物微生物的群体生长曲线1.特性：丝状微生物在液体培养基中大多数情况下是以分散的沉淀物方式,形态从松散的絮状沉淀到堆积紧密的菌丝球不等. 丝状微生物的生长通常以单位时间内微生物细胞的物质量（主要是干重)的变化来表示.丝状微生物在液体培养基中的生长方式在工业生产中很重要。2.生长曲线丝状微生物的群体生长有着与单细胞微生物类似的规律。在深层通气液体培养基中的生长曲线也显示具有迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。工业发酵意义：丝状微生物在液体培养中的生长方式在工业生产中很重要，它影响发酵过程的通气性、生长速率、搅拌能耗及菌丝体与发酵液的分离难易等。三、连续培养与微生物的生长（一）分批培养和连续培养分批培养：将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方式。连续培养：在一定恒定的容积的流动系统中培养微生物，一方面以一定速率不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物（菌体和代谢产物），以使培养系统中的细胞数量和营养状态保持恒定。（二）连续培养类型连续培养的基本原则：微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物。连续培养类型分为恒化连续培养和恒浊连续培养。1恒化连续培养在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长“不断”进行。 生长速率的控制因子：一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质 。恒化器连续培养通常用于实验室的科研工作，尤其适用于与生长速率相关的各种理论研究。2恒浊连续培养通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。 用于获得大量菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业中，但此法不适用于丝状微生物。第三节 微生物的纯培养生长微生物在自然界总是混杂地生活在一起，如土壤和水中，通常栖息着的是许多不同微生物混杂在一起的群体。哪怕是一粒砂或尘土，也常含有多种细菌及其它微生物。要想研究某一种微生物，必须把研究对象从混杂群体中分离出来。纯培养（pure culture）：微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。一、微生物纯培养的分离 方法：1平板划线分离法、2稀释倒平板法、3单孢子或单细胞分离法、4利用选择性培养基分离法 。 1、平板划线分离法用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线 ，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。2、稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。 基本过程：（1）梯度稀释过程；（2）分离培养过程稀释平板分离法使用过程中的几个问题： 1) 梯度稀释度的确定：需分离微生物在样品中的数量 2) 选择菌落接种的依据： a、菌落特征； b、菌体的特征 3) 微生物纯培养的标准：菌落特征一致性 4) 操作要点：无菌操作无菌操作（aseptic operation ）定义：在操作过程中人为地排除一切微生物或一切不需要的微生物。它是微生物学的基本技术。要点：杀死规定作业系统（如试管、三角瓶和培养皿）中的一切微生物，使作业系统变成无菌；在作业系统与外界的联系之间隔绝一切微生物穿过（如用火焰封闭三角瓶和试管等的开口,用棉花过滤空气、用滤器过滤水等）;在无菌室、超净操作台或空气流动较小的清洁环境中，进行接种或其他不可避免的敞开作业，防止不需要的微生物侵入作业系统。3、单孢子或单细胞分离法 采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养 。4、选择性培养基分离法 各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。根据所要分离的菌种的特性选用培养基，如： 分离真菌用马丁氏培养基，PH偏酸；分离放线菌用高氏一号培养基，PH中性偏碱。 不同菌对化学试剂的敏感性：分离放线菌时，培养基中加入数滴10%的酚，抑制细菌和真菌；从土壤中分离真菌，培养基中加入孟加拉红或抗生素，抑制细菌生长。 根据分离对象的营养特征：分离能发酵纤维素的菌株，培养基中以纤维素为唯一碳源；分离固氮菌，用无氮培养基。