酶的纯化和固定化.doc

分离纯化的意义:从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义。工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等。医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。基因工程的需要酶活力：指酶催化反应的能力 1min催化1mol分子底物转化的酶量为该酶的 一个活力单位(Unit)，采用最适条件 酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。酶的总活力：指样品的全部酶活力 总活力=酶活力总体积(ml) 或=酶活力总质量(g) 总活力=活力单位数ml酶液总体积(m1) 比活力：指酶纯度指标 指单位蛋白质所含有的酶活力(Unit/mg蛋白) 比活力=活力单位数mg蛋白(氮) =总活力单位数总蛋白(氮)mg回收率(百分产量）：提纯后与提纯前酶的总活力之比 回收率=每次总活力/第一次总活力100% ;提纯倍数：提纯后与提纯前比活力之比 提纯倍数=每次比活力/第一次比活力基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性;防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；要求在低温下操作;加入的化学试剂不使酶变性;操作中加入缓冲溶液.抽提有效成分的影响因子:1. pH值2. 溶剂的极性和强度3. 水解酶4. 温度5. 搅拌6. 氧化 DTT PVP 7.金属离子 1-3mmol/LEDTA8. 抽提液与抽提物的比例 5：11、 预处理 细胞破碎 : 机械法：匀浆、研磨、压榨、超声等 ;非机械法：渗透、酶溶、冻融、化学等细胞破碎方法 组织种类 匀浆 大多数动、植物组织超声 细胞混悬液研磨 细菌、植物细胞 酶溶 细菌、酵母冻融裂解 培养细胞 机械破碎通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。捣碎法研磨法匀浆法 物理破碎通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 化学破碎通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎有机溶剂:甲苯丙酮丁醇氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎自溶法 外加酶制剂法二、抽提（蛋白质溶解）抽提通常是指用适当的溶剂和方法，使原料中有效成分分离出来的过程。理想的抽提溶液应具备下述条件：1.对有效成分的溶解度大2.对杂质不溶解或溶解度很小3.来源广泛、价格低廉、操作安全酶的提取工作应在获得材料后立即开始，否则应在低温下保存，-20 - -70为宜。或将生物组织做成丙酮粉保存。水溶法:大部分酶或蛋白质能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中,考虑因素：盐浓度、pH(等电点pI)、温度、辅助因子有机溶剂法:酶与脂质结合得比较牢固，不溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中 采用不同比例的有机溶剂进行提取 ,如：乙醇、正丁醇等大多数蛋白质均能溶于水、稀盐、稀碱或稀酸溶液中，故蛋白质的提取一般以水溶液提取为主。通常采用类似生理条件下的缓冲液，如20-50m mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7.0-7.5）或0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5-8.0）缓冲液作提取液。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐、稀碱、稀酸，常在提取液中加入适量的有机溶剂，如乙醇、丙酮、异丙醇、正丁醇等。酶溶液的浓缩:沉淀法 吸附法 超过滤法 透析法 减压浓缩法 冷冻干燥法超滤膜是具有特定的均匀孔径和孔隙的多孔薄膜。原理：在加压条件下，把酶溶液通过一层只允许水分子和小分子物质选择性透过的微孔超滤膜，而酶等大分子则被截留，从而达到浓缩酶液的目的。冷冻干燥法:冷冻的抽提液在真空状态下，可以由固体直接变为气体。用此原理进行浓缩，有效成分几乎不会破坏。酶的纯化目的: 把粗抽提酶液采用科学方法制备成纯度高的酶制品酶的纯化方法:1,溶解度的差异:盐析法,PEG沉淀法,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法2,热稳定性的差异:热处理沉淀法3电荷性质的差异:离子交换层析法,电泳法4分子大小和形状的差异:凝胶过滤法,超滤法,透析法,离心法5亲和力的差异:亲和层析法6疏水作用的差异:疏水层析法7分配系数的差异:双水相系统萃取法盐溶：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度随盐浓度的升高而上升。