生物技术概论.doc

生物技术：（biotechnology）有时也称生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础学科的科学原理，采用先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。先进的工程技术手段是指基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程等新技术。基因工程：主要原理是应用人工方法把生物的遗传物质，通常是脱氧核糖核酸（DNA）分离出来，在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性；有时还使新的遗传信息（基因）在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物（多肽或蛋白质）。这种通过体外DNA重组创造新生物并给予特殊功能的技术就称为基因工程，也称DNA重组技术。细胞工程：是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖；或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种；或加速繁育动植物个体；或获得某种有用的物质的过程。包括动植物细胞的体外培养技术、细胞融合技术、细胞器移植技术、克隆技术、干细胞技术等。酶工程：利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。包括酶的固定化技术、细胞的固定化技术、酶的修饰改造技术及酶反应器的设计等技术。发酵工程：利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程特殊等特点，在适合条件下，通过现代化工程技术手段，由微生物的某种特定功能生产出人类所需的产品，也称微生物工程。蛋白质工程：指在基因工程的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需要的新型蛋白质的技术PCR引物：引物是PCR过程中玉模板DNA部分序列互补，并能引导模板DNA互补DNA链合成的一种脱氧核苷酸寡聚体，其3-端必须具有游离的-OH。引物按预先设计用化学方法合成，其长短与PCR过程中的特异性高低密切相关。电穿孔转化法：利用高压脉冲作用，使细胞膜上产生可逆的瞬间通道，从而促进外援DNA有效导入的方法，其效率受电厂强度，电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响，主要作用于微生物细胞和动植物悬浮细胞或产生质体的基因转化。化合物诱导转化法：用二价阳离子（如Mg Ca Mn）处理某些受体细胞，可以使其转化为感受态细胞，即处于可摄取外源DNA分子的生理状态的细胞，这是试验中常用于微生物转化的一种方法。限制性内切酶定义:是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下是每一条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3-OH基团和5-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。至今发现的限制性内切核酸酶有三型，各具特性，常用的是II型。一、生物技术内涵、产生及特点:特点：“六高” 高效益，可带来高额利润；高智力，具有创造性和突破性；高投入，前期研究及开发需要大量的资金投入；高竞争，时效性的竞争非常激烈；高风险，由于竞争的激烈，必然带来高风险；高势能，对国家的政治、经济、文化和社会发展有很大的影响，具有很强的参透性和扩散性，有着很高的态势和潜在的能量。二、生物技术产生过程:现代生物技术是以20世纪70年代DNA重组技术的建立为标志的。1944年Avery等阐明了DNA是遗传信息的携带者。1953年 沃森和克里克提出了DNA的双螺旋结构模型，阐明了DNA的半保留复制模式，开辟了分子生物学研究的新纪元。1961年Khorana和Nirenberg破译了遗传密码，揭开了DNA密码的遗传信息是如何传递给蛋白质这一秘密。1972年berg首先实现了DNA体外重组技术，标志着生物技术的核心技术基因工程技术的开始。三、生物技术给人类带来益处与忧虑1. 改善农业生产、解决食品短缺 （1）提高农作物产量及其品质培育抗逆的作物优良品系提高粮食品质 植物种苗的工厂化生产生物固氮，减少化肥使用量生物农药，生产绿色食品（2）发展畜牧业生产动物的大量快速无性繁殖培育动物的优良品系2.