非酒精性脂肪肝动物模型造模方法的研究.doc

非酒精性脂肪肝动物模型造模方法的研究中西医结合秆霸杂志2002年第13卷第2期非酒精性脂肪肝动物模型造模方法的研究张玉峰陈文慧云南中医学院(昆明,650200)脂肪肝是由多种疾病和多种病因引起的以肝脏脂肪蓄积过多为病理表现的一种常见肝病,部分病例可发展为肝纤维化,甚至导致肝硬化近年来由于生括水平的提高,杖食结构的变化及预防保健措施的相对滞后,我国由高脂血症,肥胖,糖屎病,药物损害等引起的非酒精性脂肪肝发病率呈上升趋势.为深入研究脂肪肝的发病机制,筛选顶防和治疗脂肪肝的有效药物,探讨药物的作用机理,选择一个与人类病变相似的动物模型极为重要.近年来t许多学者对利用宴验动物复制非酉精性脂肪肝的病理模型进行了大量的研究.本文就国内外对非酒精性脂肪肝的造模方法及结果作一简要介绍,以便从中把握模型的动态变化,为今后建立更稳定的模型打下良好的基础1营养失调性睹肪肝模型1?l高脂饲料谤发肥胖,高脂血症脂肪肝通过高脂,in/或高胆圃醇饲料制备脂肪肝模型是最常用的非酒精性脂肪肝模型大多采用基础饲料加猪油或胆固醇或蛋黄喂养动物,所需造模周期长,约412W,甚至半年,此模型病变有一定发展过程,与临床高脂血症或肥胖引起的脂肪肝相近.成功率高.华天懿等用基础饲料50加l0猪油,10奶粉,30%鸡蛋组成总能量为16SOKJ/10og的高脂饲料喂养大鼠12W+大鼠第2w开始体重增长加速,至第4W体重已明显高于对照组2个标准差,最终体重超过对照组67个标准差.肝脂质代谢紊乱,肝匀浆甘油三百旨(TG),胆固醇(TCH)显着高于对照组,光镜下可见胞浆内脂滴大小不等.这种通过增加饮食中热量而形成的动物肥胖与儿童单纯性肥胖症的自然发病过程相似,对儿童单纯性肥胖症及并发的脂肪肝的防治研究有一定的意义.Esterbauer等口用基础饲料加I1%玉米油喂养纯种SD幼年太鼠9W,实验大鼠出现严重的脂肪肝.由于本实验中动物自由摄食+玉米油组大鼠摄食量高于其他两组,因而它们的脂肪和总能量的实际摄入量要高于其他组,所以过种模型还有待完善祁培宏等以普通饲料喂养大鼠1W,再用古5乳清酸,10胆固醇,20猪油,1蛋黄粉的脂肪乳剂,每次lml/lO0,早上用脂肪乳剂t晚上用生理盐水镬胃,时间为4W.结果肝脏体积变大,湿重增加,色黄,质软而橙脆,切面油腻;HE染色肝细胞体积明显增大,胞浆内可见脂肪空泡,胞核被推向周边f苏丹黑B染色见大小不一的黑色脂滴积聚成田I血清,肝脏TG,TCH显着升高钟岚等在普通饲料中加2胆固醇,l0猪油,自由戗水?123?综述?进食?3个月后实验动物体重,肝指数(肝湿重/体重100)眈正常组显着增高t血TCH和游离脂肪酸(FFA)音量显着增高t光镜下出现程度不同的弥漫性肝细胞脂肪变性,尤以中央静脉周围最为明显本模型与人类肥胖薤告并高脂血症I曩脂肪肝的病例极为相似,可用于血脂调整药物防治动脉粥样性硬化和脂肪肝的药理研究范建高等用高脂饲料(2胆固醇,1O猪油,l0玉米油,78基础饲料)喂养成熟雄性Wistar太鼠,结果6个爿后大鼠体重,肝重及腹部脂肪重量均显着增加,血清TCH,TG和肝组织TG古量均显着增高,肝细胞轻至中度脂肪变Zaman等采用隔离小鼠肝脏摧注的方法.将16.94葡萄糖,2.46脂肪乳剂及5.2氨基酸组成的乳剂以肠外营养方式对隔离小鼠肝脏进行灌注,结果8O的肝脏出现脂肪变性.1.2禁食后撮入高糖,高淀粉请发的脂肪肝模型Mittend0rfer等将大鼠禁盘48h后饲以高碳水化台物(81%磷水化台物,4%脂肪,15蛋白质),结果肝脏甘油三酯音量升高,肝细胞出现脂肪变性,肝脏脂肪古量上升高达235总细胞色素P50(CYP)下降55,提示脂肪聚集与CYP活动碱弱及CYP蛋白表达减少有关.Nathaie等将体重240260g的雄性大鼠禁食48h后饲以高糖高淀粉饮食(40蔗糖,40:i淀粉,16酷蛋白,4矿物质和维生索),48h后肝细胞形成轻至中度的巨形空泡脂防变性,严重打乱了肝实质的小梁形状.