盐析：当盐浓度增高到一定数值时，蛋白质溶解度又逐渐下降，直到蛋白质析出。盐析作用是由于当盐浓度较高时，盐离子与水分子作用，使水的活度降低，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。盐析是可逆的。 应用：可以采用多次盐析的方法来分离、提纯蛋白质。盐析一般操作步骤：1.选择一定浓度范围的盐溶液使部分杂质呈“盐析”状态，有效成分呈“盐溶”溶解状态。2.离心分离后得到上清液3.再选择一定浓度范围的盐溶液，使有效成分等物质呈盐析状态，而另一部分杂质呈盐溶状态。4.用离心法收集沉淀物-即为初步纯化的有效成分物质。分段盐析不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。二、等电点沉淀 等电点（pI）: 使某一蛋白质所带正负电荷相等时的溶液pH值称为该蛋白质的等电点。各蛋白质的一级结构不同，pI不同，荷电种类和数量也不同，故可通过电泳方法分离混合蛋白质。pHpI, 蛋白质带负电, 体内蛋白质的pI大多为5左右, 故生理条件下一般以负离子形式存在; 蛋白质的等电点沉淀、离子交换和电泳均以蛋白质的两性解离和其等电点特性为基础。蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。此法很少单独使用，可与盐析法结合用。 三、有机溶剂沉淀法与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有两个:1.与盐溶液一样具有脱水作用2.有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小. 注意：1.低温操作2.中性盐的作用3.多价阳离子的作用有机溶剂沉淀法的优点是溶剂容易蒸发除去，不会残留在成品中，因此适用于制备食品级酶。而且有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。有机溶剂沉淀法的缺点是，容易使酶变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。四、凝胶层析（排阻层析）1.概念：凡是利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离的方法，均称之为排阻层析。用于层析的分离介质称为凝胶层析介质。凝胶层析介质主要以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。2.凝胶层析的原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。3.凝胶层析的特点及应用:特点：设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点。用途：蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。4.凝胶的条件亲水性高，表面惰性, 稳定性强 , 具有一定的孔径分布范围 ,机械强度高.5.凝胶的类型:葡聚糖凝胶,琼脂糖凝胶,聚丙烯胺凝胶,烯丙烷基葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺价交联制成的凝胶（属硬凝胶）,琼脂糖与葡聚糖共价组成的复合凝胶(Superdex，复合凝胶)6.凝胶的选择: 混合物的分离程度主要聚决于凝胶颗粒内部微孔的孔径和混合物分子量的分布范围。分子量较小的生物高分子，一般采用交联葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶:大分子物质，多用琼脂糖;处在中间范围的分子，几种都可7.凝胶用量的计算 干凝胶用量（克）柱床体积(ml)/凝胶的床体积(ml/g)8.凝胶的处理 （1）室温浸泡法（2）加热煮沸法9.凝胶柱的处理 1.柱的选择 理想的直径与长度之比是：1：25-1：100 2.装柱10.凝胶柱的鉴定 2mg/ml的兰色葡聚糖2000、红色葡聚糖、细胞色素c或血红蛋白等过柱。11.层析柱的重要参数 柱体积：凝胶柱所能容纳的总体积。 。 外水体积：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。 内水体积：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。 基质体积：是指凝胶颗粒实际骨架体积。12. 柱层析操作过程 层析介质的平衡、膨润；装柱；加样；扩展以及流出液成分的检测和分部收集；柱的再生 13.加样与洗脱 加样:加样量与测定方法和层析柱大小有关。 加样量的确定要视被分离物在层析柱的分配系数(K)或洗脱体积(Ve)来决定。洗脱（1）洗脱液,原则：能溶解被洗脱物质和不使其变性或失活。一般以单一缓冲液或盐溶液作洗脱液，也可用蒸馏水。（2）流速 ,严格控制，否则收集的每一部分洗脱体积就不会恒定，理想的分配系数就难以测出。（恒流泵）14.凝胶柱的再生及保存（1）用水反复进行逆向冲洗。