二、纯培养的保存试管斜面培养基低温、干燥、隔绝空气保存过程的注意点：防止杂菌污染。1、 灭菌彻底 2、棉塞大小要合适 3、无菌操作三、目标微生物纯培养筛选的基本思路、待分离样品的确定、培养基的选择、纯化过程环境条件的控制（温度、空气、P、抑制剂）第四节 环境因素对微生物生长的影响一、 温度不同的微生物生长的温度范围不同，根据生长与温度的关系，微生物的生长有三个温度基点，即最适、最高、最低生长温度，根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物分为：低温微生物、中温微生物和高温微生物。当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用。最适生长温度有时也简称“最适温度”，其意义是某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。 最适生长温度并不等于生长量最高时的培养温度，也不等于发酵速度最高时的培养温度或积累代谢产物量最高时的培养温度，更不等于积累某一代谢产物量最高时的培养温度。嗜冷性微生物最适生长温度大多数在-1020 ，少数可达-34 。分布：海洋、冷泉、深湖和冷藏库中。低温对微生物生长的影响 低温微生物耐低温的原因：胞内酶耐低温；细胞膜中不饱和脂肪酸的含量高。 低于冰点的温度对微生物的影响：水分的丧失；冰晶对细胞膜的物理损伤。低温的用途：菌种保藏、食品冷藏、嗜温性微生物 最适生长温度在2045 的微生物。分布：土壤、植物、温血动物及人体中。体温性微生物：人和温血动物的寄生菌 最适生长温度为3745 室温性微生物：大多数植物病原菌和许多土壤微生物 最适生长温度为2028 嗜热性微生物能在高于4550 的温度下生长（低于3540 便不能生长）分布：主要在温泉、堆肥和土壤中，一些人为的高温环境，如工厂的热水装置和人造热源等处，是嗜热性微生物良好的生存场所。高温菌在高温下生长的原因：抗热的酶，膜中的高饱和脂肪酸。高温菌的生长特性：生长曲线的各个时期均短暂，因此常会在腐败食品中检测不到，这在食品检验中要特别注意。二、氧根据氧与微生物生长的关系可将微生物分为好氧、好氧、耐氧型、兼性厌氧、专性厌氧（一）专性好氧菌（strict aerobe） 必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。绝大多数真菌和许多细菌都是专性好氧菌（二）兼性厌氧菌（facultative aerobe） 在有氧或无氧条件下均能生长，但在有氧情况下生长得更好； 在有氧时靠呼吸产能，无氧时借发酵或无氧呼吸产能；细胞含超氧化物歧化酶和过氧化氢酶；许多酵母菌和许多细菌都是兼性厌氧菌（三）微好氧菌（microaerophilic bacteria） 只能在较低的氧分压下才能生长的微生物。也通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。例如：霍乱弧菌、一些氢单胞菌属、发酵单胞菌属等（四）耐氧菌（aerotolerant anaerobe）一类可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌，即它们的生长不需要氧，分子氧对它们也无毒害。它们不具有呼吸链，仅依靠专性发酵获得能量。细胞含超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。 细胞含超氧化物歧化酶和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。一般的乳酸菌多数是耐氧菌（五）厌氧菌（anaerobe） 它有以下几个特点：1分子氧对它们有毒，短期接触也会抑制它们生长甚至致死；2只有在深层的无氧或低氧化还原势的环境下才能生长；3生命活动所需能量是通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供；4细胞内缺乏超氧化物歧化酶和细胞色素氧化酶；各种光合细菌和 产甲烷菌等都属于厌氧菌三、水分活度（Aw）1.Aw食品在密闭容器中的水蒸气压（P）与在相同温度下的纯水蒸气压（P0）之比值。由于纯水中加入溶质后，溶液中分子之间的引力增加，蒸气压下降，故PP0，因此：Aw纯水=1，Aw无水食品=0 一般食品的：0Aw1Aw值大小反映了溶液中溶质的多少，一般来说，溶质浓度与Aw值成反比。Aw值反映了微生物对水的依赖程度，根据Aw值，可将微生物分为三个类型： 湿生型： Aw在0.9以上，绝大多数细菌 中生型： Aw在0.80.9之间，酵母菌 干生型： Aw在0.8以下，大多的霉菌2.不同类群微生物的生长和水分活性细菌生长的水分活度：细菌生长所需的水分活性比酵母菌、霉菌高。一般在0.900.99之间。一般食品腐败菌生长的最低Aw在0.940.99之间。