第九章 核酸类药物制备原理.doc

第九章 核酸类药物制备原理第一节 概 述一、核酸的概念及重要性 核酸是生物体的一种大分子化合物，由于最初从细胞核分离出来，又具有酸性，故得名为核酸，但是核酸不仅存在于细胞核内，而且也存在于细胞质中。在自然界中，人、动物、植物和微生物都含有核酸，即使比细菌还小的病毒也同样含有核酸。所以凡是有生命的地方就有核酸的存在。 目前，核酸的生物功能已成为引入注意的中心问题之一。大量事实证明，核酸是生物遗传的物质基础。对生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异有密切的关系，它又是蛋白质生物合成不可缺少的物质。例如有人从鲫鱼肝脏和睾丸提取核酸并将这些核酸分别注入刚受精的金鱼卵。结果此金鱼卵孵化而成的金鱼有一部分失去了金鱼的双尾鳍特征，而变成鲫鱼样的单尾鳍。核酸的化学组成研究，已从分子水平说明核酸能够储存、复制和传递遗传信息。我们日常所见的“种瓜得瓜，种豆得豆”，等遗传现象就是遗传物质将它储存的生物遗传信息传递给子代的结果。 五十年代以后，人们陆续发现了几类功能不同的核酸，他们是蛋白质合成不可缺少的成分。凡是生长或分化旺盛的组织(如胚胎细胞、肿瘤、增殖迅速的细胞等)及分泌活跃的细胞(如胰腺的外分泌细胞、胃粘膜的胃蛋白酶分泌细胞等)，其蛋白质合成都很旺盛。 此时，在它们的细胞质和核仁中必然含有大量的核酸。这就说明核酸与蛋白质合成有着密切的关系。 随着核酸理论方面研究的迅速发展，它在各方面的应用也日益得到重视，在医药方面的应用更是如此。病毒的致病作用就是由于其核酸侵入机体细胞所致。恶性肿瘤、放射病及遗传性疾病都与核酸生物功能的改变有关。因此影响核酸代谢的药物在抗病毒和抗肿瘤中已得到日益广泛的应用。 在抗癌药物中，许多是属于核酸类衍生物。如治疗消化道癌症的5-氟尿嘧啶，治疗白血病的胞嘧啶阿拉伯糖苷(阿胞苷)和6-巯基嘌呤等。 病毒主要是由蛋白质和核酸组成的，对于病毒引起的疾病如天花、狂犬病、乙型脑炎等虽然有些已经可以用免疫方法予以防治，但治疗用的药物很少。最近的研究表明，应用核酸类衍生物作为抗病毒药物已呈现出令人鼓舞的效果。例如，病毒性眼角膜炎，其他许多药物疗效均不甚好，而一些核苷衍生物，如5-碘脱氧尿嘧啶核苷(碘苷)，胞嘧啶阿拉伯糖苷(阿胞苷)等却可治愈此病。其次，在研究病毒性疾病时发现，人体感染病毒后能刺激机体产生一种蛋白质，对侵入的病毒繁殖有干扰作用，因而保护未受感染细胞免受感染，这种蛋白质称为“干扰素”。但它很不稳定，且有种属特异性，因而作为药物还不现实。现在已发现给人体注射一种干扰素诱导物，能使体内产生干扰素而达到防治病毒的目的。用人工方法合成的多种双股多聚核苷酸，如多聚肌苷酸、多聚胞苷酸，就具有防治病毒性疾病的疗效。 各种抗癌和抗病毒药物之所以有抗癌抗病毒作用，是因为癌变细胞和病毒中核酸和蛋白质的合成比较旺盛，而这类药物可以抑制病原核酸和蛋白质的合成，从而抑制了癌细胞和病毒的进一步增殖。所以抗癌和抗病毒药物的作用机制是与核酸密切联系的。二、核酸的分子结构 如同蛋白质是由许多氨基酸基本单位组成的情况一样，核酸是由许多基本单位连结而成的。组成核酸的基本单位是单核苷酸。单核苷酸是由一分子嘧啶或嘌呤类化合物(即碱基)，一分子戊糖(核糖或脱氧核糖)和一分子磷酸组成的。单核苷酸分子中嘧啶和嘌岭类化合物与核糖或脱氧核糖连结的部分称为核苷。核苷的戊糖部分再与磷酸结合就构成单核苷酸。