药敏临床价值.doc

卫生部北京医院 张秀珍细菌耐药性的迅速发展、多重耐药细菌引起的难治性感染已构成高死亡率的重要因素。原因是细菌的天然耐药谱是相对稳定的而获得性耐药谱是多变的，按传统的经验治疗常常失败。文献报道，8 h内采用合理的治疗手段可降低30天的死亡率。用体外药敏试验的结果推测药物在体内的疗效、各临床实验室开展耐药监测，用回顾性的细菌耐药资料总结出常见感染细菌的耐药规律作为初始治疗的参考，以此满足临床治疗的需要。但临床实践的事实证明体外的药敏报告有时并不能达到理想的目的，临床医生和细菌室都为之困扰，因此正确理解药敏试验的临床价值、存在的局限性及合理评价药敏试验的价值十分必要。一药敏试验的临床价值在获得感染部位真正的致病菌和操作规范的前提下，体外药物敏感试验可对抗菌药物的临床疗效进行预测，查出耐药，减少治疗错误，为个体化的治疗提供参考依据；局域性的药敏试验结果的收集统计是临床医生经验治疗循证医学的证据；临床细菌室的病原检测和药敏试验可预测爆发流行的发生，为医院感染控制提供线索。自1976年WHO号召全球各临床细菌室把每天的药敏试验结果输入WHONET的软件经统计分析获得全球和各地区细菌耐药趋势、发现新的耐药机制，为临床医生合理选择抗生素提供依据。在中国，自1994年以来已对区感染、医院感染、ICU等不同病区组织了多个多中心的耐药监测，总结出中国临床常见致病菌耐药规律如：大肠埃希菌对喹诺酮的耐药率达70%或以上；除碳青霉烯类外第4代头孢菌素对阴沟肠杆菌有很好的抗菌活性；含舒巴坦的复方制剂对不动杆菌常常有效；嗜麦芽窄食单孢菌对碳青霉烯类天然耐药，而对复方磺胺、多西环素、舒谱深、氟喹诺酮常常敏感；肺炎链球菌对大环内脂类耐药率达80 %以上；这些规律为患者初始经验用药提供了重要的依据，无疑对临床医生合理应用抗生素、减轻抗生素压力、延长抗生素的使用寿命有重要的意义。二体外药敏试验的局限性医生抱怨细菌室的药敏报告不正确，有时临床有疗效但药敏报告是耐药，可有时临床无效但药敏报告是敏感。现我们对上述现象的产生作如下讨论：（一）CLSI药敏标准制定中的局限性美国临床实验室标准化委员会（CLSI）的药敏标准是以不同药物进入体内后血液中最高浓度与该药物体外最低抑菌浓度（MIC）间的关系所制定。一般情况下，最高血药浓度（Cmx）高于待检菌最低抑菌浓度（MIC）4-8倍为敏感（S）；Cmx/MIC=1-2倍为中介度(I);Cmx/MICMIC，即在两次用药间隔的时间中应有大于50 %时间的血药浓度高于MIC值,才可达到临床疗效；而氨基糖甙类和喹诺酮类属浓度依赖性抗生素，与疗效有关的参数是AUC/MIC，即曲线下面积。当药敏报告为敏感（S），表示用常规剂量治疗可获得临床疗效；药敏报告是中介度（I）表示加大剂量或药物浓缩部位可有疗效；药敏报告耐药（R）表示该药无疗效。但对-内酰胺类的药物只有当剂量达到TMIC大于50 %时临床疗效才可达到85 %以上。目前制定的折点和剂量的关系中某些药物并不能达到折点、剂量和疗效的统一：如头孢噻肟，CLSI的判断MIC标准是8、1632、64，敏感等级分别为S、I和R。研究表明，如果按CLSI判断标准常规用药不能达到TMIC大于50 %的标准,而只有把判断MIC标准修改为1为S、2为I、4为R，剂量为1g/q8h时可达到TMIC大于50 %的标准，才可有临床疗效。其他-内酰胺类的药物如头孢唑肟、头孢曲松、氨曲南等也存在同样的问题。在近年的ECCMID（欧洲微生物和感染疾病年会）有很大呼声要求CLSI改变药物判断标准的折点，有些国家建立自己国家的标准，目的就是达到折点、剂量和疗效的统一。（四）未找到真正的感染菌有菌部位标本如痰、咽试子、前列腺液、粪便、尿液、阴试子等，在培养出细菌时都面临判断该细菌是致病菌或携带菌的问题，而这些标本的采集很难不污染携带菌；无菌部位的标本如血液和脑脊液，如培养出表皮葡萄球菌或类白喉棒状杆菌也有识别的必要。 