芽孢萌发时要求的水分，比营养体所要求的水分高。酵母菌生长的水分活性：酵母菌生长所需的水分活性比细菌低，比霉菌高。在0.880.94之间霉菌生长的水分活度：多数霉菌生长所需的Aw最低为0.80，但在0.65 时，尚有少数干性霉菌生长。当Aw低于0.64时任何霉菌都不能生长。因此，干燥便成为一种很好的食品保藏方法。3.食品的水分活性新鲜食品原料：包括动物性原料和植物性原料，如鱼、肉、水果、蔬菜，均含有较多的水分，虽原料的种类不同，但其Aw多数在0.980.99之间，适宜于多种微生物尤其是细菌生长。干制食品： 0.800.85适宜于霉菌生长，其保藏期12周，0.72，保藏期为三个月，0.65时保藏期为13年。（如奶粉）四、渗透压1.渗透压对微生物的影响微生物最适合在等渗溶液中生长膜内膜外（低渗透压环境）：细胞吸水膨胀，破裂膜外膜内（高渗环境）：脱水、质壁分离2.不同类群的微生物对渗透压的适应性绝大多数微生物可以在0.850.9%NaCl的较低溶质浓度的条件下生长，有些微生物必须在含2%以上的盐浓度条件才能良好生长，称为嗜盐性微生物。不同类群的微生物对盐的耐受力不同，但1825%的盐浓度才能完全抑制微生物的生长。绝大多数细菌不能在较高渗透压食品中生存，多数霉菌，少数的酵母菌能耐受较高的渗透压。采用盐渍（530%的食盐）或蜜饯（3080%的糖）的方式，利用高渗条件可保存食品。五 PH值每种微生物生长繁殖所能适应的pH值都有一定的范围，这个pH范围可分为最低pH值、最高pH值和最适pH值，最适pH值指微生物最适合生长繁殖的pH值，最低、最高pH值环境中微生物虽尚能生存但生长非常缓慢且容易死亡。PH值在59的范围较易生长。一般细菌生长的最适pH范围7.07.6 放线菌7.58.5； 酵母菌3.86.0； 霉菌4.05.8。PH值影响微生物生长的主要作用在于 1 影响细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物的吸收。 2影响代谢过程中酶的活性，从而影响微生物的生命活动。一般生长繁殖的最适PH与其合成某种代谢产物的PH通常不一样某些有机酸如苯甲酸可用作防腐剂第5节 接种和培养一 微生物的接种 定义：将微生物移接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程。1、接种工具用的最多的是：接种针（刀形，耙形），接种环液体接种多用到：吸管，滴管2 接种方法1）划线接种 最常用的接种方法。在固体培养基表面作来回直线形的移动。在斜面接种和平板划线中常用此法。2）三点接种 研究霉菌形态时常用此法。用接种针或牙签将单个或少量的微生物接种在平板表面上成等边三角形的三点。3）穿刺接种 保藏菌种或研究微生物的运动时常用此法。4）浇混接种将待接的微生物先放入培养皿中，然后倒入冷却至45度左右的固体培养基，迅速摇匀。5）涂布接种先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板之上，用涂布棒在表面作来回左右的涂布。6）液体接种 实验室中常用吸管或移液管作接种工具。7）注射接种 常用的疫苗预防接种。8）活体接种 专门用于病毒或其它专性寄生活体的微生物，活体可是整个动物或某个活组织，接种方式可以是注射或是拌料喂养。二、微生物的培养方法根据氧气的需要与否分为两大类：好氧培养、厌氧培养 根据培养基的物理特性分为两大类：固体培养、液体培养 （一）好氧培养方法1）固体好氧培养方法 2） 液体好氧培养方法 （二）厌氧培养方法 （三 ） 非细胞型微生物的培养主要是指病毒的培养。主要方法有：1动物培养：采用实验动物来培养，主要是小白鼠；2 鸡胚培养；3细胞培养。第六节 有害微生物的控制在周围环境中，到处都有各种各样的微生物存在着，其中是对人类有害的微生物，我们应采取有效的措施来抑制或消灭它们。一、几个基本概念 一）灭菌(Sterilization) 采用强烈的物化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。商业灭菌：从商品的角度考虑，提出对某些食品的灭菌要求。即食品经杀菌处理后，经检验，无活的微生物检出，或仅能检出极少数非病原菌。此菌在保藏期不能进行生长繁殖（二）消毒(Disinfection) 消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌。（三）防腐(Antisepsis) 防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。防腐的措施有很多，主要有：1）低温、2）缺氧、3）干燥、4）高渗、5）高酸度、6）防腐剂（四）化疗(Chemotherapy) 化疗即化学治疗，它是利用具有高度选择毒力的化学物质来抑制宿主体内部病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。