在单核苷酸的分子中，嘧啶碱以N1与戊糖的C1连接，嘌呤碱以N9与戊糖C1连接，磷酸接在戊糖的C5上。它们可用通式表示如下： 单核苷酸根据它们分子中的碱基和戊糖的不同而命名，所以组成核糖核酸(RNA)的单核苷酸有如下四种：即腺苷酸、鸟苷酸、胞苷酸和尿苷酸。同样，组成脱氧核糖核酸(DNA)的单核苷酸也有四种：即脱氧腺苷酸、脱氧鸟苷酸、脱氧胞苷酸和脱氧胸苷酸。 因为单核苷酸分子中的戊糖有几个羟基可与磷酸结合，故单核苷酸又可以根据磷酸与戊糖结合的位置而有所不同。如腺苷酸就可能有2-腺苷酸(磷酸接在2碳原子羟基上，余类推)，3-腺苷酸和5-腺苷酸。三、核酸的一般性质 无论是RNA还是DNA都是分子量很大的复杂有机化合物，都含有C、H、O、N和P五种元素。RNA含N 1516%，P 8.5-9%；DNA含N 15.2%，P 9.2%左右。由于核酸含有带共轭双键的嘌呤碱和嘧啶碱，它们都有特殊的紫外吸收光谱。吸收高峰在260nm左右。核酸溶液的粘滞性比较大，特别是DNA这是因为DNA分子的高度不对称性引起的。 粘滞性减低或消失就表示它已经变性或降解了。核酸一方面带有磷酸基，一方面又含有嘌呤碱与嘧啶碱，所以也是两性化合物，但由于酸性较强，所以能和金属离子成盐，也能与一些碱性化合物形成复合物。例如它能与链霉素结合而从溶液中沉淀出来。第二节 核苷酸的生产工艺流程 核苷酸是多种核苷类药物的原料，这些药物通常是生物自身能够合成的组成遗传物质的结构类似物。目前之用于临床的此类药物有几十种，并且正在深入研究开发。 为了研究核酸，通常必须将它们与其他细胞成分分离，并将其纯化。由于它具有酸性(每个核苷酸残基带一个负电荷)所以在细胞中常与碱性蛋白(鱼精蛋白、组蛋白)和金属阳离子(碱金属或碱土金属)结合。如果将这些碱性结合物全部除去，核酸将发生不可逆的变性。因此，在提取核酸时通常用含盐的pH7的缓冲液。 另一方面，因为DNA是又长又细的线状分子(直径20A，长度为几微米到几毫米)，所以很脆弱，振摇、机械力和酶很容易使其降解。为此，如果我们需要分离完整的天然DNA，则必须十分小心，以防降解。一般应采取低温(0左右)，避免在提取过程中用强酸或强碱，并加用抑制剂(如制备DNA时用柠檬酸、氟化物、砷酸盐或EDTA等)以抑制酶的破坏作用。 提取核酸的一般原则是用机械方法或酶学方法(溶菌酶)使细胞破碎，然后用蛋白质变性剂如苯酚、去垢剂(硫酸十二酯钠等)处理，使蛋白质沉淀。这种提取和去蛋白的过程要重复几次。最后，所获得的核酸溶液用乙醇使其沉淀。 值得注意的是，在细胞中核酸有二大类，即DNA和RNA，RNA又包括m-RNA，r-RNA，t-RNA等，这就使得对它们的提取和纯化过程变得更加复杂，因此没有一种通用的方法可适用于所有核酸的分离，不同的核酸应该使用不同的方法进行分离。 一、DNA的制备 DNA蛋白在不同浓度的NaCl溶液中溶解度十分不同，它在水中可以溶解，当NaCl浓度为0.14M时，溶解度最低，仅为水中溶解度的1/100。当NaCl浓度再增加时，溶解度又增加，例如在0.5M时溶解度与水相似，而当NaCl增至1M时，DNA蛋白溶解度较在水中大二倍以上。这种溶解度变化可被用以提取DNA，也可以使DNA蛋白和RNA蛋白分离，因为RNA蛋白在0.14M的NaCl溶液中能够溶解，而DNA蛋白则不溶解，借此可以分离。 从DNA蛋白提取液中去掉蛋白质的方法很多，常用者有：(1)三氯甲烷法。将DNA蛋白溶液和等体积的三氯甲烷戊醇(3：1)混合物激烈振荡、离心，上层水液含DNA、蛋白，下层为三氯甲烷和戊醇，两层之间为蛋白凝胶。