急性提取成年小鼠心肌细胞的方法.doc

急性提取成年小鼠心肌细胞的方法第26卷第1期2007年2月河南大学(医学版)JournalofHenanUniversity(MedicalScience)Vo1.26No.1Feb.2OHD7急性提取成年小鼠心肌细胞的方法赵伟,姚素梅,王强(河南大学医学院生物化学教研室,河南开封475004)摘要:目的:目前常用离体心脏灌注法提取心肌细胞,但小鼠的心脏体积较小,难度较大,因此作者通过实验获得一种简易提取成年小鼠心肌细胞的方法.方法:脱臼处死小鼠后,通过胰酶,胶原酶消化提取小鼠心肌细胞.结果:用酶解法可获得大量的高质量的心肌细胞且细胞存活率不低于90%.结论:酶解法提取细胞是一种简单,快速获得成年小鼠心肌细胞的可行办法.关键词:心肌细胞;小鼠;酶中图分类号:Q533文献标识码:A文章编号:16727606(2007)ol一004102AmethodabouttheacuteextractionofmicecardiomyocytesZHAOWei,YAOSumei,WANGQiang(DepartmentofBiochemistry,MedicalCollege,HenanUniversity,Kaifeng,Henan475004,China)Abstract:Objective:ToobtainasimplemethodofextractingcardiomyocytesinmicebyenzymesbecausecardiomyoeytesisolatedbyLangendorffPerfusionweretoosmalltobeusedMethods:Aftermicedied,micecardiomyocyteswereisolatedbyenzymes.Results:WemayacquireamountofcellsonthebasisofthiswayandsurvivalrateofmicecardiomyocytesWasnotlessthan90%.Conclusion:ItisasuccessfulmethodofcardiomyocytesisolationKeywords:cardiomyocytes;mice;enzyme心肌细胞的培养和分离在电生理学,药理学,毒理学等许多研究领域中起着很重要的作用J,而培养心肌细胞需要足够多的急性分离的细胞,且体外培养细胞也与分离的细胞质量有关系.目前获得高质量,高数量的细胞主要采用离体心脏灌注法,但实验操作难度较大J.我们通过实验得到一种比较简便,易行的快速提取成年小鼠心肌细胞的方法.1材料和试剂1.1材料昆明种白色小鼠l8g25g,由河南省动物实验中心提供.1.2主要试剂胰酶(1:250),胶原酶,购自上海生工生物工程技术服务有限公司;RPMI1640培养液,小牛血清购自郑州华美公司;DHanks使用液:NaC18g,KHPO40.06g,KC10.4g,Na2HPO4?12H2O0.12g,葡萄糖1.0g,质量分数为l%酚红0.02g,定容1000ml双蒸水中.2主要仪器恒温磁力搅拌器,离心机.3实验步骤酶解法提取心肌细胞主要参考文献略加修改.脱臼处死小鼠两只,迅速取出心脏.用冷的DHanks液冲洗多次,洗去血迹.用小剪刀把心脏剪成lmm小块,用吸管吹洗23次,去掉血细胞.质量分数为0.1%的胶原酶约5ml37消化2min3min,弃上清液.用质量分数为0.125%的胰酶4ml5ml37磁力搅拌8rain,用吸管轻轻吹打使酶和细胞充分接触.为了有效发挥酶活性可提前预热几收稿日期:20061229基金项目:河南省医学科技创新人才工程计划项目(20010627).作者简介:赵伟(1974一),女,河南新乡人,硕士,从事生物化学教学及科研工作.42河南大学(医学版),2007年,第26卷第1期分钟,消化后稍静止2min,收集上层细胞悬液加等量的含体积分数为10%小牛血清的培养液终止胰酶消化,防止其对细胞的损坏.