叶绿素荧光分析技术与应用.ppt

叶绿素荧光分析技术与应用 1931年 Kautsky和Hirsch第一次用肉眼发现叶绿素荧光动力学现象 Kautskyeffect 距今已有80多年 但把叶绿素荧光动力学作为一种技术应用于光合作用的研究中则是近20年的事 叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收 传递 耗散 分配等方面具有独特的作用 与 表观性 的气体交换指标相比 叶绿素荧光参数更具有反映 内在性 特点 因此 叶绿素荧光动力学技术被称为测定叶片光合功能快速 无损的探针 并广泛应用于植物生理学 生态学和农业科学研究中 基本概念 绿色植物或含叶绿素的部分组织在黑暗中适应片刻或用近红外光预照射 然后在可见光下激发 并用荧光仪检测 会发现植物绿色组织发出一种微弱的暗红色的 强度随时间不断变化的荧光信号 这个过程称为叶绿素a荧光诱导动力学 简称为叶绿素荧光动力学 荧光来源 由于叶绿素分子吸收的光能有一部分消耗于分子内部振动上 辐射出的能量就小 根据波长与分子能量成反比的规律 E hv2 反射光的波长比入射光的波长要长一些 所以叶绿素溶液在入射光下呈绿色 而在反射光下呈红色 绝大部分植物体内叶绿素荧光来自PSII的天线色素系统 而PSI色素系统基本不产生荧光 荧光来源 叶绿素分子吸收量子后 由最稳定的 最低能量的基态 常态 提高到一个不稳定的 高能状态的激发态 由于激发态不稳定 迅速向较低能态转变 能量有的以热量的形式散失 有的以光形式散失 从第一单线态回到基态所发射的光就成为荧光 荧光的寿命很短 约为10 8 10 9s 光合电子传递的 Z图 激发能 光化学反应形成同化力 热耗散 荧光 荧光测量基础 植物叶片所吸收的光能有3个走向 光合驱动 热能 叶绿素荧光 3个过程之间存在竞争 其中任何一个效率的增加都将造成另外两个产量的下降 测量叶绿素荧光产量 可以获得光化学过程与热耗散效率的变化信息 CO2固定光呼吸Mehler反应N代谢 荧光是研究光能分配的探针 叶绿素荧光 植物吸收的一小部分光重新以光的形式发射出来 P D F 1F 1 P D 光化学的和耗散性的荧光淬灭 活体叶绿素荧光是光合作用的有效探针 活体状态下 叶绿素荧光几乎全部来源于PSII的Chla 包括天线Chla 活体叶绿素荧光提供的快速信息仅仅反映了PSII对激发能的利用和耗散情况光合作用过程的各个步骤密切偶联 因此任何一步的变化都会影响到PSII从而引起荧光变化 也就是说通过叶绿素荧光几乎可以探测所有光合作用过程的变化 尽管叶绿素荧光产量仅占叶片吸收光能问题的1 2 但测量却非常简单 荧光光谱不同于吸收光谱 其波长更长 因此荧光测量可以通过把叶片经过给定波长的光线的照射 同时测量发射光中波长较长的部分光线的量来实现 叶绿素荧光测量是相对的 因为光线不可避免会有损失 因此 所有分析必须把数据进行标准化处理 包括进一步计算的许多参数 将绿色植物或含叶绿素的部分组织 如叶片 芽 嫩枝条 茎或单细胞藻类悬液放在暗中适应片别 或用近红外光预照射 然后在可见光下激发 并用荧光计检测 结果就会发现植物绿色组织会发出一种微弱的暗红色强度随时间不断变化的荧光信号 这过程称为植物体内叶绿素a荧光诱导动力学 简称为叶绿素荧光动力学 绝大部分是来自叶绿体光系统II PSII 的天线色素蛋白复合体中的叶绿素a分子 荧光发射波长范围约在650 780nm 荧光发射峰在685nm和735nm 其荧光激发光谱与叶绿体的吸收光谱近似 荧光激发峰在438nm与480nm左右 根据现在国际上的统一命名 可把荧光诱导曲线划分为 O 原点 I 偏转 D 小坑 或pl 台阶 P 最高峰 S 半稳态 M 次峰 T 终点 这几个相 phase 有时在O和I之间还可辨认出一个扔点称为J相 其中O P相为荧光快速上升阶段 1 2s 从P T为荧光慢速下降 猝灭 阶段 4 5s 在此阶段 往往出现复杂的情况 有时没有M峰 有时出现几个渐次降低的峰 因叶片的生理状态不同而异 一般而言 遭受环境胁迫的叶片M峰消失 而生理状态良好的叶片往往在P峰之后有几个峰出现 这可能反映了同化力形成和使用之间从不平衡到平衡的一个快速的调节过程 叶绿素荧光诱导动力学 OIDPSMT曲线 经暗适应的绿色植物样品突然受到可见光照射时 体内叶绿素分子可在纳秒 ns 级时间内发出一定强度的荧光 此瞬时的荧光诱导相位称为初相或 O 相 此时的荧光称为固定荧光 Fo 然后荧光强度增加的速度减慢 因而在Fo处形成拐点 接着以毫秒级速度形成一个缓台阶 称为 I 相和 D 相 数秒后荧光强度可达最高点 称为 P 峰 若所用激发光强度达到或超过被测样品光反应的光饱和点时 P峰即趋于或等于最大荧光 Fm 荧光强度超过Fo那一部分的荧光称为可变荧光 Fv 在P峰之后 植物荧光通常经1 2次阻尼振荡 称较大峰 M1 和 M2 才降到接近Fo的稳定的 T 相终水平 荧光强度下降的过程现称为荧光猝灭 根据植物材料和暗适应时间的不同 上述荧光诱导动力学过程要延续3 6分钟左右 叶绿素荧光动力学的测量可采用调制式与非调制式两种不同方法 非调制式荧光计的结构比较简单 它仅需要一个强连续光源 此光源既作为激发光 又作为测量光 但是为了能够捕捉到植物荧光信号上升前沿中的拐点 要求整个系统的时间分辨率达到毫秒 ms 级 