上层水液再用三氯甲烷戊醇的混合液处理如上，并反复数次，至二层之间无蛋白胶状物为止。(2)去污剂法。是目前最常用的方法，因为这种方法可以获得一种很少降解，而又可以复制的DNA制品。并且它还有一个优点，既阴离子型去污剂既能解离核蛋白络合物，使它分离成为核酸与蛋白质，同时又能使蛋白质沉淀。二、RNA的提取 RNA比DNA对酸、碱的作用更不稳定，因此在提取RNA及其核蛋白的方法中都必须采用温和试剂。RNA与DNA不同，RNA蛋白能溶于0.14MNaCl溶液中，因此可用此溶液提取。从提取液中去除蛋白的方法有： (1)在10%NaCl中加热至90，离心除去不溶物，加乙醇使RNA沉淀，或调等电点沉淀RNA。(2)用胍盐酸盐(最终浓度2M)可溶解大部分蛋白质，冷却，RNA即沉淀而出。粗制品再用三氯甲烷法除去少量残余蛋白质。 (3)去污剂法。最常用的为硫酸十二酯钠，用此法可从酵母制得大分子RNA。 (4)苯酚法。可用90%苯酚提取，离心后，蛋白质和DNA留在酚层，而RNA在上层水液内，然后进一步分离。第三节 核酸类药物制备工艺 核酸类药物可分为两大类。一类为具有天然结构的核酸类物质，这些品种都是生命体合成的原料，或是蛋白质、脂肪、糖生物合成，降解以及能量代谢的辅酶。属于这类的核酸类药物有肌苷、ATP、辅酶A、脱氧核苷酸、肌苷酸、鸟三磷、胞三磷、尿三磷、腺嘌呤腺苷、5-核苷酸混合物、2，3-核苷酸混合物、辅酶、辅酶等。这些药物多数是生物体内自身能够合成的物质，在具有一定临床功能的前提下，毒副作用小。它们的生产基本上都可以经微生物发酵或从生物资源中提取。另一类为自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类似物或聚合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病的重要手段，也是产生干扰素，免疫抑制的临床药物。已经正式在临床应用的有阿糖胞苷、聚肌胞苷酸、无环鸟苷、阿糖腺苷等。一、阿糖胞苷(Cytarabine)的制备(一)结构与性质 化学名称为1-D-呋喃阿糖胞嘧啶(1-D-Arabinofuranosylcytosine) 阿糖胞苷又称胞嘧啶阿拉伯糖苷，与正常的胞嘧啶核苷及脱氧胞嘧啶核苷不同，其差别在于糖的组成部分是阿拉伯糖，不是核糖或脱氧核糖。白色或类白色结晶性粉末，无臭，易溶于水，略溶于甲醇、乙醇中，乙醚中极微溶。 阿糖胞苷熔点212213.5，其盐酸盐熔点为186190(分解)。在酸及中性水溶液中脱氨水解变成阿糖脲苷，pH 2.8时水解速度最大，pH6.9时相对较小，pH10以上水解速度急剧加快，故最稳定的pH为6.9。在碱性溶液中，其损失大约比在酸中快10倍。临床应用的是阿糖胞苷盐酸盐，商品名称Cytarabine、Cytodar，进入体内转变为阿糖胞苷酸，抑制DNA聚合酶，阻止胞二磷转变为脱氧胞二磷，从而抑制DNA的合成，干扰DNA病毒繁殖和肿瘤细胞增殖。用于治疗急性粒细胞白血病，具有见效快，选择性高的特点，单独使用不如与其它抗癌药合用疗效高，口服无效，只能注射。(二)生产工艺1.以5-CMP为原料的合成法(1) 工艺路线(2)工艺过程 水解 称取5-CMP(纯度30%)100g，悬浮于800ml蒸馏水中，加入浓氨水约50ml，调节pH89，使5-CMP全部溶解(如5-CMP粗品质量较差，加碱后有不溶物，可过滤或离心除去)，稀释至1L，倒入10L的三口圆底烧瓶中，并加入处理好的6.5L氢氧化镧凝胶，总体积为7.5L，升温至90，在不断搅拌下，于pH9下进行水解。