再用缓冲液进行平衡，即可重复使用；（2）把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理方法进行，处理后重新装柱即可再行使用。短时间保存（湿态保存）:反复洗涤除去蛋白质等杂质，加入适当的防腐剂(0.02%NaN3)。 长时间保存（干燥保存）:将凝胶从柱中取出，进行洗涤、脱水（70%-90%-95%乙醇）和干燥（乙醚或60-80度烘干）。Sepharose应以湿态保存五、亲和层析亲和层析法：欲分离的大分子物质S和相对应的专一物质L(配体)以次级键结合，能生成一种可解离的络合物L-S，其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形成M-L-S复合物。根据L-S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层析法。1.具有专一性亲和力的生物分子对：酶底物, 特异性抗原抗体,激素受体,DNA互补的DNA或RNA,凝集素和糖蛋白,2.基本过程：固相化,配基Ligand:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。基质(载体)Matrix:亲和层析中与配基共价结合,使其固相化的物质。3.基质的选择理想的基质应满足下面的要求；（1） 极低的非特异吸附性（2）高度的亲水性（3）较好的理化稳定性（4）具有大量的化学基团（5）具有适当的多孔性(即孔径大小和 筛孔多少)基质种类:琼脂糖,交联琼脂糖应用最多Sepharose 4B,聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶（ACA）,纤维素,多孔玻璃珠4.配体（基）(ligand）的选择与纯化的物质有较强亲和力,具有与基质共价结合的基团,配基和生物大分子结合后，在一定条件下能解离，而且不能破坏生物大分子的生物活性。5.亲和吸附剂的制备制备：配体偶联到基质上方法：物理法：包埋法、吸附法 化学法：偶联法、交联法溴化氰偶联法：活化、偶联、除去未结合的配体、配体结合量的测定6.提高吸附剂的操作容量在配体和基质之间引入手臂”,增加配体的取代程度,配体与基质以最少的键连接,基质多孔性的影响,其他（样品浓度、PH值、离子强度、上样速度）7. 洗脱目的：使固定化配基和生物高分间的亲和力降低，解开生物高分子和亲和吸附剂之间的结合。方法：非专一性洗脱专一性洗脱8. 亲和层析柱的再生:当洗脱结束后，连续用大量的洗脱液或高浓度的盐溶液彻底洗涤柱子，然后再用平衡缓冲液使层析柱重新平衡。经过这样处理的柱子可再次上样，进行第二次亲和层析。9.亲和层析的特点优点：(1)纯化过程简单、迅速(2)分离效率高(3)实验条件温和缺点：(1)针对某一分离对象就需要制备专一的吸附剂和建立相应的实验条件 (2)配基的选择及其与基质的共价结合需要烦琐的操作步骤六、离子交换层析1.原理:是基于所研究或所分离物质的阳离子或阴离子和对应的离子交换剂间的静电结合通过离子间的吸附和脱吸附而将电解质溶液各组分分开.七、电泳法：原理：带有电荷的生物分子在电场作用下可发生移动。由于混合物各组分所带电荷性质、数量以及分子量各不相同，在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速度也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的分类：聚丙烯酰胺凝胶电泳按原理和操作形式的不同，主要有不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳和双向电泳等类型。聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：九、酶分离和纯化的注意事项1.在过滤或搅拌等操作过程中，要防止泡沫的生成，以避免酶蛋白在溶液的表面变性。2.重金属离子对某些酶的破坏作用，在提取液中加入少量金属鏊合剂EDTA。3.有些含巯基的酶在分离时，往往需要加入某种巯基试剂，如巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)等，可防止酶的巯基在制备过程中被氧化。4.为了防止内源蛋白酶对酶的水解，在提取液加入少量蛋白酶抑制剂。 纯度的标准 纯度提高和回收率的鉴定能帮助我们选择纯化方法与纯化条件。但是经过一定的纯化步骤后，为了了解所获得的样品是否均一纯净还要进行纯度鉴定。一、酶的纯度标准1溶解度法 由于所需样品量较大，已很少采用2. 电泳法 常用的有醋酸纤维素薄膜电泳、聚丙烯酰胺 不连续胶电泳和聚焦胶电泳，特别是后二者有极高的分辨力，电泳谱带上分辨其是否均一。3. 超离心法 在高达 65，000rpm的离心力场情况下观测离心谱带，根据沉降峰带是否分裂、是否有“肩”、是否对称等可以作出均一与否的判断4免疫学法纯化的酶样品在琼脂胶上与相应的抗体进行免疫反应，根据得到的沉降线可以判断样品的纯度。如果此法以免疫电泳的方式进行，则更为灵敏。二、酶制剂的剂型液体酶制剂制备与应用: 这包括稀酶液和浓缩酶液。一般在除去菌体等杂质后，不再纯化而直接制成或加以浓缩。只适于就近的某些工业部门如纺织工业等直接应用特点: 比较经济，但不稳定，而且成份繁杂.