在光源与样品之间 通常加有蓝色的长波截止滤光片和毫秒级电子快门 现在国外也有用亮度较大的发光二极管作为光源的 由于发光二极管光源的上升前沿较快 这样就可省去电子快门 光电转换接收器可用光电倍增管或光电三极管 它们的光谱响应要选择与植物荧光发射波长范围相吻合 在接收器之前通常加有红色的短波截止滤光片 以完全滤掉激发光 毫秒级记录设备可用瞬态记录器 记忆示波器或带有A D转换的计算机等 在控制电子快门与记录荧光信号之间要有一个同步触发装置或同步程序 以保证取样和记录过程与电子快门动作相同步 为了减少样品对荧光的重复吸收 通常是把接受器与入射的激发光安排在样品的同一侧 叶绿素荧光动力学的测量方法 调制式动力学荧光计至少应具有两束光 调制的弱测量光和连续的强化光 为了使测量光本身完全不被接收器直接检出 测量光中和接收器前使用的滤光片应完全无交叉重叠的光谱成分 光化光对接收器信号的干扰 可用折光转盘来解决 为了能够精确地测定Fo值 经验证明测量光到达样品表面时的强度要小于10ergs cm 2 s 1 由于该强度在室温下不足以引起还原态QA的积累 因而荧光强度将始终保持在较低的 恒定的Fo水平上 此时若在照有测量光的样品上再叠加一束饱和光化光 植物荧光才迅速上升 并达到P峰 这就是Fv部分 此后荧光猝灭过程与前述非调制荧光猝灭过程相似 应该着重指出的是 由于调制式动力学荧光计采用了选频或锁相放大技术 使它只检出与测量光具有相同频率和固定相位差的植物荧光调制信号 而对其他背景光的干扰不放感 所谓调制技术 就是说用于激发荧光的测量光具有一定的调制 开 关 频率 检测器只记录与测量光同频的荧光 因此调制荧光仪允许测量所有生理状态下的荧光 包括背景光很强时 正是由于调制技术的出现 才使得叶绿素荧光由传统的 黑匣子 避免环境光 测量走向了野外环境光下测量 由生理学走向了生态学 所谓饱和脉冲技术 就是打开一个持续时间很短 一般小于1s 的强光关闭所有的电子门 光合作用被暂时抑制 从而使叶绿素荧光达到最大 饱和脉冲 SaturationPulse SP 可被看作是光化光的一个特例 光化光越强 PSII释放的电子越多 PQ处累积的电子越多 也就是说关闭态的电子门越多 F越高 当光化光达到使所有的电子门都关闭 不能进行光合作用 的强度时 就称之为饱和脉冲 打开饱和脉冲时 本来处于开放态的电子门将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热 F达到最大值 经过充分暗适应后 所有电子门均处于开放态 打开测量光得到Fo 此时给出一个饱和脉冲 所有的电子门就都将该用于光合作用的能量转化为了荧光和热 此时得到的叶绿素荧光为Fm 根据Fm和Fo可以计算出PSII的最大量子产量Fv Fm Fm Fo Fm 它反映了植物的潜在最大光合能力 在光照下光合作用进行时 只有部分电子门处于开放态 如果给出一个饱和脉冲 本来处于开放态的电子门将该用于光合作用的能量转化为了叶绿素荧光和热 此时得到的叶绿素荧光为Fm 根据Fm 和F可以求出在当前的光照状态下PSII的实际量子产量Yield PSII F Fm Fm F Fm 它反映了植物目前的实际光合效率 在光照下光合作用进行时 只有部分电子门处于关闭态 实时荧光F比Fm要低 也就是说发生了荧光淬灭 quenching 植物吸收的光能只有3条去路 光合作用 叶绿素荧光和热 根据能量守恒 1 光合作用 叶绿素荧光 热 可以得出 叶绿素荧光 1 光合作用 热 也就是说 叶绿素荧光产量的下降 淬灭 有可能是由光合作用的增加或热耗散的增加引起的 由光合作用的引起的荧光淬灭称之为光化学淬灭 photochemicalquenching qP 由热耗散引起的荧光淬灭称之为非光化学淬灭 non photochemicalquenching qN或NPQ 光化学淬灭反映了植物光合活性的高低 非光化学淬灭反映了植物耗散过剩光能为热的能力 也就是光保护能力 体内叶绿素荧光动力学有两个显著的特点 一是它可将植物发出的荧光区分为性质上完全不同的两个部分 固定荧光 Fo 部分和可变荧光 Fv 部分 固定荧光 Fo 代表不参与PSII光化学反应的光能辐射部分 可变荧光 Fv 代表可参与PSII光化学反应的光能辐射部分 因而根据可变荧光 Fv 在总的最大荧光 Fm Fv十F 中所占的比例 Fv Fm 即可简便地得出植物PSII原初光能转换效率 另一个特点是 荧光动力学是测定植物从暗中转到光下 其光合作用功能从休止钝化状态转为局部活化状态 直到全部正常运转状态过程中的荧光动态变化 因而它包含着十分丰富的光合信息 这远不是一般静态焚光测量所能比拟的 在体内叶绿素荧光动力学测定中 当样品的叶绿素浓度和荧光计的激发光强恒定时 PSII原初电子受体QA的氧还状态是决定体内叶绿素荧光强弱的主要因素 当植物经一段时间暗适应 或用优先为光系统I PSl 所利用的长波光照射后 其体内PSII的QA和随后的电子受体QB和PQ库等均完全失去电子而被氧化 这时PSII反应中心可接受光电子 即处于 开放 状态 这时荧光强度最弱 即为Fo 或处于 O 初始相 当植物被饱和光激发 使PSII电子受体QA QB和PQ库等完全被还原时 PSII反应中心不再接受光电子 即处于 关闭 状态 这时荧光强度最强 即为Fm 或处于 P 峰相 植物经短暂照光达到 