在不同的反应时间内，均匀取出2ml凝胶溶液，离心分离，取上清液5至1L，pH9.2电泳分析，检查水解程度。当反应25h后，电泳纸上5-CMP位置紫外点消失，仅有胞嘧啶核苷(CR)的紫外点位置，为水解终点。然后进行离心分离(2500r/min)，得上清液，凝胶沉淀用蒸馏水洗2次，每次用水为3L左右，再离心(25003000r/min)10min，得洗涤液，与上清液合并。再减压浓缩至0.4L左右，呈混浊，过滤除去不溶物，可得淡黄色透明溶液，再浓缩至0.2L，冷却，加入6mol/L HCl 30ml，调PH2.53.0。有大量白色针状结晶缓慢析出。加约100ml 95%乙醇，置冰箱过夜，次日滤出结晶，用50%乙醇洗涤，再用无水乙醇洗涤1次，得白色胞嘧啶核苷盐酸盐(CRHCl)精晶，收率54%，含量高于80%。 氧桥化 取三氯氧磷(POCl3)300ml放入5L的圆底烧瓶中，放在于冰浴中冷却20min，加预冷蒸馏水60ml(为水解1分子POCl3的用水量)，3min后有盐酸气体冒出，5min反应平衡，继续置冰盐浴中水解30min。水解后快速倒入乙酸乙酯2L，同时立即加入干燥好的盐酸盐40g，离开冰浴，置80水浴锅中回流，开始时反应液呈悬浮状，约2530min后，变澄清透明，总反应时间控制在4050min。反应完成后，立即用冰水冷却，将反应液倾入4L冷蒸馏水中，在50的条件下减压抽去乙酸乙酯，取样测定，氧桥化后总OD光谱高峰位置移至264nm(pH2)，pH9.2电泳为单点。将浓缩液(pH0.5)在不断搅拌下用氢氧化钠液调pH33.5，取样测定。 氨解 上述反应液加入浓氨水至氢氧化铵为1mol/L，80氨解10分钟，使氧桥断裂3，5-乙酰基脱落，得胞嘧啶阿拉伯糖苷。氨解程度以测定氨解液紫外光吸收280/265nm，比值达1.451.5为终点，光谱高峰移至279280nm氨解液如有沉淀，过滤除去，过滤清液调节pH2.53.0，上活性炭柱去盐(活性炭0.71)，用35倍体积蒸馏水(调到pH3)洗去盐，再用60的50%乙醇-1%氨水溶液洗脱。收集洗脱液，浓缩至20ml左右，调节pH3.0，加乙醇到50%左右，放冰箱中结晶，过滤，烘干，得胞嘧啶阿拉伯糖苷粗品，按CR重量计算，收率5060%。 成盐 取阿糖胞苷粗制品22g，加入2%盐酸-甲醇440ml和甲醇220ml，于50水浴上振摇溶解(如有少量淡黄色粉末残留物应除去)，加活性炭2g脱色半小时，过滤，浓缩，置冰箱过夜，过滤得阿糖胞苷盐酸盐粗品约22g，熔点186189。 取粗制品用30倍甲醇，在45下搅拌溶解，加活性炭2g，保温20min，过滤，浓缩，置冰箱过夜，滤出结晶，用甲醇-无水乙醚(1：1)20ml洗涤，抽干，真空干燥即得阿糖胞苷盐酸精品20g，熔点188194。母液待回收。2.以葡萄糖酸钙为原料的合成路线(1) 工艺路线(2)工艺过程 降解、氧化 按葡萄糖酸钙：硫酸铁：无水醋酸钡：水：过氧化氢：1：0.077：0.14：13：1.21.3(V)的配料比投料。将葡萄糖酸钙加水，加热至75溶解后，倒入铁触媒液(醋酸钡溶液和硫酸溶液临用前混合即得)，搅拌均匀，升温至95，过滤去沉淀。清液于40加入1/2量过氧化氢进行氧化，控制温度不超过56，反应30min，反应液变为黑色时，静置30min，降温至40加入余量过氧化氢，按上面同法氧化。