根据控制作用原理、方式和方法分类：物理控制方法、化学控制方法两大类二 常见的灭菌和消毒的物理方法1 高温灭菌1）干热灭菌法A、烘箱内热空气灭菌 160，2小时 适用于玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌。优点：可保持物品的干燥B、火焰灼烧法适用于接种针，接种环，试管口等2）.湿热灭菌湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好。热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强热蒸汽比热空气穿透力强蒸汽潜热大，当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。（1）常压法 A 、巴氏消毒法（pasteurization） 用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法。可杀死其中的病原菌如结核杆菌、伤寒杆菌等，同时又不 损害营养与风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法： 63 C ,30min或 72 C ,15min巴氏消毒法：低温维持法（LTH）：用于牛奶消毒时， 63 C下保持30分钟 高温瞬时法（HTST）：用于牛奶消毒时，75-90保温15-16秒超高温灭菌法（利乐包）： 使用特殊的设备，将原奶加温到摄氏135-140度，保持1-3秒，彻底消灭原奶中的一切微生物，不过由于温度越高，对牛奶的口感和蛋白质等营养成分的破坏就越大，因此超高温灭菌奶的口感和营养价值就比巴氏灭菌的牛奶差多了。 不过由于原奶质量差，所以许多企业的巴氏灭菌法都采用85-90度 不过超高温灭菌也不是万能的，为了杀菌，就需要采用更长的时间，4秒不行就10秒，或者15秒，总之杀到无菌为止！ B 、煮沸法消毒 一般用于引用水的消毒（100 C下数分钟） 此方法适用于注射器，解剖用具等。C 、间歇灭菌法（fractional sterilization OR tyndallization） 方法是：将待灭菌的培养基在80100 C下煮沸1560分钟，以杀死其中所以微生物的营养细胞，然后置室温或37 C下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天。（2）加压法 A 、高压蒸汽灭菌(autoclave): 这是一种应用最为广泛的灭菌方法。 将待灭菌的微生物放置在有少量水的加压蒸汽灭菌锅内。将锅内的水加热煮沸，并将其中的空气彻底驱尽后将锅封闭。再持续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而使温度达100 以上。适用于一切微生物学实验，医疗结构或发酵工厂中对培养基等多种器材、物料的灭菌。该法不是利用高压来杀死微生物，而是利用提高压力使水的沸点升高，以提高水蒸汽的温度，更加有效地杀灭微生物。 B 、连续加压灭菌法（continuous autoclaving ） 主要操作是将培养基在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐。135-150，5-15秒，工业上发酵培养基 135-150，2-6秒，牛奶或其它液态食品影响加热蒸汽灭菌效果的因素 （1）灭菌物体含菌量的影响 （2）灭菌锅内空气排除程度的影响 （3）灭菌对象pH的影响 （4）灭菌对象的体积 （5 ）加热与散热速度2、辐射杀菌有四种类型的辐射作用: 紫外光、电离辐射、某种条件下的强可见光、微波等，可用作控制微生物的生长和保存食品。1）紫外线灭菌多用于物体表面和空间的消毒。接种室，手术室，食品和药品包装室常应用紫外线杀菌。最常用的波长是260nm，一般30W紫外灯可用于15平方米的房间消毒，照射时间为2030分钟，有效距离1米左右。杀菌作用机制：使蛋白质（约280nm）和核酸（约260nm）吸收变性失活；也可产生有毒的光化学产物-自由基，结合到DNA、RNA和蛋白质分子上，干扰细胞的代谢过程。紫外光穿透能力很差，不能穿过玻璃、衣物、纸张或大多数其他物体，但能够在空气中传播，因而常用于消毒而不是灭菌。主要用作物体表面或室内空气的杀菌。也有采用特殊的紫外光辐射装置替代加热或漂白粉处理方法消毒像饮用水等液体。2）.电离辐射主要使用X射线和射线。当X射线或射线撞击分子时，形成离子和自由基分子，故可称电离辐射。电离辐射产生H2O2，使蛋白质发生变化，细胞受到损伤或死亡。电离辐射主要用于其他方法所不能解决的塑料制品、医疗设备、药品和食品的灭菌。 