肝脏TG水平是正常蛆的410倍.1,3奎晒外营养(TPN)造成的脂肪肝模型脂肪变性是临康上TPN常见的并发症Sax等:一利用TPN方式制作r脂脐肝模型.制作方法为:将大鼠乙醚麻醉后颈内静脉置内径为0?9ram硅腔管t导管经皮下从颈后穿出,固定,连接输液装拦,将鼠放入代谢笼内,允许其自由活动,每只大鼠每天给于非蛋白质热量2l3-4KJ,氮量为366mg,脂肪乳剂提供35的热量,Z4h恒遣灌注?实验进行7d.结果与对照组相比.肝耻湿重髓显增加t肝内TG,TCH含量明显增高,光镜下肝纲f包内空泡形成;而当营养液的成分为每lO0g体重每日输入35Kca!的热量,葡萄糖占总热量83时,1w后大鼠肝脏出现明显的脂肪浸润.该模型与人类相似,但由于操作的复杂而限制了其推广应用.2药物中毒性脂肪肝模型扬新波等用D一半乳糖胺对小鼠1次攻毒80mg/kg,ig,?124?24h后血清ALT,AST升高明显,随着时间延长至96ht肝功能基本恢复正常病理学检查显示中毒后24h到48h肝细胞浊肿,空泡,嗜酸性变和严重脂肪变性CC为常用的化学性肝毒剂,可以造成动物急性肝损伤杨新渡等_I用15g/L的CC对小鼠进行1敬攻毒,10mg/,.病理学检查显示小鼠中毒后2448h肝细胞浊肿,空泡及严重肝脂肪变性.Yamamoto等_】对雄性成年日本白兔注射20mg/kg的甲基强的松龙,4W后43兔子股骨出现多发病灶,在接近坏死部位的小动脉出现血栓.6W后出现高血脂,肝脏脂肪变性.骨内脂肪桂塞.血小板减少和血纤维蛋白原碱步.Furahama等_I在太鼠饮食中加人0.25的DL一乙硫氨酸.2W后肝脏组织病理学检查显示中等至严重的脂肪肝并伴有肝纤维化上述几种药物都能在短时间内造成脂肪肝模型.产生弗漕性小泡性肝脂肪变性,具有简便,快速的优点.其缺点是这些模型从发病机制,病程演变过程及最终组织形态学改变来看都与人类脂肪肝有较大差异,且药物毒性强,动物易中毒死亡.3特殊种系动物的先天性遗传性脂肪肝模型soga等_1通过同系文配的方法培养成功一种FLS新品种小鼠,这种小鼠可以不出现肥胖而自发产生脂肪肝,新出生的FLS小鼠整个肝脏小叶含有相当多的小脂滴,随着年龄的增长出现太脂滴,肝脏甘油三酯含量是其姊妹品种DS小鼠的5倍.而血脂含量及脂蛋白全貌则未提示异常.与DS小鼠相比,其天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶活性增强,提示肝脏损伤.将FLS小鼠和C3H/He/Sh小鼠相交配进行基因杂交试验提示FLS小鼠的脂肪肝具有复杂的多基因持征.Shimomura等州培养一种转基因ap2一SREBP一1c463小鼠,这种小鼠携带胆固醇调节性元素结合蛋白(SREBP)基因.可以在脂舫组织中过度表达核性SREBlc,表现出类似人类先天性脂肪代谢障碍综台症,即高胰岛素血症,高血糖症及肝脏脂肪变性.与野生小鼠相比.这种小鼠的棱性SREBP.1c蛋白水平显着增高.SREBPs是一族调节转录因子.其靶基因参与脂肪酸台成,后者直接与肝脏的脂肪变性有关.J等0培养出一种OLETF小鼠,这种小鼠可自发形成带有脂肪肝的糖尿病,其空腹血糖及胰岛素升高,血清胆固薛及甘油三酯木平升高,肝脏湿重增加.肝脏切面显示小叶中心区出现脂肪变性Moriya等_I培育了携带HCV核心基因的转基因小鼠.它们发生了逐渐加重的肝脏脂肪变性.肝脏脂肪变性是丙型肝炎的特征,研究发现HCV桉蛋白在肝脏脂肪变性中起着直接的作用这些转基因小鼠为探讨人类HCV感染与脂肪肝的关系提供了一个很好的动物模型幼年内脏脂肪变性(JVS)小鼠存在垒身性肉碱缺乏症,它们如果在出生后45W生存下来后体重迅速增加,肝细胞轻至中度脂肪变.肝畦肉碱含量明显低于对照组.由于肉碱缺乏导致曙酸氧化障碍,进而造成脂酸在肝脏中的堆积JVs小中西医结台肝病杂志2002年第12卷第2期鼠的包括编码尿素转化酶在内的一些肝脏选择性基因表现低表达.转录因子HNF一4,C/EBP基因低表达对应甲酰基磷酸盐台成酶系统(CPS)及精氨酸琥珀酸台成酶(ASS)的低诱导,进而干扰脂肪酸的代谢口上述这些特殊种系的动物可自发形成脂肪肝.