P 峰后 由于一些光合酶系逐渐被活化 使PSI开始运转 而将PSII还原侧的还原态电子受体QA QB 和PQH2等再氧化 从而引起荧光强度的猝灭 这称为qQ猝灭 植物在光的持续照射下 紧接着qQ猝灭的增加 在光合膜的两侧逐渐建立起质子梯度和形成膜高能态 试验证明 它们也可造成荧光猝灭 这种猝灭称为能量猝灭 或qE淬灭 qQ和qE灭是植物在正常生理条件下的两个最主要的猝灭成分 qQ猝灭因为是由QA 等再氧化所造成 因而它与光合电子传递 光合放氧等过程直接相关 而qE猝灭因为是由质子梯度和膜高能态所引起 因而它只与ATP的形成 积累以及与光合膜的状态有关 而与光合电子传递和光合气体交换无直接的联系 以上对荧光动力学中两种猝灭成分的分析称为Q分析 它对于正确理解和分析叶绿素荧光动力学猝灭过程的光合生理意义及其与其他光合参数 特别是与气体交换的关系 是十分重要的 它消除了过去看起来似乎是相互矛盾的一些试验结果 从而为叶绿素荧光动力学在理论上的进一步深入研究和在实际中的广泛应用扫清了障碍 这是近年来荧光动力学在理论研究方面的重要新进展 根据上述Q分析理论 西德Schreiber博土设计了一种新型的脉冲调制荧光计 该仪器在过去一般调制荧光计的基础上 又增加一束强饱和闪光 2000W cm 2 它以约5秒一次的频率 与一般段调制荧光计原有的强连续光化光一起 共同照射激发植物样品 以瞬时完全消除qQ猝灭 结果在原来荧光动力学的曲线上 便形成许多叠加的锯齿状荧光脉冲 这样从原有的荧光动力学曲线和锯齿状荧光脉冲包络线中 就可计算出qQ和qE两个成分 此外 该仪器还具有不怕其他强光源干扰的优点 甚至可拿到光下现场操作 此类荧光计的代表性产品是西德Walz公司生产的叶绿素荧光测定系统 PAM 1 compactbasicdevice 2 externalrechargeablebattery 3 batterycharger 4 PC HP 200 5 specialfiberoptics 6 leaf clipholderpermitssimultaneousPARand Cmeasurements 7 externalhalogenlamp 8 darkleafclip 9 distanceleaf clip 10 separatemicroquantum temperaturesensor 11 compacttripod usedtomountbasicdevice leaf clipholderandexternalhalogenlamp 12 transportcase Measuringlightsource RedLED 650nm standardintensity0 1 molmsPAR modulationfrequency0 6or20kHz Auto20kHzfunctionActiniclightsources RedLED array 665nm max 600 molmsPARandfar redLED 730nm max 15WmHalogenlamp 8V 20W blue enriched 710nm selectivewindowamplifier patented Measuredparameters Fo Fm Fm F Fo Fv Fm max Yield F Fm Yield qP qN NPQ PARand C usingLeaf ClipHolder2030 BorMicroQuantum Temp Sensor2060 M ETR i e PARxF Fm Userinterface IBM IBM compatiblePC 80286upwards orHP 200 PPalmtopPC connectionviaRS232 19200baud keyboardoperation monitorscreendisplayDataacquisition ViaPCusingDA 2000softwareDataoutput DisplayandprintoutviaPC analogoutput0to2 5VPowersupply Internalrechargeablebattery12V 1 2Ah providingpowerforupto500yieldmeasurements external12Vbattery BatteryCharger2020 LDimensions 20cmx10 5cmx8 5cm LxWxH Weight 2kg incl battery 以反应常数表示三种反应的速度kP光化学反应photo reactionkF发射荧光fluorescencekD热耗散Energydissipation荧光产额可表示为 F kF kF kP kD 光合量子产额可表示为 P kP kF kP kD 热耗散产额可表示为 D kD kF kP kD PSII作用中心完全开放时 kP最大 kF最低 此时的荧光称为初始荧光Fo PSII作用中心完全关闭时 kP 0 kF最大 此时的荧光称为最大荧光Fm Fm与Fo之差 Fm Fo Fv 是因为光化学反应进行而猝灭的荧光 称为可变荧光Fv 显然 光化学反应的最大潜能可表示为 P Fm Fo Fm Fm Fo Fm Fv FmFv