射线用作食品表面杀菌。 射线可用于食品内部杀菌。Co60等放射性元素可放出 射线。适用于密封的物品和不耐热物品的灭菌，如一次性塑料品的灭菌。3）.强可见光400700nm波长范围的强可见光也具有直接的杀菌效应，它们能够氧化细菌细胞内的光敏感分子，如核黄素和卟啉环（构成氧化酶的成分）。实验室应注意避免将细菌培养物暴露于强光下。此外，曙红和四甲基蓝能够吸收强可见光使蛋白质和核酸氧化，因此常将两者结合用作灭活病毒和细菌。4.）微波微波是一种红外线。微波并不直接影响微生物,但可通过被辐照物体产热而杀死微生物。然而由于微波加热食品通常存在不均匀问题,微生物逃逸微波加热现象常会发生。5） 过滤除菌 空气和不耐热的液体培养基的灭菌实验室常用的滤器有：1滤膜过滤器滤膜是用醋酸纤维成素，硝酸纤维素等做成。将滤膜放在特制滤器上进行过滤。2蔡氏过滤器由石棉制成的滤板和一个特制漏斗组成。3玻璃过滤器 4磁土过滤器 5硅藻土过滤器二、化学控制方法 化学控制方法主要是指利用各种化学药剂控制微生物生长的方法。 抗微生物的化学试剂、物理状态不同：液态的、气态的和固态的杀菌效果和对人体或动物体影响不同：消毒剂、防腐剂、化学治疗剂（一）消毒剂和防腐剂 消毒剂是指那些可抑制或杀灭微生物，但对人体也可能产生有害作用的化学试剂。主要用于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和周围环境中的微生物。 防腐剂是指那些可以抑制微生物生长，但对人体或动物体的毒性较低的化学试剂。可用于机体表面，如皮肤、粘膜、伤口等处防止感染，也有的用于食品、饮料、药品的防腐作用。 但现时消毒剂和防腐剂之间的界限已不很严格，如高浓度的石碳酸（3%-5%）用于器皿表面消毒，而低浓度的石碳酸（0.5%）则用于生物制品的防腐剂。 理想的化学消毒剂和防腐剂应当是作用快、效力高但对组织损伤小，穿透性强但腐蚀小，配制方便且稳定，价格低廉易生产，并且无怪味。二)化学治疗剂 化学治疗剂是指那些能够特异性地作用于某些微生物并具有选择性的化学药剂，它们与非特异性的化学药剂相比对人体几乎没有什么毒性或毒性很小，可用作治疗微生物引起的疾病。1、抗生素抗生素（antibiotics）英文一词由两个希腊词所组成： anti意为“对抗 ” ，bios意为“生命”，合在一起，antibiotics 就是可以杀灭生命体的意思，即抗生素是用来杀灭微生物的一类物质。定义：抗生素是一类由微生物或其它生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或其人工衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或干扰它种生物（包括病原菌、病毒、癌细胞等）的生命活动，因而可用作优良的化学治疗剂。抗生素最初是由英国科学家弗来明（A.Fleming）在20年代末期偶然发现的，40年代初才作为化学治疗剂生产问世。 抗生素的抗菌谱：抗生素的作用对象的范围。通常将对多种类群的细菌有作用的抗生素称为广谱抗生素，如四环素和土霉素既对G又对G细菌有作用；而只对少数几种细菌有作用的抗生素则称为狭谱抗生素，如青霉素只对G菌有效。本章重点测定生长繁殖的方法重点掌握血球计算板和平板菌落计数的方法及其操作菌落计数法的稀释度的选择细菌纯培养的典型生长曲线定义，分几个时期及各时期的特点计算代时，繁殖代数及生长速率什么是纯培养？纯培养如何获得？影响微生物生长的主要因素（温度及氧气）接种及主要的接种方法微生物的主要培养方法常见的灭菌消毒方法及用途 思考题1 解释：典型生长曲线 ，接种，商业灭菌 ，消毒2 什么是纯培养？纯培养如何获得？ 3 测定生长繁殖的方法 第七章微生物的遗传变异第一节 遗传变异的物质基础一、什么是遗传与变异 遗传和变异是生物界最本质的属性之一。遗传是亲代和子代生物学特性传递的过程，使亲代的特性在子代中重现。遗传学是研究生物遗传机制的科学。1、微生物的结构较为简单，多数为单细胞或简单的多细胞，有的甚至是分子生物（如病毒，类病毒等）。这样就使得遗传学的研究在分子水平上进行提供了可能和方便，从而推动和促进了分子遗传学与分子生物学的诞生和发展。2、微生物营养体绝大多数是单倍体，核结构较为简单，核中DNA发生的变化，一般都能在遗传性状上表现出来。3、微生物的繁殖速度快，传代时间短。（如：E.coli每20即可繁殖一代 ）4、微生物的突变体容易被识别。微生物是分子生物学和遗传学研究中的明星。有关遗传变异的几个基本概念遗传性：亲代将自身一整套遗传因子传递给下一代的行为和功能，微生物的遗传性是相对稳定的。变异性：凡是在遗传物质水平上发生了改变，从而引起某些相应性状发生改变的特性，称为变异性。这种变异性是可以遗传的。基因型：又称为遗传型 和因子型。是生物体一切遗传基础的总和。