毛绒鬼伞漆酶基因的克隆1.doc

毛绒鬼伞漆酶基因的克隆摘要：综合运用苯胺蓝平板脱色法和愈创木酚法对毛绒鬼伞菌是否会产生木质素降解酶进行简单定性分析。之后，运用cDNA末端快速扩增（Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术去克隆一个鬼伞的漆酶结构基因和其对应的全长cDNA,并对其序列进行分析。关键词：定性分析，cDNA末端快速扩增，漆酶基因1 绪论1.1 木质素简介1.1.1 基本概念 木质素是由聚合的芳香醇构成的一类物质，存在于木质组织中，主要作用是通过形成交织网来硬化细胞壁。木质素主要位于纤维素纤维之间， 起抗压作用。在木本植物中，木质素占25%，是世界上第二位最丰富的有机物(纤维素是第一位)。1.1.2 单体与结构 木质素是由四种醇单体（对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇）形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有使细胞相连的作用。木质素是一种含许多负电集团的多环高分子有机物，对土壤中的高价金属离子有较强的亲和力。 因单体不同，可将木质素分为3种类型：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素（syringyl lignin，S-木质素），由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素（guajacyl lignin，G-木质素）和由对-羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对-羟基苯基木质素（hydroxy-phenyl lignin，H-木质素）；裸子植物主要为愈创木基木质素（G），双子叶植物主要含愈创木基-紫丁香基木质素（G-S），单子叶植物则为愈创木基-紫丁香基-对-羟基苯基木质素（G-S-H）。从植物学观点出发，木质素就是包围于管胞、导管及木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外的物质，并使这些细胞具有特定显色反应（加间苯三酚溶液一滴，待片刻，再加盐酸一滴，即显红色）的物质；从化学观点来看，木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于纤维素。木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。 木质素在木材等硬组织中含量较多，蔬菜中则很少见含有。一般存在于豆类、麦麸、可可、巧克力、草莓及山莓的种子部分之中。其最重要的作用就是吸附胆汁的主要成分胆汁酸，并将其排除体外。 另外，虽然其详细情况目前尚不得而知，但木质素的构造与多酚非常相似，故此，木质素与多酚应该有密切的关系。总之，二者对于身体都有很好的作用。木质素单体的分子结构1.2 木质素降解酶系 木质素的降解酶系是非常复杂的体系，目前对它的研究较多，认为最重要的木质素降解酶有3种：木质素过氧化物酶(LigninperoxidaseLip)、锰过氧化物酶(ManganeseperoxidaseMnp)和漆酶(Laccase)。除此之外，还有芳醇氧化酶(Ary1alcoholoxidaseAAO)、乙二醛氧化酶(GyoxaloxidaseGLOX)、葡萄糖氧化酶(Gucose1oxidase)、酚氧化酶、过氧化氢酶等都参与了木质素的降解或对其降解产生一定的影响。1.3 漆酶漆酶（英文名称:Laccases CAS 编号：80498-15-3）借助氧将对苯二酚（氢醌）氧化成对苯醌的酚氧化酶的一种，亦称为对苯二酚氧化酶。田彦六郎（1883）在漆树的树液中发现能使“树漆”氧化硬化的酶，后来贝特兰德（GEBertrand，1894）详细地研究了东南亚产的漆中的酶，命名为漆酶。也分布于微生物、菌类中。是一种铜蛋白质，蓝色，分子量约12万，含4原子铜。可被CN-抑制。在漆树的永延液汁中可被此酶氧化变成黑色色素的物质是漆酚、氢化漆酚等。 漆酶(Laccases)是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，存在菇、菌及植物中。漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保型酵素。由于这几年环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶也成为众多学者的研究对象。 漆酶独特的催化特性使其在生物检测中有广泛的应用,作为高效的生物检测器而成为底物、辅酶、抑制剂等成分分析的有效工具和手段。漆酶构成的生物检测器主要有两种:漆酶电极和漆酶酶标。 此产品是一种浓缩原酶，他复配用来保证在处理过程中保持PH值在6.0-4.8的范围。不过特别在剂量比较小的情况下，要用醋酸来调PH值。漂白程度很容易由他使用的剂量多少来控制。由于他可以停止反应，工艺控制非常简单。无需另外灭酶活.2 实验操作2.1 实验材料2.1.1 酶和试剂限制性内切酶、限制性内切酶、T4 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、ExTaq DNA聚合酶。4种dNTP和One Step RTPCR Kit，TRIzol试剂，Oligotex mRNA Mini Kit，DNA纯化试盒。愈创木酚、苯胺蓝。2.1.2 菌株毛绒鬼伞 0901大肠杆菌 XL10-Gold载体 pMD18-T2.1.3 主要仪器UV 754 紫外可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；YXQ-LS-SH 全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；QYC 211 摇床：上海福玛实验设备有限公司；AL204 电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；SHP-150型 生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；DZF-6050 真空干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；HH-S28s 数显恒温水浴箱：上海精宏实验设备有限公司；超低温冰箱：上海精密科学仪器有限公司；台式高速离心机：上海化工机械厂；LG2020 电泳成像系统：河南兄弟仪器设备有限公司；全自动PCR仪：上海山富科学仪器有限公司。