现代感染的特点是，低免疫人群大大增多，条件致病菌、非致病菌引起的感染增多，这些特点给致病菌的判断带来了困难。可想而知，按不是感染菌的药敏结果去治疗感染菌，是不可能获得一致结果的。三局限性的弥补1.CLSI在收集到各国关于判断标准在临床实践中的反应，经研究后对确实存在的问题作出答复和修正，大约需要13年的时间。NCCLS 2000年的版本公布：由于临床实践证明许多口服抗生素对中度耐青霉素的肺炎球菌是有效的，将它们对肺炎球菌的折点值升高了。如对头孢克罗由1999年的0.5为敏感改为1为敏感，其他中介和耐药依次类推折点升高一级。同时对阿莫西林/棒酸和头孢呋肟脂作了同样的调整；2.CLSI的文件中有很多脚注，这些内容包括对不同抗菌药物存在的交叉耐药或协同耐药，并要求实验室体现在药敏报告中；由于耐药机制而导致的耐药谱，如当报告MRSA药敏时，应报告全部-内酰胺类药物为耐药，这些内容有助于体外药敏结果接近体内疗效；3.制定新的PK/PD折点，统一折点、剂量及临床疗效之间的关系：如头孢吡肟要保持CLSI制定的标准（8/16/32）同时要保证临床疗效TMIC要50 %的前提下，必须修改剂量由1g/Q8h改变为2g/Q12h。如不改变剂量，应修订折点为（4/8/16），才能使临床疗效在85 %以上。而头孢他定应用时,如果仍以CLSI的折点（8/16/32）,就必须按2 g/Q8h的治疗剂量，而采用常规剂量1 g/Q8h，就必须修正折点为（4/8/16），才能使PK/PD参数TMIC大于50 %，才能使临床达到应有的疗效。上述例子表明MIC和用药剂量是决定临床疗效的一对参数，因此，我们在临床实践中不断总结，对折点和临床疗效严重不能统一的标准要提议CLSI作出修正。临床实验室要规范地操作药敏试验，报告含MIC的药敏结果。（一）认真识别感染菌报告真正感染菌的药敏结果是获得药敏结果与临床疗效统一的第一步。由于标本污染携带菌不可避免，要让实验室正确判断感染菌还不够，必须由临床医生参与，根据患者临床症状判断培养出的细菌是感染菌或携带菌是十分重要的。细菌实验室应密切与临床沟通协助临床共同判断检出细菌的临床价值。（二）实验室必须规范操作由体外药敏报告来推测体内的疗效存在很多不可克服的因素而造成两者结果的不统一，如果操作不规范造成的差异就更大。因此实验室应建立药敏试验的标准程序（SOP），包括药敏纸片的保存条件、药敏试验的室内质量控制的频率、培养基的钙镁离子浓度、培养基的厚度和培养环境等。对于CLSI还没有制定判断标准的药物应报告MIC结果。对于厌氧细菌应采用CLSI指定的特殊培养基做药敏试验。(三)真菌药敏报告的临床价值临床疗效永远是金标准，当药敏报告结果与临床效果不一致时，应以临床疗效为标准，决定继续治疗或改变方案。CLSI分别在1997年发表了对酵母样真菌的药敏试验方案M27-A，在2002年又公布了产孢丝状菌的药敏试验方案M38-A。对酵母样菌的药敏报告，文献报告，药敏试验提示敏感的念珠菌90 %治疗有效，但药敏试验提示耐药者仍有60 %对治疗反应良好。这是因为用于治疗念珠菌感染的常用药物氟康唑是浓度依赖性抗真菌药，决定其疗效的指标是曲线下面积（AUC）/MIC；伊曲康唑对念珠菌的体外药敏判断标准按M27-A是MIC0.125 mg/L为敏感,0.25-0.5 mg/L为SDD，1 mg/L为耐药。但伊曲康唑在多种组织浓度高于血药浓度，如在脂肪中的浓度是血液的17倍、皮肤的浓度是血液的10.4倍、骨骼的浓度是血液的4.6倍、肝脏浓度是血液的3.6倍、肺部的浓度是血液的2.4倍。伊曲康唑代谢产物羟基伊曲康唑有同样的抗真菌活性。这些原因使伊曲康唑的药敏结果常与疗效有差异；两性霉素B的抗真菌谱可覆盖酵母样真菌、曲菌和毛霉菌，CLSI认为当MIC2 mg/L时应报告耐药。但对念珠菌通常认为MIC0.25即代表是耐药菌株。