提高生命质量、延长人类寿命（1）开发制造奇特而又贵重的新型药品 （3）基因治疗（2）疾病的预防和诊断 （4）人类的基因组计划3.解决能源危机、治理环境污染（1）解决能源危机 （2）环境保护4.制造工业原料、生产贵重金属（1）制造工业原料 （2）生产贵重金属生物技术的安全及其对伦理、道德、法律的影响（1）基因工程对微生物的改造是否会产生某种有致病性的微生物，这些微生物都带有特殊的致病基因，如果它们从实验室逸出并且扩散，有可能造成类似鼠疫那样的可怕疾病的流行。（2）转基因作物及视频的生产和销售，是否对人类和环境造成长期的影响，擅自改变植物基因是否可能引起一些难以预料的危险。（3）分子克隆技术在人类身上的应用可能造成巨大的社会问题，并对人类自身的进化产生影响；而应用在其他生物上同样具有危险性，因为所创造出的新物种有可能具有极强的破坏力而引发一场浩劫。（4）生物技术的发展将不可避免地推动生物武器的研制与发展，使笼罩在人类头上的生存阴影越来越大。（5）动物克隆技术的建立，如果被某些人用来制造克隆人、超人，将可能破坏整个人类社会的和平。（6）某些宗教团体禁止食用的动物基因转入他们通常食用的动物中，可能触犯这些团体。（7）动物克隆技术 给人类带来困扰（8）人类基因组与基因诊断技术 一个人的遗传信息是不是一种隐私目的基因获得 1.利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离目的基因:质粒和病毒等DNA分子小的只有几千个碱基对，大的也不超过几十万个碱基对，编码的基因较少。对已测定了核苷酸序列的DNA分子，根据已知的限制性内切核酸酶识别序列只需要用相应的限制性内切核酸酶进行一次或几次酶切，就可以分离出含目的基因的DNA片段。2.利用PCR直接扩增目的基因:如果知道目的基因的全序列 或者其两端约20bp的序列，可以通过合成一对与模板DNA互补的引物，十分有效地扩增出含目的基因的DNA片段。利用PCR反应扩增的DNA片段长度一般在1kb以内。3.目的基因的化学合成:实际上是DNA片段的化学合成，不同的是组成基因的DNA片段一般比较长，先必须按基因的核苷酸序列化学合成几个200bp左右的DNA片段，然后采用全片段酶促连接法等再组装成为含完整目的基因的DNA片段。4.通过构建基因组文库或cDNA基因文库分离目的基因:（1）把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一种受体菌克隆子群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。（2）某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌克隆子群体之中，这样的群体称为cDNA文库。基因克隆载体选择标准（1）在克隆载体合适的位置必须含有允许外源DNA片段组入的克隆位点，并且这样的克隆位点应尽可能的多。为了便于多种类型末端的DNA片段的克隆，克隆载体中往往组装一个含多种限制性内切核酸酶识别序列的多克隆位点（MCS）连杆。（2）克隆载体能携带外源DNA片段（基因）进入受体细胞，或能停留在细胞质中进行自我复制；或能整合到染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA中，随这些DNA同步复制。（3）克隆载体必须含有供选择转化子的标记基因，如根据转化子抗药性升降进行筛选的氨苄青霉素抗性基因。（4）克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞。C 五、常见克隆载体1.质粒克隆载体（1）大肠杆菌质粒载体 （2）蓝藻穿梭质粒载体 （3）农杆菌Ti质粒载体（4）酵母2um质粒载体 （5）T-克隆载体和U-克隆载体2.病毒克隆载体（1）噬菌体克隆载体 （2）植物病毒克隆载体 （3）动物病毒克隆载体3.染色体定位整合载体4.人工染色体克隆载体5几种特殊用途的克隆载体（1）启动子探针载体 （2）诱导型表达载体（3）组织特异性表达载体 （4）反义表达载体A 六、受体细胞的选择标准（1）安全性高，不会对外界环境造成生物污染（2）便于重组DNA分子的导入（3）便于筛选克隆子（4）重组DNA分子在受体细胞内能稳定维持（5）适于外源基因的高效表达，表达产物的分泌或积累（6）具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达（7）对遗传密码的应用上无明显偏倚性（8）遗传性稳定，易于扩大培养或发酵（9）在理论研究或生产实践上有较高的应用价值A 七、重组DNA导入受体细胞过程1.