2.2 实验方法2.2.1 试剂配制以下试剂配制均参考现代分子生物学实验技术(第二版)PDA苯胺蓝培养基：含苯胺蓝0.1g/L，琼脂20g/L。PDA愈创木酚培养基：含愈创木酚0.04%，琼脂20g/L。DEPC水：吸出1mL放在1000mL双蒸水中配成1DEPC水，放在1000mL容量瓶中静置24小时用于处理仪器，高压灭菌用于配置试剂。75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20保存(其中DEPC水需先高压)1MTris-Cl：121.14gTris-base溶于800mL水中，用冰乙酸调PH值至8.0，定容至1000mL，高温高压灭菌。0.5M EDTA：EDTA 186.1g溶于800mL水中，用NaOH调PH值至8.0，定容至1000mL，高温高压灭菌。10mgmL-1溴化乙锭：在10mL水中加入100mg溴化乙锭，溶解后分装成1mL小份，4保存。5XTBE：Tris-base 54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH8.0)20mL，加水至1000mL。凝胶加样缓冲液：溴酚蓝0.4%，蔗糖60%。2.2.2 木质素降解酶的简单定性 PDA苯胺蓝平板退色试验1将试验菌接种于PDA苯胺蓝培养基平板，28下避光培养，记录蓝色培养基中有无退色现象的产生，有则记为+，反之记为-。+表示该菌株能产LiP和MnP。PDA愈创木酚平板显色试验2将试验菌接种于PDA愈创木酚培养基平板上后，置28下培养，每天记录有无红棕色变色圈的产生，有红棕色圈者记为+ 反之记为-。+表示该菌株能产Lac。2.2.3 毛绒鬼伞（0901）菌丝体的培养、诱导及预处理用接种环挑一环试管种接入盛有25 ml PDA液体培养基的250 ml三角瓶，置恒温摇床中，28，240 rmin振荡培养约4 d，菌丝体足量后加入250ul 100 mmolL的2，5-二甲苯胺诱导漆酶基因的表达，24 h内收集菌体，用DEPC处理的dH O配制的PBS缓冲液清洗3次，滤干后迅速置于液氮中冻存10 min，备抽总RNA和总DNA32.2.4 总DNA、总RNA 的抽提和mRNA 的纯化 分别参见TRIzol试剂和Oligotex mRNA Mini Kit操作手册42.2.5 基因组步行 具体操作步骤详见Clontech公司Universal GenomeWalkerT Kit User Manua12.2.6 SMARTTM RACE5SMARTTM 3-RACE的原理 利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA.然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer，GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer，UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3 末端的DNA片段扩增出来。(见Figure 1)Figure 1.SMARTTM 5-RACE 先利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(见Figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer，UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer，GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3/ 5-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3和5端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。Figure 2.实验中发现，做RACE反应实验实际操作中仍存在不少困难。因此，对RACE反应条件进行反复摸索是十分必要的。这是因为： 第一，在5-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤(反转录、同聚物加尾和PCR扩增)，每一步都可能导致失败；第二，扩增DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品的不均一性，因而特异性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此，使用RACE技术扩增得到的特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测序，以排除RACE实验结果中扩增产物假阳性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。2.2.7 DNA的纯化。消化，连接和转化 见相应的试剂盒操作手册和文献6进行2.2.8 DNA测序3 实验结果3.1 木质素降解酶简单定性结果试验菌各接种至愈创木酚平板和苯胺蓝平板当天即记录平板的变色现象，记录如下表1表1 木质素降解简单定性鉴定记录表培养基类型编号现象愈创木酚123苯胺蓝456注：+表示出现相应变色反应；记录时间为每隔24h。参考文献1 蔡磊,尹峻峰,杨丽萍,张克勤.几种简便的木质素降解真菌定性筛选方法.微生物通报，2002,29（1）：67-692 王宜磊,朱陶,邓振旭.愈创木酚法快速筛选漆酶产生菌.生物技术，2007,17(2):40-423 张银波,姜琼,江木兰,马立新.金针菇漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达研究.微生物学报,2004.12