20-高效液相色谱.ppt

1 高效液相色谱法HighPerformanceliquidChromatography HPLC 2 20 1概述 高效液相色谱法 HPLC 在经典液相色谱的基础上 引入了气相色谱法的理论和实验方法 采用了高压泵 高效固定相和高灵敏度检测器 发展而成的一种现代液相色谱分析方法 一 HPLC与GC差别二 特点 3 一 HPLC与GC差别 相同 兼具分离和分析功能 均可以在线检测主要差别 分析对象的差别和流动相的差别 1 分析对象GC 能气化 热稳定性好 且沸点较低的样品 高沸点 挥发性差 热稳定性差 离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20 HPLC 溶解后能制成溶液的样品 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大 难气化 热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛占有机物的80 4 GC 流动相为惰性气体流动相与组分无亲合作用力 仅起运载作用 组分只与固定相作用HPLC 流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力 为提高柱的选择性 改善分离度增加了因素 对分离起很大作用流动相种类较多 选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性 2 流动相差别 5 二 HPLC的特点 适用范围广 可分析80 有机化合物 广泛应用于各种药物及其制剂的分析测定 分离性能好 分析速度快 流动相可选择性范围宽 灵敏度高 色谱柱可反复使用 与经典色谱相比 流出组分容易收集 安全 6 20 2HPLC的分类和基本原理 20 2 1HPLC的分类 1 按固定相的聚集状态分 液 液色谱法 LLC 和液 固色谱法 LSC 2 按分离机制分 分配色谱吸附色谱离子交换色谱分子排阻色谱化学键合相色谱亲合色谱手性色谱 7 20 2 1基本原理 塔板理论速率理论 在高效液相色谱中 液体的扩散系数仅为气体的万分之一 则速率方程中的分子扩散项B u较小 可以忽略不计 即 H A B u Cu H A Cu故液相色谱H u曲线与气相色谱的形状不同 如图所示 经典液相色谱法 气相色谱法 液体的粘度比气体大一百倍 密度为气体的一千倍 故降低传质阻抗是提高柱效主要途径 8 采用小粒度 窄分布的球形固定相 均匀装柱 A 采用低黏度流动相 低流速 C u 液相色谱中 不可能通过增加柱温来改善传质 一般恒温操作 H A Cu 由VanDeemter方程式可以获得HPLC分离条件 9 20 3各类高效液相色谱法 20 3 2液 液分配色谱法 根据流动相与固定相极性的差别 可将液 液色谱分为 极性小的先流出 适于极性组分分离 正相液 液色谱流动相极性 固定相极性 反相液 液色谱流动相极性 固定相极性 极性大的先流出 适于弱极性组分分离 例如 含水硅胶为固定相 烷烃为流动相 10 20 3 3化学键合相色谱法 固定相 早期涂渍固定液 固定液流失 较少采用 化学键合固定相 将固定液的官能团通过化学反应键合到硅胶表面上 而构成化学键合相 1 反相键合相色谱法 RBPC或RHPLC 采用非极性或极性较小的键合固定相和极性流动相组成的色谱体系 固定相 常用十八烷基硅烷键合相 ODS或C18 流动相 常用甲醇 水或乙腈 水 11 适用 非极性 中等极性组分应用最广 可解决80 的HPLC问题 流动相的极性与容量因子的关系 流动相极性 洗脱能力 k 组分tR 出柱顺序 极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱 12 2 正相键合相色谱法 1 固定相 极性大的氰基或氨基键合相 2 流动相 而以非极性或极性小的溶剂 如烃类 中加入适量的极性溶剂 如氯仿 醇等 为流动相 例 正己烷 氯仿 甲醇 氯仿 乙醇 3 分离极性化合物 极性强的组分后洗脱出柱 4 流动相极性 洗脱能力 组分tR k 以极性的有机基团 如氰基 CN 氨基 NH2 或双羟基等键合在载体表面 作为固定相 13 待测物极性 A B C 正 反相色谱中极性和保留时间的关系 14 B H BH RSO3Na RSO3 Na BH RSO3 BH RSO3 3 反相离子对色谱 RPIC 1 分离机理 以分析碱类物质B为例 流动相 固定相 PICB 