生物的遗传性具有其特定的物质基础。在亲代传给子代的遗传物质中携带着它的全部遗传因子，即基因。基因决定着生物的遗传类型。表型：在合适的外界环境条件下，特定遗传型的个体通过新陈代谢和生长发育所表现出来的种种具体的性状。就称为该生物的表型（又叫表现型、现象型）。遗传型相同的个体在不同的环境条件下会呈现不同的表型。饰变（modification）：指生物体由于非遗传因素引起的表型改变，变化发生在转录、转译水平，特点是几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化，性状变化的幅度小，不遗传，引起饰变的因素消失后，表型即可恢复。二、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验（一）经典转化实验（transformation）：F.Griffith，研究对象：Streptococcus pneumoniae（肺炎双球菌）SIII型菌株：有荚膜，菌落表面光滑，有致病性RII型菌株：无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性只有S型细菌的DNA才能将S. Pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的，是遗传因子。（2） 经典实验 噬菌体侵染实验这就有力地说明亲代的蛋白质外壳的确没有进入菌体，没有参与子代噬菌体的增殖。可是，最终从E.coli 细胞中释放出来的却是一群完整成熟的与亲代有着同样蛋白质外壳的噬菌体颗粒。这就一步证实了DNA是噬菌体遗传信息的载体。（三）经典实验 病毒重建试验 这就充分说明，在RNA病毒中，遗传物质也是核酸，这里只不过是RNA罢了。以上三个实验得出一个共同得结论即：只有核酸才是生物遗传变异的物质基础。第二节 微生物的变异一 微生物的变异现象形态发生变异、代谢发生变异、结构发生变异、生理特性发生变异、发生极端变异二 微生物的突变DNA突然发生改变，通常包括染色体畸变和基因突变2大类1 染色体畸变某些因素使DNA发生大的损失，使染色体产生畸变。在结构上出现缺失，重复，倒位和易位。在数目上有所增减。2 基因突变是DNA分子的某一位位置的结构发生改变的结果，它只涉及一对碱基或少数几对碱基，又称点突变。（1） 基因突变的特点：1）非对应性、2）稀有性、3）规律性、4）独立性、5）遗传和回复性、6）可诱变性（二）突变率 所谓突变率，就是每一个细胞在每一世代或每次分裂时所产生的突变频率。不同微生物或同种微生物，在不同情况下突变率是不同的。一般说来，自发突变率约为每个细胞每十万次到一亿次分裂产生一次突变，可用10-6-10-9表示每次细胞分裂的突变率。自发突变的机率虽不算高，但是微生物的繁殖能力极强，从这个角度看，发生突变的机率还是相当可观的。3、 诱变机制 （1）碱基的置换 它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。（2）移码突变 指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变。第三节 菌种选育菌种选育包括选种和育种两方面1选种（1） 从自然界中选种又称菌种筛选法，主要步骤有：样品采集：根据目的到最合适的地方去采集样品。其中土壤是最常采集样品的地方。采土时要注意如下几点：A土壤肥瘦、B采土深度：离地面520cm处、C采土季节：春秋二季为宜、D采土方法增殖培养分离纯化：A平板划线分离法，B稀释涂布分离法，C单孢直接挑取法性能测定 包括粗测和精测（2）从生产中选种2育种 主要是诱变育种和杂交育种诱变剂的种类诱变剂的定义：能引起生物产生高于自发突变频率的突变的外界因素。1）物理诱变剂：主要包括紫外线，X射线，r射线等2）化学诱变剂： 5-溴尿嘧啶、亚硝酸、丫啶类染料等诱变育种诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。 诱变育种具有极其重要的实践意义。诱变育种的基本过程：选择选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验。1.出发菌株的选择：出发菌株用来育种处理的起始菌株出发菌株应具备：对诱变剂的敏感性高；具有特定生产性状的能力或潜力； 出发菌株的来源：自然界直接分离到的野生型菌株：历经生产考验的菌株：已经历多次育种处理的菌株：2.制备细胞悬液要求：菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长；细胞分散且为单细胞方法：玻璃珠打散10-15min; 加.3%吐温80（表面活性剂）用无菌脱脂棉过滤。 