两性霉素B对土曲菌、枝顶孢霉、尖端赛多孢霉和足分支霉都是耐药的；5-氟孢嘧啶治疗念珠菌主张联合用药，单独用药很快产生耐药性，CLSI推荐的判断标准也是对准联合治疗的；新型抗真菌药物伏立康唑参照M27-A的方法作酵母样菌的药敏试验，与临床有较好的相关性，结果可靠，重复性好。但卡泊芬净用M27-A方案测定酵母样菌药敏试验和用M38-A方法做产孢丝状真菌药敏试验实验结果与临床疗效严重不相符。参考文献1 Meehan et aL.JAMA 1997;278:2080-20842 张秀珍,宣天芝,陶凤蓉.1993-1998年临床分离多重耐药菌监测分析.首都医药,1999;61:27-29.3 Nccls Document M100-S14.Performance standards for Antimicrobial Susceptibility Test;Fourteenth informational supplement.2004, 24(1):85-87.4 汪复,张婴元.主编.实用抗感染治疗学.北京,人民卫生出版社,P141-335.5 王睿.临床药理学角度谈抗菌药物优化治疗.第二届全国细菌耐药监测与临床专题学术会议汇编.p8-12.6 Kartsonis N,Killar J,Mixson L, et al.Caspofungin susceptibility testing of isolates from patients with esophageal candidasis or invasive ndidasis:relationship of MIC to treatment outcome.Antimicrob Agents Chemother, 2005,49:3616-3623.细菌耐药机制与耐药基因检测技术1细菌耐药机制的现代概念全球性的细菌抗生素耐药是近年来感染性疾病治疗所面临的一大难题12，细菌可对某类抗菌药物产生耐药性，也可同时对多种化学结构各异的抗菌药物耐药。随着各种新型抗生素在临床的应用，细菌的耐药也越来越广。本文对细菌耐药机制及自动化仪器检测耐药机理等方面的新进展作简要综述。 一、耐药性的分类：细菌耐药性可分为：（1）天然或突变产生的耐药，即染色体遗传基因介导的耐药。属于此种耐药性者如肺炎克雷伯菌和催产克雷伯菌可产生由染色体介导的青霉素酶，因而对氨苄西林和羧苄西林耐药等。（2）质粒介导的耐药性，即细菌因获得了由质粒、噬菌体或其他外来DNA片段，所致的细菌耐药，其所带的耐药基因易于传播，在临床上占有重要地位。二、细菌的耐药机制：（一）内酰胺类药物耐药针对内酰胺类抗生素的耐药机制主要有：产生内酰胺酶；青霉素结合蛋白（PBP）的作用位点改变或产生新的对内酰胺类抗生素不敏感的PBP；革兰阴性细菌外膜通透性降低和主动外排系统将抗生素泵出胞外。PBPs改变是革兰氏阳性菌耐内酰胺类抗生素的最主要机制，内酰胺酶是革兰氏阴性杆菌耐内酰胺类抗生素的最普遍的机制。（二）内酰胺酶介导的细菌耐药内酰胺酶早在内酰胺类抗生素应用于临床前便已发现，它并不是细菌生长所必需的，因为它的唯一功能是水解内酰胺。革兰阳性菌的内酰胺酶分泌到细胞外，而革兰阴性菌的内酰胺分泌到胞周间隙3。最近Bush更新的版本，结合酶的分子结构、抑制特性及水解底物特征来进行分类。见下表（1）内酰胺的作用机制：内酰胺是结构类似于细胞壁前体肽聚糖肽酰D丙氨酰基D丙氨酸未端的类似体，能与PBPs和内酰胺酶互相反应，内酰胺结合物，PBPs和内酰胺酶经过连续的酰化作用和脱酰基作用反应，内酰胺环发生亲核攻击使环打开，并形成通过脂键相连的乙酰酶中间体；通常PBP和内酰胺酶的主要区别在于酰基化的速率不同，这主要是因为它们对水分子的依赖性不同。对内酰胺酶来说，水分子是有效的亲核攻击分子，它能迅速水解乙酰酶中间体的脂键使酶再生，并释放内酰胺部分，细菌产生耐药性。