中性离子对 15 2 常用离子对试剂 烷基磺酸钠 分析碱 正电荷 四丁基季铵盐 分析酸 负电荷 a 与流动相的极性有关 同反相色谱 b 与R的链长有关 R 长 极性 k tR 3 影响k的因素 4 适用 有机酸 碱 盐 离子型和非离子型化合物的混合物 在药物分析中应用很广 16 4 离子抑制色谱 ISC 在反相色谱法中 通过调节流动相的pH 抑制样品组分的解离 增加它在固定相中的溶解度 以达到分离有机弱酸 弱碱的目的 称为离子抑制色谱法 ISC 1 适用范围 弱酸3 0 pKa 7 0弱碱7 0 pKa 8 0 2 抑制剂 弱酸 乙酸 弱碱 氨水 或缓冲盐 3 影响k的因素 a 与流动相的极性有关 同反相色谱 b 与流动相pH有关 弱酸pH pKak tR 弱碱反之 17 其分离原理与离子交换色谱原理一样 电导检测器检测 问题 由于流动相都是强电解质 其电导率比待测离子约高2个数量级 这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号 5 离子色谱 1975年Small提出 在离子交换柱之后 再串结一根抑制柱 该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂 通过分离柱后的样品再经过抑制柱 使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相 从而可用电导检测器检测各种离子的含量 18 例 分析阴离子时 以NaOH为流动相 抑制柱为高容量的强酸性阳离子交换树脂 则发生下列反应 分离柱 交换反应 R OH NaX R X NaOH洗脱反应 R X NaOH R OH NaX抑制柱 与组分反应 R H NaX R Na HX与洗脱液反应 R H NaOH R Na H2O 19 原理 利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力 进行选择性分离 先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂 环氧 联胺等 再连接上配基 酶 抗原等 这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留 改变淋洗液后洗脱 6 亲合色谱 20 7 手性色谱 原理 对映异构体与手性选择物形成瞬间非对映立体异构 配合物 由于两对映异构体形成的 配合物 的稳定性不同 因而得到分离 21 20 4固定相 20 4 1液 固色谱固定相 大多具有吸附活性的吸附剂 常用的有硅胶 氧化铝以及高分子多孔微球 1 硅胶 无定形全多孔硅胶 球形全多孔硅胶 堆积硅珠 2 高分子多孔微球 由苯乙烯与二乙烯苯交联而成 22 化学键合固定相 目前应用最广 性能最佳的固定相 一般的键合相用硅胶为载体 a 硅氧碳键型 Si O Cb 硅氧硅碳键型 Si O Si C ODS 20 4 2化学键合相 1 非极性键合相键合相表面基团为非极性烃基 如C18 C8 C1和苯基等 一般用于反相色谱 23 1 载体性质 多数产品采用全多孔YWG YQG或堆积硅珠作载体 YQG C18H37 5 m YWG C6H5 10 m NucieosilC18 Zorbax ODS 2 表面覆盖度 参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例覆盖度的大小 决定是分配还是吸附作用占主导 3 键合基团的链长 链长 极性 载样量 k值 24 时间 min 固定相 C1 固定相 C8 固定相 C18 硅胶 烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1 尿嘧啶 2 苯酚 3 乙酰苯 4 硝基苯 5 苯甲酸甲酯 6 甲苯 可见 反相键合色谱中 键合相碳链越长 分离效果越好 25 常见的有醚基和二羟基键合相 此类固定相应用较少 2 中等极性键合相 3 极性键合相 常用极性键合相为氨基键合相 强极性 氰基 中强极性 键合相 一般用于正相色谱 26 流动相又称为 淋洗液 洗脱剂 流动相组成改变 极性改变 可显著改变组分分离状况 不与固定相发生化学反应 对试样有适宜的溶解度 k 2 5 纯度要高 粘度要小 必须与检测器相适应 20 5流动相 溶剂系统 流动相的基本要求 27 20 5 1分离方程式 主要受溶剂种类的影响k主要由溶剂的配比所决定 28 20 5 