食管鳞癌患者外周血中Th17细胞的检测及期临床意义.pdf

论文题目 食管鳞癌患者外周血中T h l7 细胞的检测及 其临床意义 D e t e c tio no fT h l7c eIISinp e rip h er aIbIc o do f e S O D n a g e alC a n C e rp a tIe n t Sa n aIt SCII m lInIC al SI g n ItIc a n c e 者 亓磊 业 外科学 胸外科 师 田辉教授 2 0 11 年4 月 10 日 作 专 导 竺兰竺竺 l 吣Y 删1 9 3 8 8 5 7 原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的指导下 独立进 行研究所取得的成果 除本文中已经注明引用的内容外 本论文不包 含任何其他人或集体己经发表或撰写过的科研成果 对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体 均己在文中以明确的方式标明 本声明的 法律责任由本人承担 论文作者签名 盈日期趔 垒 三 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留 使用学位论文的规定 同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被 查阅和借阅 本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或其他复制手段保存 论文或汇编本学位论文 保密论文在解密后应遵守此规定 论文作者签名 导师签名 山东大学硕 学位论文 目录 中文摘要 1 英文摘要 3 符号说明 6 论文正文 7 前言 7刖舌 研究目的 材料和方法 1 3 研究目的 1 3 研究对象 1 3 研究方法 1 3 流式细胞术检测外周血T h l 7 细胞占淋巴细胞的比例 1 3 R T P e R 实验方法 1 6 统计学处理 2 0 结果 2 1 食管鳞癌患者外周血T h l 7 细胞占淋巴细胞的比例升高 2 1 食管鳞癌患者R O RYtm R N A 和I L 1 7m R N A 的表达 2 1 食管鳞癌淋巴结转移组外周血T h l 7 细胞的比例及R O RYt N I L 1 7m R N A 表达水平 2 1 讨论 2 2 附图 2 5 参考文献 3 0 综j 丕 3 6 致谢 4 5 攻读学位期间发表的学术论文目录 4 6 R e s u l t s 2 1 D i s s c u s s i o n F i g u r e s 2 5 R e f e r e n c e s R e v i e w 6 A c k n o w l e d g e m e n t 4 5 A c l l i e v e m e m s 4 6 山东人学硕上学位论文 中文摘要 食管鳞癌患者外周血中T h l7 细胞的检测及其l 临床意义 专业 胸外科 研究生 亓磊 导师 田辉教授 背景和目的 T h l 7 细胞 Th e l p e r1 7 T h l 7 是一种由初始C D 4 T 细胞分化而来的效应T 细胞 能特异性的产生I L 1 7 i n t e r l e u k i n1 7 I L 一1 7 具有不同于T h l T h 2 细胞的分化 发育调节机制 T h l 7 细胞介导炎性反应 并参与肿瘤 自身免疫性 疾病和移植物抗宿主等疾病的发生和发展 与疾病的转归和预后关系密切 R O RYt 是T h l 7 细胞特异性的转录因子 调控I L 一1 7 的分泌 多种慢性炎症疾病中可见T h l 7 细胞及其分泌的R O RYt I L 1 7 高表达 由慢 性炎症导致的肿瘤中I L 1 7 表达也升高 食管慢性炎症反应引起的基底膜改变与 食管上皮细胞异常增生相关 食管癌的发生与炎症密切相关 本实验通过检测食 管鳞癌患者外周血T h l 7 细胞占淋巴细胞的比例及外周血单个核细胞 P e r i p h e r a l b l o o dm o n o n u c l e a rc e l l P B M C 中转录因子R O RYt 和细胞因子I L 1 7 的表达水 平 探讨T h l 7 细胞及其特异性R O RYt 及I L 一1 7m R N A 的变化在食管鳞癌中的意义 研究方法 标本来源于山东大学齐鲁医院2 0 0 9 年8 月至2 0 1 0 年6 月4 0 例经手术治疗的食 管鳞癌患者 所有患者术前均未经化疗或放射治疗 其中男2 4 例 女1 6 例 年龄 3 4 7 8 平均年龄6 1 8 7 6 岁 4 0 歹l J 健康志愿者外周血标本为对照 其中男性 2 3 例 女性1 7 例 年龄2 3 一 6 8 平均年龄4 6 9 6 3 岁 流式细胞术检N I T h l 7 细胞在外周血淋巴细胞中的比例 P T P C R 检测P B M C 中R O RYt 和I L 一1 7m R N A 的表达 水平 术前取外周血4 m l 肝素钠抗凝 计量数据以x 婊示 采用S P S S l 7 0 统计软件分析 采用两样本芒检验 尸 0 0 5 为有统计学意义 研究结果 1 流式细胞术检测结果显示 食管鳞癌患者外周血T h l 7 细胞占淋巴细胞的比例 为 2 4 0 士0 5 5 显著高于健康对照组外周血T h l 7 细胞所占比例 O 8 4 士 0 4 1 差异有统计学意义 P O 0 1 山东人学硕上学位论文 2 R T P C R 检测P B M C 结果表明 食管鳞癌患者外周血P B M C 中R O RYt I L 1 7m R N A 表达水平均明显高于健康对照组 尸 0 0 1 且两者呈明显正相关 0 5 5 1 尸 0 0 1 3 食管鳞癌患者淋巴结转移组与未转移组相比 T h l 7 细胞 R O Ryt 和I L 1 7 m R N A 均明显升高 尸 0 0 5 研究结论 食管鳞癌患者外周血T h l 7 细胞占淋巴细胞的比例显著高于健康对照组 表 明食管鳞癌患者可能存在着T h l 7 细胞高表达现象 食管鳞癌患者R O RYt 及 I L 一1 7m R N A 的表达水平均明显高于健康人 并且两者呈明显正相关 表明T h l 7 细胞特异性转录因子R O Ryt 表达水平的增高可能促进了I L 1 7 的高表达 淋巴 结转移组R O RYt 和I L 一1 7m R N A 的表达均显著高于未转移组 T h l 7 细胞及其主 要转录因子R O RYt 及细胞因子1 L 1 7m R N A 的表达随着食管癌的进展而表达上 