Fm是反映光合效率的重要指标分析 Fm下降 Fv Fm下降 Fo上升的原因 叶绿素荧光动力学的生物学意义 PAM结构示意图 1 2 3 4 叶绿素荧光诱导动力学曲线 origin inflection intermediate peak dip peak quasi steadystate amaximum terminalsteadystate PAM测量的荧光曲线 饱和脉冲法 SP 叶绿素荧光术语 Fv Fm PSII的最大光化学量子产量 MaximumquantumyieldofPSIIphotochemistry 又叫原初光化学的最大产量 PSII光化学反应的潜在产量 PSII潜在最大量子产量等 反映了当所有的PSII反应中心均处于开放态时的量子产量 Fv Fm Fm Fo Fm 0 Fv Fm 1高等植物 0 832 0 004 藻类稍低 叶绿素荧光参数 当植物或藻类受到胁迫 Stress 时 Fv Fm显著下降 Fv Fm qP qN NPQ Fv Fm PSII ETR等 qP 光化学淬灭 Photochemicalquenching 即激发能被开放的反应中心捕获并转化为化学能而导致的荧光淬灭 反映了光适应状态下PSII进行光化学反应的能力 qP Fm Fs Fv 1 Fs Fo Fm Fo 0 qP 1 叶绿素荧光参数 qN 可变Chl荧光的非光化学淬灭qN Fv Fv Fv 1 Fm Fo Fm Fo 0 qN 1NPQ Chl荧光的非光化学淬灭NPQ Fm Fm Fm Fm Fm 1 0 NPQ 不需测定Fo 适合野外调查 叶绿素荧光参数 非光化学淬灭 Non photochemicalquenching qNorNPQ Fv Fm PSII光化学的有效量子产量 EffectivequantumyieldofPSIIphotochemistry Fv Fm Fm Fo Fm 1 Fo Fm 0 Fv Fm 1由于在光适应状态下非光化学过程得到活化 因此Fv Fm 往往小于Fv Fm 叶绿素荧光参数 叶绿素荧光参数 PSII PSII光化学能量转换的有效量子产量 EffectivequantumyieldofphotochemicalenergyconversioninPSII 也叫PSII 线性 电子传递的实际量子产量 PSII复合体吸收的每个光量子引起电子传递的效率 PSII光化学能量转换的总量子产量 PSII能量转换的实际效率 PSII光化学的量子效率 用于PSII光化学的能量占PSII天线系统吸收的总光能的比例 以及PSII有效光化学量子产量 PSII Fm Fs Fm F Fm qP Fv Fm 0 PSII 1不需暗适应 不需测定Fo 适合野外调查 rETR 相对电子传递速率 relativeelectrontransportrate ETR PAR PSII 0 84 0 5ETR随PAR的变化图即为光响应曲线 叶绿素荧光参数 荧光参数的意义Fv Fm最大光化学效率 PSII Fm Fs Fm PS 实际光化学效率Fv Fm PS 最大天线转化效率P PSII PFD光化学反应速度NPQ Fm Fm 1非光化学猝灭qp Fm F Fm F0 光化学猝灭系数qN Fm F0 Fm F0 非光化学猝灭系数D 1 Fv Fm 吸收光能通过热耗散消耗的部分 Fo 固定荧光 初始荧光 minimalfluorescence 也称基础荧光 0水平荧光 是光系统II PSII 反应中心处于完全开放时的荧光产量 它与叶片叶绿素浓度有关 Fm 最大荧光产量 maximalfluorescence 是PSII反应中心处于完全关闭时的荧光产量 可反映通过PSII的电子传递情况 通常叶片经暗适应20min后测得 F 任意时间实际荧光产量 actualflourescenceatanytime Fs 稳态荧光产量 fluorescenceinstablestate Fm Fo 用来反应PSII的电子传递情况 Fv Fm Fo 为可变荧光 variablefluorescence 反映了QA的还原情况 Fv Fm PSII最大光化学量子产量 optimal maximalphotochemicalefficiencyofPSIIinthedark 或 optimal maximalquantumyieldofPSII 反映PSII反应中心内禀光能转换效率 intrinsicPSIIefficiency 或称最大PSII的光能转换效率 optimal maximalPSIIefficiency 叶暗适应20min后测得 非胁迫条件下该参数的变化极小 不受物种和生长条件的影响 胁迫条件下该参数明显下降 Pv Fm PSII有效光化学量子产量 photochemicalefficiencyofPSIIinthedark 它反映开放的PSII反应中心原初光能捕获效率 叶片不经过暗适应在光下直接测得 Fm F Fm 或 F Fm PSII实际光化学量子产量 actualphotochemicalefficiencyofPSIIinthelight 它反映PSII反应中心在有部分关闭情况下的实际原初光能捕获效率 叶片不经过暗适应在光下直接测得 荧光猝灭分两种 光化学猝灭和非光化学猝灭 光化学猝灭 以光化学猝灭系数代表 qP Fm F Fm Fo 