2Snyder溶剂分类 Snyder选了三个参考物质 用于检验溶剂的三种分子间作用力 分别用Xe Xd及Xn表述 将81种色谱常用溶剂 按Xe Xd及Xn在三角形坐标图上的相邻关系分为八类 组 29 表中的P 代表在正相色谱与硅胶吸附色谱法中溶剂的极性 P 大 洗脱能力大 Xe Xd与Xn为三种作用力的相对值 三者之和为1 其数值的大小 表示作用力的强弱 30 质子给予体 偶极相互作用 质子接受体 溶剂选择性分类三角形图 Xe Xd Xn 1 2 3 4 5 6 7 8 纯质子接受体 强偶极中性化合物 纯质子给予体 31 1组 脂肪醚 纯质子接受体 2组 脂肪醇 质子接受 给予体 3组 吡啶衍生物 四氢呋喃 质子接受体 易极化 4组 乙二醇 苄醇 乙酸 甲酰胺 质子给予体 5组 二氯甲烷 二氯乙烷 大偶极距 6组 脂肪酮 酯 二氧六环 腈7组 芳烃 芳醚 硝基化合物8组 氟代醇 氯仿 水 质子给予体 32 流动相类别 按流动相组成分 单组分和多组分 按极性分 极性 弱极性 非极性 按使用方式分 等度洗脱和梯度洗脱 常用溶剂 己烷 四氯化碳 甲苯 乙酸乙酯 乙醇 乙腈 甲醇 水 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性 以改进分离或调整出峰时间 33 3 流动相选择 采用正相液 液分配分离时 首先选择中等极性溶剂 若组分的保留时间太短 降低溶剂极性 反之增加 也可在低极性溶剂中 逐渐增加其中的极性溶剂 使保留时间缩短 在选择溶剂时 溶剂的极性是选择的重要依据 正相色谱 溶剂极性越强 洗脱能力越强反相色谱 极性弱的溶剂洗脱能力强 34 选择流动相时应注意的几个问题 1 尽量使用高纯度试剂作流动相 防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加 2 使用前需要用微孔滤膜过滤 除去固体颗粒 3 流动相使用前最好脱气 35 20 6高效液相色谱仪 36 输液系统 进样系统 色谱柱系统 检测系统 温控系统 记录系统 液相色谱法的一般流程简略图 37 1 柱塞往复泵无脉动流量恒定能自由调节流量耐高压耐腐蚀等特性 20 6 1输液泵 38 2 梯度洗脱装置 高压二元梯度 利用两台高压输液泵 将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室 混合后进入色谱柱 低压梯度 在常压下 通过比例调节阀 将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合 39 20 6 2进样器与色谱柱 1 进样器 流路中为高压力工作状态 通常使用耐高压的六通阀进样装置 40 2 色谱柱 柱体为直型不锈钢管 内径2 4 6mm 柱长10 25cm 3 色谱柱柱效的评价 药典规定 用HPLC建立分析方法时 需进行 系统适用性试验 最小理论塔板数 分离度 重复性和拖尾因子 41 20 6 3液相色谱检测器 特点 灵敏度高 噪音低 不破坏样品 对流动相的流速和温度波动不敏感 可用于梯度洗脱属于浓度型检测器 1 紫外检测器 应用最广 对大部分有机化合物有响应 42 紫外检测器的弱点 只能检测有紫外吸收的样品流动相的选择有一定的限制 检测波长须大于流动相的截止波长 截止波长 紫外检测器的类型 用1cm光径的吸收池装待测溶剂 用空气作参比 改变照射波长 当吸光值A 1时 此时的波长称为该溶剂的截止波长 固定波长 可变波长 光电二极管阵列 43 3 光电二极管阵列检测器 DAD 紫外检测器的重要进展 光电二极管阵列检测器 1024个二极管阵列 各检测特定波长 计算机快速处理 三维立体谱图 如图所示 44 45 光电二极管阵列检测器 46 2 荧光检测器 FD 高灵敏度 高选择性 只适用于产生荧光或其衍生物能发荧光的物质对氨基酸 多环芳烃 维生素 甾体化合物及酶类等有响应常用于体内药物分析 47 3 蒸发光散射检测器 ELSD 48 2 安培检测器 电化学检测器之一 利用组分的氧化反应产生的电流变化 而进行检测 凡有氧化还原活性的物质都能检测 4 其他检测器 1 化学发光检测器 待测物 发光试剂 激发态的产物 基态 发射光子 3 示差折光检测器 49 20 8HPLC的应用 1 环境中有机氯农药残留量分析 可对水果 蔬菜中的农药残留量进行分析 固定相 薄壳型硅胶 37 50 m 流动相 正己烷流速 1 5mL min色谱柱 50cm 2 5mm 内径 检测器 