30min后加入草酸，过滤除去草酸钙，滤液真空浓缩至糖浆状，温度不超过48。加适量无水甲醇溶解，放冷结晶，过滤，滤饼用甲醇洗涤，抽干，干燥，得粗品。再用甲醇溶解，脱色，结晶1次，得D-阿拉伯糖。熔点150以上，25D-103105(c=1，水)，收率30%。 环合 按D-阿拉伯糖：氰胺：氨水(23%)：甲醇：1：0.56：0.30.35(V)：34(V)的原料比投料。将含氰胺1520%的甲醇溶液与D-阿拉伯糖及氨水混合，搅拌下缓缓加热，于1h内升温至5162，保温反应30min，继续搅拌自行降温2h，放置过夜。冷却结晶，过滤(滤液回收)，收集滤饼用甲醇泡洗，抽干，干燥，得2-氨基-D-阿拉伯糖-恶唑啉。熔点160以上(分解)，25D+20(C=1，水)，收率7580%。 环合，水解、开环、成盐 按丙炔腈：2-氨基-D-阿拉伯糖-嗯唑啉：二甲基乙酰胺：1mol/L氨水：35%盐酸甲醇溶液：1：3.25：10(V)：4050(V)：50适量的配料比投料。将2-氨基-D-阿拉伯糖-嗯唑啉和二甲基乙酰胺搅拌混合，冷至5，滴加丙炔腈与少量二甲基乙酰胺的混合液，控制滴加温度不超过10，滴完，于25搅拌30min，得棕色反应液，过滤、滤饼用甲醇洗涤，合并滤、洗液，进行水解。 上述滤、洗液加入氨水于60搅拌10min，保持60以下减压浓缩去水，浓缩物用含35%盐酸的甲醇溶液调节pH到4，冷冻结晶，用甲醇-乙醇混合液泡洗，抽干，干燥，即得阿糖胞苷盐酸盐粗品，收率95%。 粗制品用2025倍量甲醇及5-10%的活性炭脱色精制，得阿糖胞苷盐酸盐，收率70%。 对葡萄糖酸钙计算，总收率为1516%。 (三)作用与用途 本品在体内转变为阿糖胞苷酸，抑制DNA聚合酶，阻止胞二磷(CDP)转变为脱氧胞二磷(DCDP)，从而抑制DNA合成，干扰DNA病毒繁殖和肿瘤细胞增殖，口服本品易被胃肠道粘膜和肝中胞嘧啶核苷脱氨酶作用而失活，故不口服，仅供注射用，它为细胞周期特异性药物，作用于S期，并对G1/S，S/G2边界有延缓作用。本品主要在肝肾中代谢，合用脱氨酶抑制剂如四氢尿苷或四氢胞苷可延长其血中半衰期和提高血药浓度。 临床用于治疗急性粒细胞白血病，缓解率成人患者达1644%，儿童患者可达56%。与6-巯基嘌呤、环磷酰胺、氨甲蝶呤、卡氮芥合用，可增加疗效。也可用于慢性粒细胞白血病、头颈部肿瘤、恶性淋巴瘤。本品的抗病毒谱与碘苷相同，用于乙型疱疹病毒和中枢神经系统感染较碘苷更为有效。本品对单疱疹病毒有明显抑制作用，对牛痘病毒也有一定抑制作用，因对角膜有损伤，故用于单疱疹病毒角膜炎并不理想。静注或静滴剂量每次12mg/kg体重，每月2次，35天为一疗程，休息一周可重复治疗，鞘内注射剂量每次20mg，每周23次，用药23周；皮下或肌注时每周1mg/kg体重。二、聚肌胞苷酸(Poyinosinic)的制备 (一)结构与性质 1967年美国人Field发现聚肌胞是干扰素诱导物，而且具有广谱抗病毒作用。本品是人工合成的干扰素诱导剂，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多聚核苷酸，本品可溶于0.85%氯化钠溶液。 (二)生产工艺 70年代中期我国开始研制聚肌胞，其生产工艺如下： 1.底物5-核苷二磷酸吡啶盐的制备2.固定化多核苷酸磷酸化酶的制备（1）酶的制备（2）固相载体的制备(3)固定化多核苷酸磷酸化酶将分离纯化的酶液滴加入冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核苷酸磷酸化酶。