因而在实验研究中较为台适,映点是对品系有一定的要求,且造摸动物死亡较多.代竹较昂贵,因而实用性有限.4其他用途的脂肪肝动物模型Hazle等建立了用于影像学定量诊断脂肪肝的动物模型.其方法为;健康家兔24只,兔龄78个月,体重2.53,0kg.雌雄各半,随机分为4组,以古5脂肪的混台基础饲料分别艰养1,2,3,4W.自由饮水培养期间.每周第1d插胃管灌注5OCCI.石蜡油5ml,结果出现轻重不同的脂肪肝.根据病理学脂肪肝分级标准,实验组中有6只轻度脂肪肝,6只为中度,4只为重度,并随着CC1.灌胃次数的增多和用量的增加.实验组动物形成的脂肪肝程度呈现由轻到重的变化趋势,图像分析系统测定肝细胞脂清占肝脏单位体积的百分比(vP)也呈现升高的变化,表明肝组织内脂肪含量逐步增多,选种方法建立的脂肪肝动物模型能够获得不同程度的脂肪肝且呈轻重程度分布,且方法可行,结果可靠,适于影像学诊断脂肪肝的实验研究.谢滟等口2建立了妊娠期脂肪肝的动物模型.其方法为雌性小白鼠从妊娠第1d开始.每13经腹腔注射苯甲酸二醇36,=mol/kg.共7d.结果游离脂肪酸显着升高.磷脂下踌,总胆固薛升高,肝胆呈黄色外观.肝细胞肿胀,胞浆呈空泡状.微泡内脂肪滴大量堆积.电镜下线粒体肿胀,肥厚,核糖体空泡或扩张成囊,内有脂类物质.脂肪肝是妊娠期特有肝病中最为严重的阶段,本模型的建立对探讨妊娠期脂肪肝的发病机理及治疗提供了一个方法.缺点是造摸方法成功率低.总之,国内外在几种常见的非酒精性脂肪肝动物模型研究方面做了不少工作,取得了很大的成绩.一个理想的动物模型应是;与类疾病特征相似;病变有一定发展过程;形成率高t死亡率低,重复性好;造模方法简便易行.今后在模型研究工作中.应注意纯系动物的培养与动物品种选择,提高动物的质量和实验动物管理木平,尽量减少动物的个体差异和死亡率;病理,生化等观察指标应力求标准;研究的模型重复性耍高,造摸动物在生理解剖发病机制及病理演变方面都应力求与人类近似,以复制更符合人类疾病实际情况的,较理想的动物模型.参考文献1华天站,王富伟,金年岩,等高能饲料对太鼠脂类代谢,脂质过氧化反应等髟响的研究,中华儿童保健杂志.1998,6【2):1292E,terbauerH.CytotoxicityandgeaotoxicityoJLipidoxidmlonAmJClinNutr,1993,57(s)I779s3祁墙密,余莉芳.羽平,等.消脂保肝住抗大鼠脂肪作用研究中西医结合肝病杂志,2000,10(j):334钟岚,范建高t王国良,等肥胖.高脂血症性脂肪肝肝炎模型的建立.实验动物科学与管理,2000,17;16中西医结音肝病杂志2002年第12卷第2期5范建高,曾民德,季继强,等.Bezafibratedui对大鼠高脂血症和脂肪肝形成的影响.胃肠病和肝脏病学杂志,1999,2c6):lOO6ZamanN,TamYK.JewellLD,eta1.EffectsofintravenousLipidaSasoursofenergyinparenteranutritionliverperfuslon.BiopharmDrugDspos.1997,18(9)l8037MittendorferB,JeschkeMG,WotfS,eta1.NutritionalhepaticsteatcisandmortaUtyafterburninjuryinrat8.ClinNutr,1998,17(6):2938NathalieM.Delzenne.NancyA,eta1.Awmodel0facuteliversteatoslsinducedinratsbyfastingfoLlowedbyrefcedingahighcaT-bohydratefatfreediet.JHepato.1997,26(3)l8809SaxHC.TalaminiMA,BrackettK.et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