外源DNA转化法（1）直接转化法（2）化合物诱导转化法（3）结合转化法（4）电穿孔转化法（5）微弹轰击转化法（6）激光微束穿孔转化法（7）超声波处理转化法（8）脂质体介导转化法（9）体内注射转化法（10）花粉管通道转化法（11）精子介导法（12）磷酸钙转染法2.病毒（噬菌体）颗粒转导法D 八、DNA提取的常见问题与对策D 九、DNA酶常见问题与对策D 十、PCR常见问题与对策D 十一、连接常见问题与对策D 十二、质粒难题第四章 发酵工程发酵：最初来自拉丁语“发泡”，是指酵母作用于果汁或发芽谷物产生CO2的现象。目前，人们 把利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程统称为发酵。A 一、发酵类型1.微生物菌体发酵以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵，包括用于面包制作的酵母发酵及用于人类食品或动物饲料的微生物菌体蛋白发酵。如冬虫夏草菌、木耳、银耳、灵芝等。2.微生物酶发酵微生物具有种类多、产酶品种多、生产容易和成本低等特点，如微生物生产的淀粉酶和糖化酶用于生产葡萄糖，氨基酰化酶用于拆分D、L-氨基酸等。3.微生物代谢产物发酵初级代谢产物：菌体对数生长期所产生的产物，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等，是菌体生长繁殖所必需的，这些产物叫做初级代谢产物。次级代谢产物：在菌体生长静止期，某些菌体能合成一些具有特定功能的产物，如抗生素、生物碱、细菌霉素、植物生长因子等。这些产物与菌体生长繁殖无明显关系，叫做次级代谢产物。4.微生物转化发酵是利用微生物细胞的一种或多种酶，把一种化合物转变成结构相关的更有经济价值的产物。如利用菌体将乙醇转化成乙酸的醋酸发酵、甘油转化成二羟基丙酮等。5.生物工程细胞的发酵利用生物工程技术所获得的细胞，如DNA重组的“工程菌”以及细胞融合所得的“杂交”细胞等进行培养的新型发酵，其产物多种多样。用基因工程菌生产的有胰岛素、干扰素、青霉素酰化酶等。B 二、发酵技术的特点（1）发酵过程以生命体的自动调节方式进行，数十个反应过程能够在发酵设备中一次完成。（2）反应通常在常温常压下进行，条件温和，能耗少，设备较简单。（3）原料通常以糖蜜、淀粉等碳水化合物为主，可以是农副产品、工业废水或可再生资源，微生物本身能有选择地摄取所需物质。（4）容易生产复杂的高分子化合物，能高度选择地在复杂化合物的特定部位进行氧化、还原、官能团引入或去除等反应（5）发酵过程中需要防止杂菌污染，大多数情况下设备需要进行严格的冲洗、灭菌，空气需要过滤等。D 三、发酵技术应用医药工业食品工业能源工业化学工业冶金工业农业环境保护C 四、发酵过程（1）好氧性发酵：在发酵过程中需要不断地通入一定量的无菌空气，如利用黑曲霉进行的柠檬酸发酵，利用棒状杆菌进行的谷氨酸发酵，利用黄单孢菌进行的多糖发酵等。（2）厌氧性发酵：在发酵时不需要供给空气，如乳酸杆菌引起的乳酸发酵，梭状芽孢杆菌引起的丙酮、丁醇发酵等。酵母菌是兼性厌氧微生物，在缺氧条件下进行厌氧发酵积累酒精，在有氧条件下则进行好氧性发酵，大量繁殖菌体细胞，称为兼性发酵。A 五、液体深层发酵优点（1）液体悬浮状态是很多微生物的最适生长环境（2）在液体中，菌体及营养物、产物易于扩散，使发酵可再均质或拟均质条件下进行，便于控制，易于扩大生产规模（3）液体输送方便，易于机械化操作（4）厂房面积小，生产效率高，易于进行自动化控制，产品质量稳定（5）产品易于提取、精制等。C 六、常用微生物1.细菌：单细胞原核生物，二分裂方式繁殖，发酵工业常用的有乳酸杆菌、醋酸杆菌等。2.放线菌：原核生物，菌落呈放射状，最大的经济价值是可以产生多种抗生素。3.酵母菌：单细胞真核，酸性环境，发酵工业常用的有啤酒酵母、毕赤酵母等。4.霉菌：真菌，菌落呈绒毛状、网状，繁殖能力强，用于生产酶制剂、抗生素和有机酸等。5.担子菌：即菇类，如抗癌药物的开发。6.藻类：以作为人类的保健品和饲料，有些藻类也可将CO2转变为石油。A 一、培养基种类及主要成分（1）孢子培养基：是供制备孢子用的，孢子培养基的组成因菌种不同而异。常用的有麸皮培养基、大（小）米培养基，由葡萄糖、无机盐、蛋白胨等配制的琼脂斜面培养基等。（2）种子培养基：是供孢子发芽和菌体生长繁殖用的。营养成分应是易被菌体吸收利用的，同时要比较丰富与完整。其中氮源和维生素含量略高，但总浓度略稀薄u，以便菌体生长繁殖。常用原料有葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、尿素、硫酸铵、硫酸镁、磷酸盐等。