非光化学猝灭 有两种表示方法 NPQ Fm Fm 1或qN 1 Fm Fo Fm Fo 1 Fv Fv 表观光合电子传递速率 Fm F Fm PFD 或 F Fm PFD 0 5 0 84 其中系数0 5是因为一个电子传递需要吸收2个量子 而且光合作用包括两个光系统 而系数0 84表示在入射的光量子中被吸收的占84 PFD是光子通量密度 相应表观热耗散速率以 1 Fv Fm PFD表示 Fmr 可恢复的最大荧光产量 是在荧光P峰和M峰后 当开放的PSII最大荧光产量平稳时 关闭作用光得到Fo 后 把饱和光的闪光间隔期延长到180s 次 得到一组逐渐增大 对数增长 的最大荧光产量 将该组最大荧光产量放在半对数坐标系中即成直线 该直线在Y轴的截距即为Fmr 以 Fm Fmr Fmr可以反映不可逆的非光化学淬灭产率 即发生光抑制的可能程度 Calvin循环可以通过荧光淬灭来分析 热胁对Calvin循环的影响可以通过荧光淬灭反映出来 同时记录荧光诱导曲线与光合放氧 光响应曲线 目前我国对农作物抗逆性包括抗寒性和抗热性的检测和鉴定 基本是靠各地田间多年观察和对比的资科中得出来的 这种田间鉴定方法周期长 工作繁重 而且由于田间栽培和气象条件的经常变化 给鉴定结果带来误差和工作困难 因此在生产和研究上都迫切需要一种能快速 简便和科学地检测和鉴定植物抗逆性包括抗寒性和抗热性的技术 八十年代初以来 人们在逐渐弄清植物体内叶绿素荧光动力学与光合作用关系的基础上 发现它对外界各种胁迫因子均十分敏感 因而有可能将它作为植物理想的各种抗逆性的指标和技术 目前国外有关研究论文越来越多 其中以用荧光动力学鉴定植物抗寒性方面的研究开展得最早 也较为深入 叶绿素荧光动力学的应用 1 在鉴定植物抗寒性和抗热性中的应用 Fv Fo和Fv Fm分别代表PSII的潜在活性和PSII原初光能转化效率 光抑制条件下Fv的降低主要是由于Fm的降低 不是Fo增加的结果 非光化学能量耗散易造成Fo的降低 而光合机构被破坏又使其升高 所以该参数的变化趋势可以反映引起这种变化的内在机制 光化学猝灭反映的是PSII天线色素吸收的光能用于光化学电子传送的份额 要保持高的光化学猝灭就要使PSII反应中心处于 开放 状态 所以光化学猝灭又在一定程度上反映了PSII反应中心的开放程度 光化学猝灭反映了PSII原初电子受体QA的还原状态 它由QA重新氧化形成 光化学猝灭系数qP愈大 QA重新氧化形成QA的量愈大 即PSII的电子传递活性愈大 对小麦的研究表明 水分胁迫使得qP变小 证明从PSII氧化侧向PSII反应中心的电子流动受到抑制 非光化学猝灭反映的是PSII天线色素吸收的光能不能用于光合电子传递而以热的形式耗散掉的光能部分 当PSII反应中心天线色素吸收了过量的光能时 如不能及时地耗散将对光合机构造成失活或破坏 所以非光化学猝灭是一种自我保护机制 对光合机构起一定的保护作用 澳大利亚Smillie等首先将检测植物抗寒性的荧光动力学方法规范化 他们先将待测植物的叶片置于0 下 经不同时间预处理后 仍在0 下快速检测其荧光动力学 发现样品荧光最大上升速率 RF 实际为可变荧光最大上升速率 下降为未经0 处理的对照叶片RF的50 时所需的0 处理时间 C0T0 作为该植物或品种的抗寒性的相对量度 抗寒性的参数 C0T0 可在不同次试验和不问植物之间进行比较 用此方法对黄瓜 玉米 大豆 番石榴 芒果和葡萄等的抗寒性进行了比较 均获满意结果 不足之处是该方法仅局限于对低温敏感和中等抗冷的植物 而对许多能忍受0 以下的抗冻植物则不太适用 随着低温处理时间的延长 最不抗冷的88 9005品种经24小时0 处理后 其M峰最先消失 荧光猝灭也最早趋干0 而最抗冷的84 15品种 则要经72小时0 处理 其M峰才逐渐消失 而其荧光猝灭的完全抑制 则要90小时 说明光合作用暗反应 特别是PSII还原侧的电子流受到抑制 此外 对低温敏感的品种 其P峰和Fv随着低温处理时间的延长而更迅速地减少 这说明其PSII和放氧侧更易受到低温的损伤 除了RF外 叶绿素荧光动力学的其他一些参数 如M峰 P峰 Fv及荧光猝灭等 均可综合作为鉴定植物 品种 抗冷性的指标 水稻抗寒性鉴定 林世青等用调制式荧光计研究和检测几种不同水稻品种的抗冷性与叶绿素荧光动力学的关系 先将被试水稻幼苗放在0 暗中处理不同时间 24 90小时 观察不同品种荧光动力学曲线随低温处巡时间的变化过程 小麦抗寒性鉴定用非调制式荧光计 每隔十天左右 检测和比较六个已知其抗冻性顺序的冬小麦品种在北方自然条件下越冬过程中叶绿素荧光动力学的变化 结果表明 只有经过冬季低温锻炼 不同品种抗冻性的差别才能通过荧光动力学有规律地表现出来 到了第二年春季土壤开始解冻小麦开始返青之时 不同品种之间的荧光动力学曲线表现出最显著的差异 可变荧光猝灭 Fv F 和可变荧光猝灭速率 Fv T 与小麦品种抗冻性之间有极好的相关性 它们均随着品种抗冻性的减弱呈梯度下降 荧光上升曲线互补面积 CA Fo 与抗冻性的相关性也较好 即抗冻性越强 其CA Fo越大 Fv Fo和 Fv T反映光合电子传递及传递速率和光合膜的能态化及能态化速率的总和 而CA Fo反映PSII电子受体库的大小 这三个荧光动力学参数在不同抗冻性小麦品种中呈现出有规律的梯度变化 表明它们是冬小麦在低温冷冻下其光合膜最容易受到损伤和抑制的部位 