而对PBP来说，乙酰酶中间体对水分子的亲和攻击不敏感，因而乙酰酶中间体不能被水解或水解的速率很慢，从而使PBP失活。（2）革兰阳性菌内酰胺酶介导的细菌耐药：在青霉素G应用于临床不久，内酰胺酶便在葡萄球菌中广泛分布。目前90以上的金黄色葡萄球菌中的内酰胺酶属于Bush分类的2a组。与革兰阴性菌内酰胺酶不同，尽管面临着对内酰胺酶稳定的抗生素的选择性压力，几十年来金黄色葡萄球菌中的产内酰胺酶、对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌仍然对半合成青霉素（如苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林等）、头孢菌素及碳青酶烯类抗生素敏感。金黄色葡萄球菌内酰胺酶的产生通常是可诱导的，共涉及至三个基因：bla、blaR1和blaR2。bla编码一种抑制因子，对内酰胺酶结构基因blaZ的转录进行负调节；blaR1编码的蛋白BlaR1包括一个细胞外的区域用来感受内酰胺类药物，一个细胞内区域负责产生一种信号导致blaZ的去抑制；blaR2基因下调内酰胺酶的表达，其机制不明。（3）革兰阴性菌内酰胺酶介导的细菌耐药：尽管革兰阴性菌种发现了多种酶，TEM1和SHV1分别是大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中最主要和最多见的酶。这些分布广泛的酶属于Bush分类2b组，由质粒介导，通过接合、转化和转导等形式使耐药基因在细菌中扩散，可有效地水解青霉素和窄谱头孢菌素酶，但不能水解广谱的氧亚胺头孢菌素、头霉素和碳青酶烯类抗生素，即使这些酶过度表达也不能介导细菌对上述抗生素的耐药，但可导致细菌对酶抑制剂的耐药。20世纪80年代初，随着三代头孢菌素的临床应用，多年来一直稳定的TEM1和SHV1酶突然加快了突变的步伐，短短几年由于这两种酶的某些位点的突变而形成的各种超广谱内酰胺酶在世界各地不断被发现；这些酶介导的细菌对青霉素和一、二、三代头孢菌素以及单环菌素耐药，但对头霉素、碳青酶烯及酶抑制剂敏感，属于Bush分类2b组。从ESBL的分子结构看，其活性作用位点丝氨酸70位于由四段氨基酸保守序列围成的催化腔底部，内酰胺类抗生素只有进入催化腔的底部才能被酶水解。ESBL的突变位点一般位于上述保守序列的周围，目前已发现的几十种ESBL其突变位点主要集中在TEM104、164、238、240位点和SHV179、238、240位点，其中164、179、238位点中任一点的突变都将导致催化腔体积的增大，使分子结构较大的三代头孢菌素能够进入；在此基础上104、240等位点的突变将酶对三代头孢菌素的亲和力增强，从而进一步提高其水解效率。另外突变的位点不同其水解效率也不同，如238位点的突变主要促进酶对头孢噻肟的水解，而240、104等位点的突变主要促进酶对头孢他啶的水解，所以抗生素的使用情况不同，ESBL的类型在不同国家和地区是不同的。XTXM系列ESBL是近年来在世界各地被发现的非TEM和非SHV起源的ESBL，包括CTXM110、Toho1和Toho2，它们的主要特征是对头孢噻肟水解力强，而对头孢他啶水解力弱，因此体外药敏试验中产生此酶的菌株常对头孢噻肟耐药而对头孢他啶较敏感。三代头孢菌素的广泛使用引起细菌产生多种新的内酰胺酶，其中以超广谱内酰胺酶最具重要意义，主要由肠杆菌科细菌，尤其大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产生；大多由编码TEM1基因和SHV1基因突变而形成；多数可为内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸，三唑巴坦及舒巴坦）所抑制。它可以水解青霉素类、一代、二代、三代头孢菌素和氨曲南，导致细菌对第一代、第三代头孢菌素、替卡西林、哌拉西林和氨曲南耐药，有趣的是，这些酶大多数可被棒酸及舒巴坦抑制，克雷伯菌例外，头霉菌素和碳青霉烯不受影响31314。