培养基组成随菌种而改变。（3）发酵培养基：供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的。要求其组成丰富完整，营养成分的浓度和黏度适中，利于菌体生长，进而合成大量代谢产物。同时也要考虑菌体在发酵过程中的各种生化代谢的协调，在产物合成期，使发酵液pH不出现大波动。碳源：构成菌体和产物的碳架及能量的来源。霉菌和放线菌还可以利用油脂作碳源，同时油脂可以消泡。氮源：构成微生物细胞本身的物质或代谢产物中氮素来源的营养物质。无机盐和微量元素：微生物生长繁殖和产物形成需要各种无机盐如磷酸盐、硫酸盐、氯化钠（钾），以及微量元素如镁铁钴锌锰等。用于构成菌体原生质的成分；作为酶组成成分或维持酶的活性；调节细胞的渗透压和影响细胞膜的通透性；参与产物的生物合成等。需要极微，一般0.1ug/ml就可以满足要求。生长因子：一类微生物维持正常生活不可缺少，但细胞自身不能合成的微量有机化合物，包括维生素、aa、嘌呤和嘧啶的衍生物以及脂肪酸等。大多数维生素是辅酶的组成成分。需要量甚微，一般150ug/ml甚至更低。水：水是培养基的主要组成成分。它既是构成菌体细胞的主要成分，又是一切营养物质传递的介质，而 且它还直接参与许多代谢反应。产物形成的诱导物、前体和促进剂：许多胞外酶的合成需要适当的诱导物；前体是指被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质；在有些发酵过程中，添加某些促进剂能刺激菌株的生长，提高发酵产量，缩短发酵周期。A 二、发酵的一般过程培养基原料 培养基配制 培养基灭菌 菌体 储备菌种 摇瓶 种子罐 生产罐 培养液 细胞分离 无细胞上清液 产品抽提 产品精制 产品包装 废水处理（1）菌种：发酵生产之前，必须从自然界分离得到能产生所需产物的菌种，并经分离纯化及选育后或是经基因工程改造后“工程菌”，才能供给发酵使用。为了能保持和获得稳定的高产菌株，还需要定期进行菌种纯化和育种，筛选出高产量和高质量的优良菌株。（2）种子扩大培养：将保存在砂土管、冷冻管或冰箱中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面培养基上活化后，在经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种，这个全过程称为种子扩大培养，这些纯种培养物称为种子。（3）发酵：在无菌状态下对微生物进行纯种培养，本阶段微生物合成大量的产物，是整个发酵工程的中心环节。所用的培养基和培养设备必须经过灭菌，通入的空气或中途的补料都是无菌的，转移种子也要采用无菌接种技术。（4）下游处理：发酵后，对发酵液或微生物细胞进行分离和提取精制，将发酵产物制成符合要求的成品。A 三、液体深层发酵1.分批发酵：将营养物和菌种一次加入进行培养，直到结束放罐，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。 优点：除了控制温度、pH及通气外，不进行任何其他控制，工艺操作简单。 比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题。 对营养物的利用效率较高，产物浓度能达到一个较高的水平。 缺点：生产周期长，分批发酵时菌体要经历延至期、对数生长期、稳定期和衰亡期，且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段。 生产效率低，总得生产能力不是很高。 人力、物力、动力消耗较大。2.连续发酵：以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长，其控制方式主要有恒浊器法和恒化器法。. 优点：维持稳定的操作条件，有利于微生物的生长代谢，从而使产率和产品质量也保持稳定。 能更有效地实现机械化和自动化，降低劳动程度，减少操作人员与病原体、毒物接触的机会。 减少设备清洗、准备和灭菌等非生产占用时间，提高设备利用率，节省劳动力和工时。 灭菌次数的减少，使得测量仪器探头的寿命延长。 容易对过程进行优化，有效地提高发酵产率 缺点：开放系统，加上发酵周期长，容易染菌。 在长周期连续发酵中，微生物容易发生变异 对设备、仪器及控制元器件的技术要求较高3.补料分批发酵：半连续发酵，介于分批发酵和连续发酵之间，指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。 