重复上述步骤45改法olation.次.收集各次消化的细胞悬液,移人离心管中,1000rpm,离心10min.离心后弃上清液,收集细胞沉淀,用培养液调整细胞浓度.取少量细胞悬液用体积分数为0.4%的台盼蓝染色,检查细胞存活率.活的细胞不着色,死的细胞被染成蓝色.4结论用此方法可获得一定数目的供实验需要的心肌细胞,细胞存活率不低于90%.新分离的成年小鼠存活的单个细胞多为长杆状,边界清楚,横纹清晰.讨心肌细胞培养一般都采用乳鼠,培养成年鼠的心肌细胞比较困难.因为心肌细胞是一种终末分化细胞,一旦成熟便失去分裂和增生能力.但是实验动物的年龄差别使鼠心肌细胞在形态,结构和功能方面存在很大差异.所以很难将乳鼠研究的一些理论应用到成年鼠的心肌细胞.急性分离成年鼠心肌细胞可应用于一些研究,如急性分离的成年大鼠细胞可进行免疫荧光实验J.研究心肌细胞材料多选用大鼠,大鼠心脏体积比小鼠大,无论灌流还是酶消化法都可获得较多数量的细胞.但由于小鼠本身繁殖快,易于饲养且耗资低,常被用于一些实验研究.有报道称分离成年小鼠心肌细胞具有正常的电生理活性,分离培养成年小鼠可作为细胞信号研究J.为获得相对足够多的心肌细胞,我们实验发现同时用两只小鼠处理就可以解决这个问题.目前获得高质量,高数量的心肌细胞多采用心脏参考文献:灌注法,但小鼠心脏体积小操作难度大.本实验通过摸索获得一种简单易行的方法,可获得一定数量的心肌细胞,可用于毒理学等一些急性实验.提取心肌细胞常用生物酶(如胰酶,胶原酶等)法和机械法.酶消化时间长短对细胞有一定的影响,而机械法提取细胞的数量不多,通常结合两种方法共同消化.胶原酶主要用来消化细胞间质中的胶原组织,透明质酸等成分,通常采用粗制胶原酶,且要选用同一批次的酶,胰蛋白酶对心肌细胞作用较强,易对细胞造成损伤.胶原酶作用缓和,对细胞损伤少.也有报道同时用体积分数为0.08%胰蛋白酶和体积分数为0.1%的胶原酶混合液消化大鼠细胞获得比较好的效果.本实验先用胶原酶消化细胞之间的连接,再用胰酶消化效果也比较好.酶的消化浓度不能过大以免对细胞造成损伤.一般胶原酶浓度多为体积分数为0.1%0.12%,胰酶为体积分数为0.05%0.25%.酶的效果除了浓度外还受一定的温度限制,可提前预热提高酶的活性.并且为了减少酶对细胞的损伤,每次消化后迅速加入等量血清终止酶的消化.酶的消化时间和次数应根据具体情况,消化以短时间多次消化为基准,实验研究表明消化8min细胞质量比较好.消化至细胞发白为止,过度消化会降低细胞的纯度.实验结果表明:先用胶原酶消化后用胰酶消化,可很好地分离获得多个单的心肌细胞.利用此方法简单,易行,设备简单,费用低,是一种急性分离成年小鼠的一种有效方法.由于成年心肌细胞具有较明显的特征(杆状,表面有横纹),所以观察比较方便.但急性分离的心肌细胞也有不足,不适于做长时间的研究,一般不超过12h.培养的心肌细胞虽然存在许多优点,但也无法完全替代成年鼠心肌细胞的作用.1李温斌,陈室田.心肌细胞的分离,培养及其应用J.心肺血管病杂志,1994,13(4):239242.2许秀芳,李温斌,陈宝田,等.成年大鼠L,JK细胞培养方法的建立和形态学观察J.首都医科大学,2000,21(2):104107.3崔小岱,马连华,许峥,等.柯萨奇B,病毒亲心肌株与非亲心肌株感染小鼠心肌细胞的实验比较J.中华实验和临床病毒学杂志,1997,11(3):274276.4陈莹,龚惠,朱依纯.急性分离的成年大鼠心肌细胞在免疫荧光染色中的应用J.复旦(医学版),2005,32(1):110一l11.5邢斌,招明高,王海芳,等.成年小鼠心肌细胞的分离及电生理特性J.心脏杂志,2002,14(3):210212.6O,Conne11TD,NiYG,Lin