认为植物经充分低温锻炼后 其 Fv Fo Fv T和CA Fo均可综合作为植物抗冻性的生理指标 林世青等于早春从田间取常绿阔叶树枝条和叶片材料放在控温低温箱中 经一昼夜最低温度为 18 和 22 的两种程序降温预处理 并各在上述两种最低温度下保持5小时 逐渐回到室温 后用荧光动力学方法检测它们叶片和枝条的不可变荧光 Fv 存留情况 作为该树种 器官 存活的指标 结果用荧光动力学所测得的结果 与田间越冬观察结果完全一致 并将此用于胶东卫茅 构骨 女贞 刺桂和蚊母的抗寒性鉴定 Havaux用脉冲调制式荧光计测定了28个品种 变种的甜高粱和苏丹草的抗寒性及其遗传变异 发现可以用经3 处理后叶片稳态荧光qQ猝灭的下降作为鉴定它们抗寒性的指标 qQ猝灭的下降与非循环式光合电子传递速率以及放氧速率的减少直接相关的 抗热性鉴定 采取与检测植物抗寒性相似的方法 将待检测的植株或其枝条 叶片 放在选定的不同高温下预处理 观察其荧光动力学的变化 用调制式荧光计 在仅用一束弱的测量光情况下 连续监测和记录固定荧光 Fo 随样品温度程序梯度上升时所形成的拐点 该拐点是光合膜开始受高温损伤的标志 也是该植物 品种 能够忍受最高温度的临界点 干旱和盐碱对植物产生的胁迫作用有着共同的生理基础 它们均引起植物失水和体内渗透压的增加 从而影响植物代谢和光合作用的正常进行 后者还伴有盐代谢失调等问题 植物水分亏缺会立即对植物光合作用起抑制作用 盐代谢失调迟早也会对光合功能产生不良的影响 体内叶绿素荧光动力学对植物水分亏映和盐碱危害均十分敛感 是一种理想的监测手段 2 在检测植物抗旱性和抗盐性中的应用 林世青等用小麦叶片为材料 经不同程度干燥失水后 用毫秒荧光计测定体内叶绿素荧光动力学的变化 叶片缺水增加 其荧光猝灭 Fv Fm F 迅速减少 说明光合电子传递和膜的能态化逐渐受到缺水的抑制 从D 3曲线开始 Fv就几乎接近于零 荧光猝灭 Fv 是十分灵敛的监测植物缺水的参数 它的变化远出现在植物开始呈现萎蔫之前 随着失水的加剧 叶片可变荧光 Fv 也随着减少 说明PSII的结构与功能受到不同程度的损伤与破坏 Schreiber等用脉冲调制式荧光计测定一种浆果鹃属植物的叶片在不同失水状态下体内叶绿素荧光两个猝灭成分qQ和qE变化的规律 随着叶片含水量的降低 其qQ猝灭与放O2速率几乎同步下降 但qE猝灭在一定失水范围内有所增加 对于植物抗盐性的鉴定 林世青等用不同盐浓度水培的玉米和小麦幼苗为材料 以50 植株的荧光猝灭 Fv趋于零时培养液的盐浓度作为该植物最大耐盐浓度的指标 该指标与品种的致死盐浓度的阀值密切相关 均三氮苯类除草剂 阿特拉津 敌草隆 3 3 4 二氯苯基 l 1 二甲基脲 DCMU 等是国内外常用的一类除草剂 为了扩大它们在不同农作物中使用范围和提高其使用的安全 已成功地将阿特拉津抗性基因从对它具抗性的植物中转导到原来对它敏感的植物上 从而使后者获得了对阿特拉律的抗性 在这项基因转导工作中 我国和外国学者均利用叶绿素荧光动力学技术 作为鉴定植物是否具有抗阿特拉律基因 psbA 的一种简便的 灵敏的和专一的探测手段 DCMU类化合物之所以能够选择性地杀死某些植物 是由于它能专一地 非共价地结合于这些植物叶绿体中的PSII电子受体QB上 从而使光合链中的电子从QA向QB的传递受到抑制 这种抑制作用又大大促进植物在光下的光抑制 从而使植物加速死亡 一些对它不敏感的植物 在它们的与QB结合的D1蛋白质的psbA基因中改变了一个核苷酸 使由此基因合成的D1蛋白质不受DCMU的攻击 因而这些植物就不受这类除草剂的影响 3 在筛选抗除草剂植物遗传工程的应用 这两类对DCMU敏感性不同的植物在喷施DCMU类除草剂之后 其体内叶绿素荧光动力学表现出显著的差异 如经100 mol LDCMU处理后 抗DCMU的龙葵叶片荧光上升曲线明显慢于对DCMU缺感的甘薯叶片的荧光上升曲线 曲线1 因而使龙葵的荧光上升互补面积 CA 曲线1的阴影部分 明显大于甘薯的CA CA代表PSII受体侧电荷库的大小 因而它与DCMU抑制程度呈负相关 根据经DCMU处理之后CA减少的百分比 即可作为鉴定植物是否具有抗DCMU类除草剂基因的专一指标 除了用快速荧光上升互补面积 CA 作为鉴定抗DCMU类除草剂的指标外 还可用慢速调制荧光动力学中的荧光猝灭 Fv 的程度来判断 这是因为对除草剂敏感的植物 由于QA QB的电子传递被抑制 使QA再氧化十分困难 结果荧光猝灭受抑制 荧光强度便始终保持在接近Fm的水平 而抗除草剂的植物 其荧光猝灭正常 在一般正常情况下 其稳态终相 FT 荧光强度将下降到接近Fo的水平 因而两者在稳态终相荧光强度 尤其是在荧光猝灭程度方面 就显出很大的差别 这种以荧光猝灭程度为基础的植物抗除草剂鉴定法对测定仪器的要求较简单 甚至用一般的 慢速的 荧光光度计即可 但是当核物样品稍保管不善也会因受胁迫而引起荧光猝灭不同程度的抑制 因此该方法显然不如CA法那么专一 此外 林世青等用体内叶绿素荧光动力学方法证明了从龙葵中得到的抗阿特拉津psbA基因 不仅可导入原来对除草剂敏感的大豆叶绿体的基因组中获得表达 而且还能将抗阿特拉律psbA基因遗传给后代 Ronger和Graber等建议 用快速荧光动力学上升曲线的缓台阶 I和D相 对Fm的相对高度 来研究除草剂从叶片表面渗入到叶片细胞叶绿体中作用部位的过程 