优点：可以解除营养物基质的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应。 对于好氧发酵，可以避免在分批发酵中因一次性投入糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况。 可以在某些情况下减少菌体生成量，提高有用产物转化率。 缺点：没有物料取出，产物积累导致比生长速率下降；有物料的加入，增加染菌的机会。 中间补料会造成发酵液稀释，增加下游提取物体积，给产物纯化增加难度。 要求操作者具有较高的操作技能。 需要添加反馈控制系统，增加了投资。直接参数：可以直接采用特定传感器检测的反应物理、化学环境变化的参数，如温度、压力、搅拌功率、转速、泡沫、发酵液黏度、浊度、pH、离子浓度、溶解氧、机制浓度等。间接参数：难于用传感器来检测的参数，包括细胞生长速率、产物合成速率和呼吸商等，需要在一些直接参数的基础上，通过电脑计算和特定数学模型才能得到。C 一、发酵工艺控制1.温度2.pH3.溶氧C 二、发酵设备 （一）机械搅拌式 1.通用式发酵罐：夹套（3m3）、蛇形（5m3） 2.自吸式发酵罐（二）通风、搅拌式（三）厌氧设备A 三、下游技术（图示并说明）（1）发酵液预处理和固液分离 目的是改善发酵液性质，以利于固液分离，常用酸化、加热、家絮凝剂等方法。固液分离则常用过滤、离心等方法。（2）提取 经过预处理后，活性物质存在于滤液或离心上清液中，液体的体积很大，浓度很低。要进行提取，目的主要是浓缩，也有一些纯化作用，常用方法有吸附法、离子交换法、沉淀法、萃取法、超滤法等。（3）精制 大分子精制依赖于层析分离，是利用物质在固定相和移动相间分配情况不同，进而在层析柱中运动速度不同，达到分离目的。（4）成品加工 根据产品应用要求，还需要浓缩、无菌过滤和去热源、干燥、加稳定剂等加工步骤。第五章 酶工程A 一、酶的分离纯化 1.提取时注意事项 （1）温度： 整个提纯操作尽可能在低温下进行（04），防止酶变性失活或是蛋白质水解酶对其水解。 （2）pH：提纯过程中采用缓冲液作为溶剂，防止过酸或者过碱；一定的酶，考虑其pH稳定性及溶解度。 （3）盐浓度：大多pr有盐溶性质，选用合适浓度的盐溶液以促进pr溶解。浓度过高时，酶容易变性。 （4）搅拌：提纯时避免剧烈搅拌（易使pr变性）和产生泡沫。 2.过程 （1）提取破碎细胞：高速组织捣碎机、组织匀浆器。溶剂抽提：稀酸、稀碱、稀盐，注意溶剂的种类、溶剂量和溶剂pH的选择。离心分离：工业上常用板框压滤机完成酶的粗分离。浓缩：近些年常用的方法是超滤。干燥 （2）纯化分子大小形状：离心分离、分子筛、透析或超滤 电荷性质：离子交换、层析聚焦、电泳、等电聚焦 酶分子专一性：亲和层析、染料配体亲和层析、共价层析 分配系数B 二、酶活力与保存比活力：以每毫克蛋白所具有的酶活力单位数。 酶的纯度可以用其比活力来衡量。（1）温度：保存温度一般在04度，（2）缓冲液：大多数在特定的pH范围内稳定，此范围因酶而异。（3）氧化还原：含巯基酶分子应加入还原剂加以保护或在氮气中保存。（4）蛋白质的浓度与纯度：酶浓度越高越稳定，制备成晶体或干粉更有利于保存。B 三、酶分子改造酶分子修饰：通过对酶蛋白主链的剪接切割和侧链的化学修饰对酶分子进行改造，进而改变酶的一些性质，创造出天然酶不具备的某些优良性状。酶的蛋白质工程：主要解决的是酶大量生成的问题。杂交酶：利用基因工程将来自两种或两种以上酶的不同结构片段构建成的新梅。A 四、酶的固定化及性质酶的固定化方法大致可分为三类，即载体结合法、交联法、包埋法。1.载体结合法（1）物理吸附法：以固体表面物理吸附为依据，使酶与水不溶性载体相接触而达到酶吸附的目的，常用吸附载体为多空玻璃、硅胶等。优点：操作简单，反应条件温和，可反复使用 缺点：结合力弱，酶易解析并污染产品。 （2）离子吸附法：通过离子效应，将酶分子固定到含有离子交换基团的固相载体。 优点：操作简单，反应条件温和，固定化酶活性高，容易回收再生。 缺点：载体与酶之间结合不牢，当使用高浓度底物、高离子强度或pH发生变化时酶易脱落。 （3）螯合法：利用螯合作用将酶直接螯合到表面含有过渡金属化合物的载体上。 优点：具有较高的操作稳定性。 缺点：载体与酶结合不牢，高离子强度时酶易脱落。 （4）共价结合法：酶分子上的官能团与载体表面上的反应集团发生化学反应形成共价键的一种方法。 优点：酶与载体结合牢固，不会因底物浓度高或盐类存在而轻易脱落。 缺点：反应条件苛刻激烈，易导致酶失活，使底物专一性发生变化，操作复杂。2.共价交联法 通过双功能或多功能试剂，在酶分子间或酶分子和载体间形成共价键的连接方法。 优点：酶与载体结合牢固 缺点：反应条件激烈，固定化酶回收率较低