差示折光检测器 50 2 稠环芳烃的分析 稠环芳烃多为致癌物质 固定相 十八烷基硅烷化键合相流动相 20 甲醇 水 100 甲醇线性梯度淋洗 2 min流速 1mL min柱温 50 C柱压 70 104Pa检测器 紫外检测器 51 色谱习题 假如一个溶质的分配比为0 2 则它在色谱柱的流动相中的百分率是多少 k Ws Wm 0 2 Wm 5WsWm W 100 Wm Wm Ws 100 83 3 对某一组分来说 在一定的柱长下 色谱峰的宽或窄主要决定于组分在色谱柱中的A 保留值B 扩散速度C 分配比D 理论塔板数B 扩散速度色谱峰的宽窄主要与色谱动力学因素有关 载体填充的均匀程度主要影响A 涡流扩散相B 分子扩散C 气相传质阻力D 液相传质阻力A 涡流扩散相范氏方程中涡流扩散相A 2 dp 为填充不规则因子 5 下列哪些参数改变会引起相对保留值的增加 为什么 A柱长增加B相比率增加C降低柱温D流动相速度降低降低柱温会引起相对保留值的增加 因为相对保留值的特点是只与柱温及固定相种类有关 与其他条件无关 6若在1m长的色谱柱上测得分离度为0 68 要使它完全分离 则柱长至少应为多少米 L2 R2 R1 2L1完全分离R2 1 5L2 1 5 0 68 2 1 4 87 m 7 在2m长的色谱柱上 测得某组分保留时间 tR 6 6min 峰底宽 Y 0 5min 死时间 tm 1 2min 柱出口用皂膜流量计测得载气体积流速 Fc 40ml min 固定相 Vs 2 1mL 求 提示 流动相体积 即为死体积 1 分配容量k 2 死体积Vm 3 调整保留时间 4 分配系数K 5 有效塔板数neff 6 有效塔板高度Heff 1 分配比k tR tm 6 6 1 2 1 2 4 5 2 死体积Vm tm Fc 1 2 40 48mL 3 调整保留时间VR tR tm 5 4min 4 分配系数K k k Vm Vs 4 5 48 2 1 103 4 有效塔板数neff 16 tR Y 2 16 6 6 1 2 2 1866 5 有效塔板高度Heff L neff 2 1000 1866 1 07mm 8 已知组分A和B的分配系数分别为8 8和10 当它们通过相比 90的填充柱时 能否达到基本分离 提示 基本分离Rs 1 答 KB KA 10 8 8 1 14k KB 10 90 0 11由基本分离方程式可推导出使两组分达到某一分离度时 所需的理论塔板数为nB 16Rs2 1 2 1 kB kB 2 16 12 1 14 1 14 1 2 1 0 11 0 11 2 16 66 31 101 83 1 08 105因为计算出的n比较大 一般填充柱不能达到 在上述条件下 A B不能分离 11 用热导池检测器时 为什么常用H2和He作载气而不常用氮气作载气 答 根据热导池检测器的检测原理 载气与待测组分的导热系数相差愈大 则灵敏度愈高 一般组分的导热系数都比较小 而氢气 氦气导热系数最大 故选用热导系数大的H2和He作载气 灵敏度比较高 另外载气热导系数大 在相同的桥电路电流下 热丝温度较低 桥电流可以升高 如果用氮气作载气 除了由于氮和被测组分导热系数差别小使热导池检测灵敏度低以外 还常常由于二元体系导热系数呈非线性等原因 有时会出现不正常的色谱峰如倒峰 峰等 13 在气液色谱中 色谱柱的使用上限温度取决于 A 样品中沸点最高组分的沸点B 样品中各组分沸点的平均值C固定液的沸点D 固定液的最高使用温度D固定液的最高使用温度 色谱柱的上限温度如果超过固定液的最高使用温度就会出现固定液流失 污染检测器 使基线不稳而无法工作 14 在某色谱柱上 柱温1000 C测的甲烷的保留时间为40s 正壬烷的保留时间为400s 正癸烷的保留时间为580s 正壬烷与正癸烷的峰宽相同 均等于5 0mm 已知记录纸速为5mm min 求能与正壬烷达到基线分离 R 1 5 的组分的保留指数应为多少 答 根据题意要求的组分在正壬烷后出峰 Y9 Y10 Y9 Yi 5mm 5mm min 60s R 2 t Ri t R9 Y9 Yi t Ri t R9 Y9 t Ri RY9 t R9 1 5 60 400 40 450sIi 100 9 lgt Ri lgt R9 lgt R 9 1 lgt R9 100 9 lg450 lg360 lg540 lg360 952 3 工作条件的选择 1 柱长的选择固然增加柱长可使理论塔板数增大 但同时使峰宽加大 分析时间延长 因此 填充柱的柱长要选择适当 过长的柱子 