以及研究除草剂在体内去毒分解的过程 这将有助于改进除草剂的分子结构 剂型及组成 贮藏保鲜的实质就是降低植物代谢水平 以延经植物的衰老和抑制果实的后熟过程 在实际工作中 人们常采用低温贮藏和气调技术 林世青等用叶绿素荧光动力学技术 监测香蕉果实在不同温度贮藏下的后熟过程 以广东产的未完全成熟的绿色香蕉为材科 分为四组 分别置于o 6 12和25 温度下 经不同时间 1 13天 贮藏后 用慢速调制式荧光计检测香蕉果皮叶绿素荧光动力学的变化及其与果实外观变化的相关性 0 l天贮藏后 果皮的M峰即消失 此时果皮虽仍为绿色 但已将会出现冷害的征兆 随着在0 下贮藏时间的延长 其F峰也逐渐消失 可变荧光 Fv 也随之下降 到了第10天 果皮变为深褐色 说明冷害已加重 并充分表现出来 其商品价值也因而受到影响 在6 下贮藏的香蕉 其果皮M峰到第10天开始消失 说明它也开始出现冷害 第13天果皮显出褐色 在25 下贮藏的香蕉 M峰第5天开始消失 此时果皮已开始发黄 说明过高的温度促进了后熟和老化 唯有在12 下贮藏的香蕉 经10天贮藏后其果皮仍呈现正常的OPSMT荧光动力学曲线 说明12 是香蕉冷藏保鲜的最适温度 由此可见 叶绿素荧光动力学可以跟踪水果蔬菜 只要仍含有微量叶绿素 在贮藏过程中的生理变化 预测冷害和早衰 以帮助人们选择最佳的贮藏保鲜条件 4 在水果蔬菜贮藏保鲜中的应用 林世青等用叶绿素荧光动力学等方法 研究了SO2对几种园林植物的作用 比较了大叶黄杨 小蘖和五角枫在经过4小时SO2 4和8ppm 通气处理后 它们第2天的叶绿素荧光动力学的变化 经4ppmSO2处理后 这3种园林植物的荧光动力学均发生显著的变化 M峰均已消失 且M峰的下降和消失发生在植物外表出现SO2伤害症状之前 可变荧光对固定荧光的比值 Fv Fo 比各自的对照均明显下降 如大叶黄杨降为67 5 五角枫和小蘖仅分别为对照的25 3 和49 5 说明它们的PSII受到一定程度的损伤 若SO2浓度为8ppm 则五角枫和小蘖的可变荧光 Fv 均完全消失 说明PSII的功能已完全丧失 而此时大叶黄杨还残留一点可变荧光 由此推测 大叶黄杨比前两种有较强的抗SO2的能力 这与用其他方法检测的结果完全一致 5 在监测植物对环境污染反应中的应用 一个作物品种增产潜力的大小归根到底是由它的遗传基因所决定 在完全满足植物生长诸条件时 植物的生物产量和农业产量将主要由生长过程中光合产物的形成和积累乡少所决定 而后者又取决于光合作用的光能转换效率 由于叶绿素荧光动力学可简便地用可变荧光对最大荧光的比值 Fv Fm 检测FSII原初光能转换效率 因而可能成为早期预测作物增产潜力的有效手段 林世青等首次运用此技术对近30个水稻品种进行了苗期荧光动力学检测 结果表明不同水稻品种苗期叶片的Fv Fm和Fv Fo 均与该品种的产量水平成正相关 符合率高达93 因而可考虑作为快速 简便地预测作物增产潜力的一种相对的生理指标 6 在苗期预测作物增产潜力中的应用 产量水平较高的品种 如中系8514 8541 Fv Fm和Fv Fo都较高 产量水平较低的品种 如中系8240 其对应荧光比值也较低 t测验表明 它们之间差异均达到非常显著的程度 迅速了解海洋浮游植物和陆上农林收等植被大面积分布和生长情况 以及各种因子对它们长 短期的影响 目前最理想的方法就是应用飞机或卫星遥感遥测地面 植物 对不同光谱波段的反射强度及其变化 1978年 美国首次发射一颗载有专门遥测海岸地区浮游植物的光谱颜色扫描器的人造卫星 NIMBUS7 其工作原理是 海水中浮游植物的浓度增加 则会使海水的颜色从蓝色变为绿色 然后根据扫描器中蓝色对绿色光谱辐射通道强度比值的变化 就可计算出浮游植物的含量 但是 在海水中特别是在海岸边和海口区的海水中常含有大量的其他悬浮颗粒和有机物 由于它们对光线的放射和吸收作用 也会使海水颜色产生类似的变化 而造成严重的假象和误差 为了克服这个缺点 Neville和Gower首先发现和提出 可将浮游植物体内叶绿素荧光经海水向上散射而在685nm波长附近形成的椭圆形辐射小峰 作为专一遥测海洋浮游植物的指标 Doerffer首先应用该指标 从600nm飞行高度的飞机上 成功地绘出了北海海岸90km长 水深2m以内的浮游植物平面分布图 其遥测结果与地面实测数据极为吻合 r 0 98 7 在遥感遥测海洋和陆地植物中的应用 在陆地上由于植物叶片中叶绿素合量比海水高好几个数量级 使植物荧光强烈被自身再吸收 结果荧光强度反而随着叶绿素含量的增加而下降 Lichtenthaler根据植物对体内叶绿素的两个荧光峰中较短波长F690比对较长波长的F735的荧光吸收更强烈 因而建议用这两个荧光峰的比值 F690 F735 作为专一遥测陆上植物数量的指标 同时 他还根据植物受环境胁迫后总是普遍引起叶绿素合成和积累的下降以及叶绿素含量的降低 从而均减少荧光的自吸收和造成F690 F735比值的增加 提出用F690 F735比值作为植物对环境胁迫反应的指标 Zimmermann和Guenther于1986年首次成功地用以激光为光源的改良式海洋学激光雷达飞机系统首次进行了森林植被的航空遥测 证实了Lichtenthaler提出的体内叶绿素的两个荧光峰比值 F690 F735 可以作为专一遥测森林健康状况的指标 