制备：生理盐水（0.85%NaCl) 缓冲液 浓度：细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml3.诱变处理：诱变剂的作用：提高突变的频率；扩大产量变异的幅度；使产量变异朝着正突变或负突变移动。剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在7080%）选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。 化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反映的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法选出突变种。诱变处理方式：单一因子处理 ；复合因子处理：4、杂交育种 第四节 菌种的退化，复壮和保藏影响微生物菌种稳定性的因素：a）变异；b）污染；c）死亡；一 菌种的退化1）菌种退化现象主要表现在：a菌落和细胞形态改变;b生产性能的下降;c对生长环境的适应能力减弱2）菌种退化的原因:a基因的自发突变;b育种后没有很好的分离纯化;c培养条件的改变;d污染杂菌3）防止衰退的措施:a减少传代次数;b创造良好的培养条件；c经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；d采用有效的菌种保藏方法；二 菌种的复壮1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。a）纯种分离；b）通过寄主体进行复壮2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。三 菌种的保藏基本要求：在一定时间内使菌种不死、不变、不污染、不降低生产性能1菌种保藏的基本原理人工创造适合于休眠的环境条件，如干燥、低温、缺氧和养料等使微生物的代谢活动处于最低的状态但又不至于死亡，达到保藏目的。2常用的菌种保藏方法A 斜面冰箱保藏法 B 半固体穿刺保藏法 C 石蜡油封存法D 砂土管保藏法 E 冰冻干燥保藏法思考题：1、 名词解释：遗传，变异，遗传型，表型，基因，诱变育种2、 从自然界土壤中进行选种的具体方法？3、 试述紫外线诱变育种的操作方法？第八章 微生物与自然界 微生物与环境间有着极为密切的关系，微生物的生命活动依赖于环境，同时也影响着环境，研究微生物与环境之间的关系，了解它们在自然界的分布，可为人们开发微生物资源提供理论依据，以使人们利用微生物在自然界中的作用来改造自然，保护自然。 微生物之间，微生物与其他生物之间，也存在着相互依存，相互制约的关系，研究它们之间的关系，使人类更好地利用微生物，为防治人和动植物疾病，为工农业生产服务。 生态系统：在一定的空间内生物的成分和非生物的成分通过物质循环和能量流动互相作用、互相依存而构成的一个生态学功能单位。生态学：研究生物与其周围生物和非生物环境之间相 互关系的一门科学。微生物生态学：研究微生物与其周围生物和非生物环境之间相互关系。 各种环境中的微生物的种类、分布； 微生物和其它生物的关系； 微生物与物质循环； 微生物与环境保护微生物在生态系统中的地位生产者：从无机物合成有机物 以真核植物和蓝细菌为代表的绿色植物成了自然界中的生产者。消费者：利用有机物进行生活，一般不能将有机物直接分解成有机物 动物是自然界中的消费者分解者：分解有机物成无机物 细菌和真菌构成了自然界中的分解者微生物在生态系统中的角色1、 微生物是有机物的主要分解者；微生物最大的价值也在于其分解功能。它们分解生物圈内存在的动物和植物残体等复杂有机物质，并最后将其转化成最简单的无机物，再供初级生产者使用。2、微生物是物质循环中的重要成员；微生物参与所有的物质循环，大部分元素及其化合物都受到微生物的作用。在一些物质的循环中，微生物是主要的成员，起主要作用；而一些过程只有微生物才能进行，起独特作用；而有的是循环中的关键过程，起关键作用。3、 微生物是生态系统中的初级生产者；光能营养和化能营养微生物是生态系统的初级生产者，它们具有初级生产者所具有的二个明显特征，即可直接利用太阳能、无机物的化学能作为能量来源，另一方面其积累下来的能量又可以在食物链、食物网中流动。4、微生物是物质和能量的贮存者；微生物和动物、植物一样也是由物质组成和由能量维持的生命有机体。在土壤、水体中有大量的微生物生物量，贮存着大量的物质和能量。5、微生物在地球生物演化中的作用；微生物是最早出现的生物体，并进化成后来的动、植物。藻类的产氧作用，改变大气圈中的化学组成，为后来动、植物出现打下基础。第一节 微生物与自然界中的物质循环一 碳素循环1 碳元素是组成生物体各种有机物中最主要的组分，约占有机物干重的50%。2 碳元素的存在形式：CO2，碳酸盐和有机物中的碳。3 微生物在碳