固体粗酶制剂制备与应用: 这类制剂有的是发酵液经过杀菌后直接浓缩干燥制成；有的是发酵液滤去菌体后喷雾干燥制成;有的则加材淀粉等填充料。这些制剂多用于皮革软化脱毛、水解纤维素等方面。特点: 固体粗酶制剂便于运输和短期保存，成本也不高。食品级固体酶制剂对纯度不一定要求严格，强调安全卫生，需严格按照国家制定标准执行纯酶制剂用途:包括结晶酶在内，通常用作分析试剂或用作医疗药物，要求有较高的纯度。样品的保存1生物大分子的稳定性与保存方法很大关系，2干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，3液态贮藏时应注意以下几点：样品不能太稀，样品太稀易变性 ，一般需加入防腐剂和稳定剂 ，贮藏温度要求低，提高酶的稳定性 获得酶制剂后需提高酶的稳定性，延长其有效期。影响酶的稳定性有以下几种因素：(1)温度(2)pH和缓冲液(3)酶蛋白浓度(4)氧 为了保证有较高的稳定性，除了应避免不适宜的条件外，最常用的办法是加入某些稳定试剂： (1)底物、抑制剂和辅酶 这是现在广泛采用的一些物质，如用L-谷氨酸可稳定N-甲基谷氨酸合成酶(2)SH-保护剂 可用的有谷肮甘肽、二巯基乙醇(但易自动氧化).(3)其它 首先是低分子无机离子，如Ca2+能保护-淀粉酶，Mn2+能稳定溶菌酶，C1-能稳定透明质酸酶等，它们的作用机理可能是防止酶链伸展。其次是表面活性剂，例如许多酶配制于1的苯烷水溶液中，即使在室温条件下其催化活力也能维持相当长的时间.再则是高分子化合物如血清白蛋白、多元醇等, 特别是甘油和蔗糖是近年来常用的低温保存添加剂。此外，某些情况下，丙酮、乙醇等有机溶剂也显示一定的稳定作用。最后为了防止微生物污染，可加入甲苯、苯甲酸和百里酚等，它们对大多数酶没有不良影响。 固定化酶又称水不溶酶或固相酶，是指通过物理和化学的方法把水溶液的酶接到水不溶性的载体上，成为不溶于水，但仍有酶活性的一种酶衍生物。 固定化酶的优点极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺。固定化酶提高了对酸碱和温度的稳定性，增加了酶的使用寿命可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。酶的使用效率提高，产物得率，产品质量有保障，成本低。固定化酶缺点酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。比较适应水溶性底物和小分子底物。与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定化。制备固定化酶遵循基本原则：必须注意维持酶的催化活性及专一性。固定化应该有利于生产自动化、连续化。固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于重复使用。固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。固定化酶成本要低，以利于工业使用。 1. 制备固定化酶的方法 :化学方法、物理方法、物理与化学结合法三种。制备时应注意：（1）保护酶蛋白的立体结构不变。（2）避免不溶性载体与酶的活性中心发生作用（3）在温和条件下进行，避免高温、高压、强酸碱等（1）化学方法制备的固定化酶的形态结构模型1 离子结合法2 交联法3 载体结合法4 架桥法5 网络结合6 酶网（2）物理方法制备的固定化酶的形态结构模型1 物理吸附法2 包埋法3 微型胶囊法4 凝胶格子型5 空心纤维型6 纤维丝型（3）物理化学结合法制备的固定化酶的形态结构模型1 架桥、包埋结合法；2 包埋与离子结合法；3 共价结合包埋法2.固定化酶的作用模型及其反应机理以羧甲基纤维素固定葡萄糖淀粉酶水解淀粉生产葡萄糖为例说明。1）作用模型可以连续进行催化反应（适宜的底物浓度、温度、pH值）（2）反应机理载体的作用： 保持酶的立体结构保护酶的活性中心保证酶的连续催化反应3. 酶的固定化方法举例（1） 载体结合法制备固定化酶1 常用载体 粒子大小、网目结构表面积大小、亲水性部分的量、化学组成等方面考虑 纤维素、右旋糖酐、葡萄糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃2 常用方法 共价键结合法 : 酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备固定化酶的方法。即，通过化学共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水的载体上。（1）酶与载体反应的主要功能基团:游离羟基：肽链C末端的 羧基，天门冬酰氨酸，谷氨酸的羧基 游离氨基：肽链N末端的 氨基，赖氨酸 氨基巯基：半胱氨酸 羟基：丝氨酸，苏氨酸 酚基：酪氨酸 咪唑基：组氨酸2）所用载体重氮化法：具有氨基的不溶性载体（RNH2）。以稀盐酸和亚硝酸钠作用形成重氮化合物。 多糖类衍生物、氨基酸共聚物、多孔玻璃烷 化 法：卤族的乙酰衍生物（氯乙酰纤维素、溴乙酰 纤维素、碘乙酰纤维素）含卤族的高聚物（氟苯乙烯和二乙烯苯共聚物）3）固定化酶的制备机理将与载体反应的功能基团与各种重氮化剂、烷化剂等反应形成共价键制备固定化酶。