该系统除了对植物具专一性外 与前述被动地以太阳为光源的系统相比 它还具有不受太阳和气候条件的限制 可昼夜工作 以及可减少或避免云雾的干扰 可获得具有较佳的信噪比信号 Liehtenthaler和Bertolini等考虑到常规的毫秒级荧光动力学难以满足遥测中地面快速扫描的要求 提出试用皮秒 10 12秒 级超快荧光计测定体内叶绿素荧光寿命的变化 作为专一遥测植物的另一种可能选择 该方面研究仍处于探索阶段 西德已制成一种新型机载激光雷达遥测系统 它采用准分子激光泵浦的染料激光器作为光源 用装有特殊通道的高斯望远镜作为接收器 整个系统安装在一架多尼尔研究飞机上 据介绍该系统具有以下多种遥测功能 通过遥测海水中叶绿素荧光 可了解浮游植物的含量和分布 通过遥测海水中有机物的荧光 从而获得海洋污染物的分布情况 污染程度和石油泄漏情况等 还可遥测海洋流体动力相互作用和淡 咸水混合过程等 因而是研究海洋生物学 海洋学和检测海水污染的一种新型有力的手段 1植物在发育过程中光合能力不断发生变化 这种变化是由光能吸收转化效率造成的还是由碳同化能力改变造成的 2植物叶片衰老过程中 光合作用光反应过程和碳同化能力都降衰退 哪个过程是限制因素 3如果碳同化能力下降快 必定导致过剩光能增多 光抑制和光破坏的危险增大 如果衰老过程是由叶绿素降解造成的 就会使光合机构捕获的光能也减少 造成过剩光能的可能性降低 此时还能否光抑制和光破坏 4如果衰老到一定程度时 导致PS 和PS 都降解 或是导致电子传递链中的主要成分质体醌和Cytob f复合体丧失 那么光反应产物就会减少 这时植物是否还会产生较多的过剩光能 或许会因为电子不能顺利传递导致激发态的叶绿素直接与溶液中的分子O2作用形成1O2 对植物造成更大的破坏 5 衰老植株对逆境变得更为敏感 是否光能耗散机制也同样变得敏感 如果是这样的话 衰老植株在逆境胁迫下由于过剩光能的增加 以及耗散光能的能力下降 就会导致严重的光破坏 这是否也是逆境胁迫加速衰老的一个原因呢 8 在作物光合功能研究中的应用 叶绿素荧光的新技术 全世界第一台PAM荧光仪 PAM 101 102 103 光合作用胁迫生理学环境污染物对植物的影响浮游植物研究P700测定 研究对象以高等植物为主 兼顾藻类 至今仍是最经典的型号 目前只有它能测定PSI P700 的变化 藻类光合作用污染物检测9 AA荧光NADPH荧光UV吸收物质的测定Pump probe法 第一台高灵敏度荧光仪 Xe PAM 光源为具 全光谱 的氙灯 结合滤光片可以选择性激发藻类荧光 特制的激发 检测单元极大的提高了灵敏度 最畅销的荧光仪 PAM 2000 PAM 2100 野外光合作用生态生理学胁迫生理学环境污染物对植物的影响污染监测 超轻便的设计 强大的功能 简单的操作 使它们成为全世界最受欢迎的荧光仪 其最大优势是在野外有环境光的情况下分析叶片的光合作用 光合作用野外调查生态生理学环境污染物对植物的影响污染监测 最 迷你 的荧光仪 Mini PAM 强大的功能 便宜的价格 使其成为性价比超高的仪器 独特的防水光纤 使其不仅能应用于陆生植物 也可检测水生植物 传授知识的荧光仪 PAM 210 TeachingPAM 终于有了为本科生设计的荧光仪了 您再也不用舍不得拿您昂贵的仪器去教学了 甚至教材都为您编好了 如您有兴趣请参考 叶绿素荧光基础试验指南 当然 它也可以进行科学研究 教学实验 植物生理 光合作用 荧光分析 基础研究可用于针叶植物和藻类 可以潜水的荧光仪 Diving PAM 全防水设计 可在水下50米独立工作 您可以只需在岸 船上点点键盘就行了 当然 如果您喜欢潜水的话 您也可以代替电脑去控制它 水下原位光合作用研究 大型海藻 水生植物 珊瑚 藻垫 附着藻类等 海洋学与湖沼学研究生态生理学 可以分类的荧光仪 Phyto PAM 终于不用为是谁让您无法解释奇怪的水样荧光信号而困扰了 因为它可以帮您找到 元凶 对绿藻 蓝藻和硅藻 甲藻进行定性 定量室内和野外测定水体叶绿素浓度测定光合作用分析 测水样的荧光仪 Water PAM 您想野外现场大规模测定叶绿素浓度吗 只要您校正的好 它就是您的有利帮手 测定水体浮游植物的叶绿素浓度和光合活性海洋学和湖沼学研究藻类学研究 最灵敏的荧光仪 Microscopy PAM 甚至能测单细胞的荧光 还有谁能比过它呢 单细胞或单叶绿体的光合作用测定浮游植物研究保卫细胞研究植物病理学 探头最小的荧光仪 Microfiber PAM 直径只有20微米的光纤 植物病理学研究的有效工具 当然 没有显微操作仪的话 您可能很难控制它 叶片局部光合活性叶片不同组织 表皮组织 栅栏组织 海绵组织 的光合活性 藻垫 的光合活性植物病理学 最 环保 的荧光仪 ToxY PAM 水体中的毒物啊 你们惨了 有了它你们将无所遁形 环境保护 饮用水源 食品工业水源 水质监测水污染生态学毒理学光合作用 会 照相 的荧光仪 Imaging PAM 整体叶片光合作用分析 荧光成像 多个样品 叶片 微藻 同时测定突变柱筛选遗传育种分子生物学 New PenetrationofDCMUintoleafviapetiole PenetrationofDCMUintoleafviapetiole PenetrationofDCMUintoleafviapetiole PenetrationofDCMUi