总分离效能也不一定高 一般情况下 柱长选择以使组分能完全分离 分离度达到所期望的值为准 具体方法是选择一根极性适宜 任意长度的色谱柱 测定两组分的分离度 然后根据基本色谱分离方程式 确定柱长是否适宜 2 载气及其流速的选择当载气线速度较小时 宜选择相对分子量较大的载气 当载气线速度较大时 宜选择相对分子量较小的载气 载气的选择还要考虑与检测器相适应 3 柱温的选择柱温是一个重要的操作参数 直接影响分离效能和分析速度 在使最难分离的组分有尽可能好的分离前提下 采取适当低的柱温 但以保留时间适宜 峰形不拖尾为度 具体操作条件的选择应根据实际情况而定 另外 柱温的选择还应考虑固定液的使用温度 柱温不能高于固定液的最高使用温度 否则固定派挥发流失 对分离不利 4 载体粒度及筛分范围的选择载体的粒度愈小 填装愈均匀 柱效就愈高 但粒度也不能太小 否则 阻力压也急剧增大 一般粒度直径为柱内径的1 20 l 25为宜 在高压液相色谱中 可采用极细粒度 直径在 m数量级 5 固定液及其配比分离气体及低沸点组分可采用10 25 配比 其它组分采用5 20 配比为宜 6 进样量的选择在实际分析中最大允许进样量应控制在使半峰宽基本不变 而峰高与进样量成线性关系 一般说来 气体样品进样量为0 1 10mL 液体样品进样量为0 1 10 L 18 当下列参数改变时 1 柱长缩短 2 固定相改变 3 流动相流速增加 4 相比减少 是否会引起分配系数的改变 为什么 答 固定相改变会引起分配系数的改变 因为分配系数只于组分的性质及固定相与流动相的性质有关 所以 1 柱长缩短不会引起分配系数改变 2 固定相改变会引起分配系数改变 3 流动相流速增加不会引起分配系数改变 4 相比减少不会引起分配系数改变 19 当下列参数改变时 1 柱长增加 2 固定相量增加 3 流动相流速减小 4 相比增大 是否会引起分配比的变化 为什么 答 k K b 而b VM VS 分配比除了与组分 两相的性质 柱温 柱压有关外 还与相比有关 而与流动相流速 柱长无关 故 1 不变化 2 增加 3 不改变 4 减小 20 为什么可用分离度R作为色谱柱的总分离效能指标 答 分离度同时体现了选择性与柱效能 即热力学因素和动力学因素 将实现分离的可能性与现实性结合了起来 25 丙烯和丁烯的混合物进入气相色谱柱得到如下数据 计算 1 丁烯的分配比是多少 2 丙烯和丁烯的分离度是多少 解 1 kB t R B tM 4 8 0 5 0 5 8 6 2 R tR B tR P 2 YB YP 4 8 3 5 1 0 0 8 1 44 26 某一气相色谱柱 速率方程中A B C的值分别为0 15cm 0 36cm2 s 1和4 3 10 2s 计算最佳流速和最小塔板高度 解 uopt B C 1 2 0 36 4 3 10 2 1 2 2 89cm s 1Hmin A 2 BC 1 2 0 15 2 0 36 4 3 10 2 1 2 0 40cm 21 能否根据理论塔板数来判断分离的可能性 为什么答 不能 有效塔板数仅表示柱效能的高低 柱分离能力发挥程度的标志 而分离的可能性取决于组分在固定相和流动相之间分配系数的差异 31 在测定苯 甲苯 乙苯 邻二甲苯的峰高校正因子时 称取的各组分的纯物质质量 以及在一定色谱条件下所得色谱图上各组分色谱峰的峰高分别如下 求各组分的峰高校正因子 以苯为标准 解 对甲苯 f甲苯 hs hi mi ms 180 1 0 5478 84 4 0 5967 1 9590同理得 乙苯 4 087 邻二甲苯 4 115 32 解 先利用峰高乘以半峰宽计算各峰面积 然后利用归一化法求各组分质量分数 根据公式A hY1 2 求得各组分峰面积分别为 124 16 249 84 254 22 225 4 从而求得各组分质量分数分别为 苯酚 12 71 邻甲酚 28 58 间甲酚 31 54 对甲酚 27 15 解 分别用各组分纯物质与内标物质甲苯组成的混合物的色谱峰峰高对对其质量分数作图 即可绘制各自的工作曲线 相关数据如下 苯的工作曲线 从图中查得当苯峰高与甲苯峰高比值为0 341时 未知物中 苯与内标物混合物中苯的质量分数为0 152 设未知试样中含苯为xg 则 w x x 0 0421 0 152 解得 x 0 0421w 1 w 0 007546g 当对二氯苯与甲苯的峰高比为0 298时 未知样中 对二氯苯与甲苯二元混合物中对二氯苯的质量分数查得为0 725 即未知物中对二氯苯的质量为0 0421 0