3.Poly 的制备(1)底物预处理CDP吡啶盐转成锂盐，IDP转成钠盐。(2)酶促反应 (每毫升反应液含mol/L数)IDP或CDP15；Tris150；MSCl26；EDTA1；聚合酶5单位，pH9.0，37，34h。用盐酸调pH1.52.0，使Poly沉淀，立即离心。此后在磷酸液冲液中溶解，等摩尔Poly与Poly C混合，生成产品。 (三)作用与用途 本品具有抗病毒，抗肿瘤，增强淋巴细胞免疫功能和抑制核酸代谢等作用。本品注入人体诱导产生干扰素。干扰素可作用于正常细胞产生抗病毒蛋白(AVF)，从而干扰病毒繁殖，保护未受感染细胞免受感染。 临床已试用于肿瘤、血液病、病毒性肝炎及痘类毒性感染等多种疾患，对带状疱疹、单纯疱疹有较好疗效，对病毒性肝炎、病毒性角膜炎和扁平苔藓有明显疗效，对乙型脑炎、流行性腮腺炎、类风湿关节炎等亦有不同程度效果。肌注每次14mg。三、胞二磷胆碱(CDP-胆碱)(Citico line，CDP-choline)的制备 (一)结构与性质胞二磷胆碱其化学名称为胞嘧啶核苷-5-二磷酸胆碱钠盐(Cyddine-5-diphos-phate choline monosodium)本品为白色无定形粉末，易吸湿，易溶于水，几不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机图溶剂。1%水溶液pH2.53.5，注射液pH7.0。 (二)生产工艺 1.酶合成法 胞二磷胆碱由微生物菌体所提供的酶系催化胞苷酸和磷酸胆碱而合成，国内使用啤酒生产中废弃的酵母，反应体系为： 磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH8.0)200mol/ml， CMP20mol/ml， 磷酰胆碱30mol/ml， 葡萄糖1000mol/ml， MgSO47H2O 20mol/ml， 酵母泥550mg/ml。 上述反应体系于28保温20h，胞二磷胆碱对胞苷酸的收率为80%。 2.粘性红酵母发酵法 国外发现一株粘性红酵母可高产胞二磷胆碱。 菌体培养基(g/L)：葡萄糖50；多胨5；酵母膏2；KH2PO4 2；(NH4)2HPO4 2；MgSO47H2O 1；pH6.0，经28，22h培养，收集菌体，菌体经0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.0洗涤，备用。 产生胞二磷胆碱的反应体系(g/L)：葡萄糖140；MgSO47H2O 6；5-CMPNa2 20；磷酸胆碱20；析干菌体50；反应体系中保持磷酸缓冲液pH7.0、0.2mol/L，30，28h产胞二磷胆碱9.8g/L，对5-CMP收率92.5%。 提取工艺：反应液离心除去菌体，用0.5mol/L KOH调pH8.5，上dowex l2(酸型)树脂，水洗后用甲酸梯度洗脱，在0.04mol/L甲酸洗脱液中收集产品，含胞二磷胆碱溶液上活性炭柱，丙酮-氨水溶液洗脱，减压浓缩，乙醇结晶。 (三)作用与用途 胞二磷胆碱是卵磷脂生物合成的前体。当脑功能下降时，脑组织内卵磷脂含量显著减少。本品能促进卵磷脂生物合成，兴奋脑干网状结构，特别是上行网状联系，提高觉醒反应，降低“肌放电”阈值，恢复神经组织机能，增加脑血流量和脑耗氧量，从而改善脑循环和脑代谢，大大提高患者的意识水平。 临床用于减轻严重脑外伤和脑手术伴随的意识障碍，治疗帕金森氏症，抑郁症等精神疾患。由于胞二磷