（4）优缺点优点：酶与载体结合较牢固，稳定性好、不易脱落，有利于长时间连续使用，因此它是目前应用和报导的最多的一类方法 缺点：制备条件复杂；酶蛋白活性中心易破坏离子键结合法（1）所用载体 纤维素的衍生物，离子交换树脂（2）固定化酶的制备机理 酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固相载体之间由于静电相吸而形成络合物，使酶吸附到离子交换剂上。（3）优缺点优点 操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心不易破坏，有利于制备高活性酶缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下酶易从载体上脱落物理吸附法 这是通过氢键、疏水键和-电子亲和力等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法（1）常用载体活性炭、白陶土、氧化铝、多孔玻璃、硅胶、碳酸钙凝胶淀粉麸质、大孔树脂、DEAE纤维素、DEAE葡聚糖凝胶 （2）固定化酶的制备机理所用载体具有活性，可将酶吸附到载体上 3）优缺点优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的高级结构;方法简单，成本低。缺点：酶吸附不牢固，易脱落；防止吸附酶的蛋白质与载体发生变性反应（4）提高吸附容量和酶与载体间的吸附力有以下几种途径：控制好吸附与操作条件,是开发新的载体,是根据载体性质对酶进行适当的化学修饰,（2） 包埋法制备固定化酶 这是将聚合物的单体和酶溶液混和后，再借助聚合促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，使酶包埋于聚合物中以达到固定化酶方法。 酶本身不参与反应，仅用物理方法把酶包埋在凝胶细小的格子中，或包围在半透膜或聚合物中。包埋方法有两种：1 格子型固定化酶2 微型胶囊法格子型:将酶包埋于高分子凝胶细微网格内微囊型:将酶包埋在高分子半透膜中制备成微囊型 界面沉淀法、界面聚合法、二级乳化法、液膜(脂质体)法 这两种方法都适用于底物和产物都是小分子的酶的固定。1 格子型固定化酶（1）原理 以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶存在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的网状格子中。反应为厌氧反应。（2）方法（以丙烯酰胺为材料是最常用的方法）（3）制备的固定化酶2 微型胶囊法（1）原理 把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球状含酶微型胶囊。（2）特点1微囊直径几微米几百微米。2低分子底物可以自由通过并进入微囊内。3与酶反应后的生成物被排除在微囊外，4酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中，5外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内（3）方法 表面聚合法、液中干燥法、相分离法表面聚合法:A 乳化分散B表面聚合C 清洗（4）微型胶囊法形成的固定化酶（5）微型胶囊法优缺点优点：A 制备条件温和，制得的胶囊不易变化。 B 能很好地保存天然酶的活性和特性。C 大小可任意调节，制备时间短。缺点：单体很活跃。在胶囊化过程中要充分注意防止酶的失活和变性。包埋法优缺点：优点： 操作简单，活力高 缺点： 对小分子底物适宜（三） 交联法制备固定化酶概念：双功能试剂或多功能试剂与酶蛋白质中的 氨基酸残基作用，使酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶。1 发生作用的氨基酸残基：酪氨酸的酚基，胱氨酸的SH巯基，N末端的a氨基。2 常用的双功能或多功能试剂：戊二醛，聚甲叉双碘乙酰胺吗，双重氮联苯胺3 酶网载体交联法先将酶吸附在不溶于水的载体上，再用双功能试剂戊二醛与酶蛋白的氨基之间交联起来，形成酶网包围在载体表面。常用载体：硅胶、离子交换树脂。交联法优缺点：优点：操作不太复杂。酶交联结合牢固，固定化费用不太高， 缺点：反应较剧烈，酶失活较大，需酶量大，机械稳定性差，不适合于大规模工业生产，因为交联反应往往比较激烈，许多酶易在固定化过程中失效，酶回收率不高。可采用保护措施：1.在交联反应前先用抑制剂或底物进行专一性掩护；2.在交联反应系统中添加惰性蛋白如血清白蛋白、明胶等。 （一）酶活性的测定方法1 测定酶的固定化量 固定化反应完成后，以原始酶量减去洗涤液（反应液）中残存的酶含量。2 测定颗粒直径 固定化酶的粒径越小，酶活性越高。固定化酶颗粒直径大小影响酶活性。3 测定酶反应最适pH值 酶固定化后反应的最适pH较原来的酶有所变化。4 检查酶是否脱落测定酶活性后，滤除固定化酶，用离心所得的溶液再经过适当保温检查是否还继续进行反应，如果溶液中出现酶反应，说明酶