由于其可传播性和对三代头孢菌素表现敏感而引起误导治疗问题，被认为是革兰氏阴性杆菌中最危险的耐药形式15，且它的产生使治疗更加困难，抗菌药物的选择范围更窄，目前多选用亚胺培南治疗，ESBL阳性的革兰阴性杆菌应在报告注明，提示医生勿用内酰胺类药物。ESBL主要在肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中出现，然后又在假单胞菌、不动杆菌、流感嗜血杆菌和奈瑟菌中发现131617。当怀疑产ESBL或经验用药治疗失败时，应考虑ESBL产生，避免使用除头霉菌素、卡巴培能以外的其它头孢菌素18。AmpC酶的耐药机制：AmpC酶是由染色体介导的内酰胺酶，属于Bush分类1组（C类），在自然状态下细菌产生此种酶的量很少，但某些细菌如阴沟肠杆菌、弗氏枸橼酸杆菌等在内酰胺类抗生素（尤其是头孢西叮、亚胺配能和克拉维酸）的作用下可大量诱导AmpC酶的产生，而且其调控基因的突变率很高，突变后将使酶持续大量产生，导致细菌对除碳青酶烯类之外的所有内酰胺类抗生素耐药。AmpC酶的诱导机制很复杂，共涉及四个连续基因，即ampC、ampR、ampD和ampG，并与细菌细胞壁肽聚糖的循环合成有关。近年来此耐药基因已开始向质粒扩散，给临床带来更严峻的挑战。近年也有少数质粒介导的AmpC酶在不同国家被发现。AmpC酶属于Class C类酶3又称头孢菌素酶，它是Bush1类内酰胺酶的典型代表，能水解青霉素类，一代、二代和三代头孢菌素类和单环类，不被克拉维酸抑制，体外试验尚能诱导细菌产AmpC酶19，舒巴坦和他唑巴坦的抑制效果非常有限20，但硼酸类化合物和氯唑西林体外有较好的抑制作用。AmpC酶可分为诱导型，去阻遏持续高产型和质粒型。绝大多数革兰阴性杆菌都具有产生AmpC酶的能力，通常情况产酶量很少，在临床上并不形成耐药，但一旦细菌阻遏AmpC酶产生的基因发生突变，细菌就可持续高产AmpC酶，出现对绝大多数内酰胺抗生素的耐药。此外还应注意到在传统认为只产AmpC酶的肠杆菌属细菌中，ESBL可能并不少见，细菌一旦同时具有高产AmpC酶及产ESBL的能力，其耐药性将极其严重。诱导型AmpC酶：当细菌未接触有诱导力的内酰胺类抗生素时，染色体的ampC基因被基因阻遏子抑制，产酶处于基线水平。当使用有诱导力的抗生素治疗时，产生了暂时的去阻遏现象。AmpC基因自由表达，使得细菌暂时产生过量的内酰胺酶。一旦去除抗生素，大多数情况下产酶水平水逐渐恢复到基线水平。临床应用内酰胺类抗生素阻断了细菌细胞壁五肽交朕桥连接，引起肽聚糖合成紊乱，产生大量肽聚糖片断，当革兰阴性菌周质间隙或胞浆中肽聚糖片段的量超过AmpD蛋白循环利用能力时，感受器或跨膜转运系统AmpG蛋白可传递或摄取肽聚肽聚糖片段的刺激信号，使AmpR蛋白形成激活子，激活ampC基因转录及ampR基因自我转录，诱导细菌产生AmpC酶。大肠埃希菌的AmpC酶低水平表达，它缺少ampR基因而不能诱导产酶21。去阻遏持续高产AmpC酶：在产诱导型AmpC酶的革兰阴性菌中，可发生较高频率的调节基因自发突变，调节基因的作用受到抑制22，AmpD调节基因突变产生有缺陷的AmpD蛋白，使菌株去阻遏持续高产AmpC酶，亦可产生高诱导型或温度敏感型AmpC酶23。质粒型AmpC酶：20世纪80年代以前，AmpC酶多数报道为染色体型，20世纪80年代后有许多文献证实大量使用三代头孢菌素与AmpC酶的产生有密切关系。质粒型AmpC酶的出现与头霉菌素（如头孢西丁和头孢替坦），加内酰胺酶抑制剂复合抗生素使用量增多产生的选择压力有一定的关系，从分子大小、结构、等电点、生化特性等非常类似于染色体酶，这种酶较超广谱内酰胺酶有更广泛的耐药谱，又不能酶抑制剂类破坏24、25。1988年，Papanicolaou等首次在肺炎