调 提示T h l 7 细胞参与了食管鳞癌的侵袭转移 关键词 食管鳞癌 R O RYt I L 一1 7 T h l 7 山东大学硕上学位论文 E N G LIS HA B S T R A C T D e t e c tio no fT h l7c eIISinp e rip h e r a IbIo o do fe s o p h a g e a I C a n C e rp a tle n t sa n aIt scl lnlC aIsIIIg nItIC a n C e 一 B a c k g r o u n d M a j o r it y T h o r a ciCs u r g e r y P o s t g r a d u a t eQ iL e i A d v i s o rT i a nH u i T h l 7c e l l Sw h i c hd i f f e r e n t i a t ef r o mp r i m eC D 4 Tc e l l Sa r er e c e n t l y d e s c r i b e de f f e c t o rTc e l ls u b s e t sc h a r a c t e r i z e db yt h ep r o d u c t i o no fI L 一1 7 T h l 7c e l l Sa r ed i f f e r e n tf r o mo fT h la n dT h 2o nc e l ld i f f e r e n t i a t i o na n d g r o w t hr e g u l a t o r ym e c h a n i s m T h l 7c e l l Sw e r es i g n i f i c a n t l ya s s o c i a t e d w i t hr e c o v e r ya n dp r o g n o s i so fd i s e a s e sb ym e d i a t i n gt h ei n f l a m m a t o r y r e a c t i o n a sw e l la si n v o l v e di nt h eo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to ft u m o r a u t o i m m u n n ed i s e a s e sa n dc o n t r a d i c t i o no fg r a f tv e r s u sh o s td i s e a s e s R O RYti st h es p e c i f i ct r a n s c r i p t i o ne f f e c t o ro fT h l 7m e d i a t i n gt h e s e c r e t i o no fI L 1 7 T h l 7c e l l S w i t hi t ss e c r e t i o no fR O RYta n dI L 一1 7 Fo v e re x p r e s s i o n w e r ef o u n di nv a r i o u sc h r o n i ci n f a m m a t o r yd is e a s e s A n dt h ee x p r e s s i o n o fI L 一1 7w a si n c r e a s e di nc a r c i n o m ai n d u c e db yc h r o n i ci n f i a m m a t i o n T h e c h a n g eo fb a s a lm e m b r a n ec a u s e db ye s o p h a g u sc h r o nicin f la m m a t o r y d i s e a s e sw a si nr e l e v e n tw i t he p i t h e li a lc e l l sd y s p l a s i ai ne s o p h a g u s w h e r e a st h ed e v e l o p m e n to fe s o p h a g e a lc a r c i n o m aw a sa s s o c i a t e dw i t h i n f l a m m a t i o n T oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to fT h l 7c e l l s R O RYta n dc h a n g e o fI L 一1 7m R N Ao ne s o p h a g e a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a E S C C w et e s t e dt h e e x p r e s s i o nl e v e l so f b o t hR O RYta n dI L 一1 7m R N Ai np e r i p h e r a lb l o o d m o n o n u c l e a rc e l l a n dt h ep r o p o r t i o no fT h l 7c e l l si np e r i p h e r a lb l o o d l y m p h o c y t e so fp a t i e n t sw i t hE S C C M e t h o d 4 0p a t i e n t s 2 4m e na n d1 6w o m e n w i t ht h ea g er a n g e db e t w e e n 3 山东人学硕士学位论文 3 4 7 8 y e a r s M D 6 1 8 7 6y e a r s w h ow e r ed i a g n o s e da sE S C Ci nQ il uH o s p i t a l S h a n d o n gU n i v e r s i t yf r o mA u g u s t2 0 0 9t oJ u n e2 0 1 0a n d4 0n o r m a lp e r s o n s a m o n gw h o m 2 3m e na n d16w o m e nw i t ht h ea g er a n g e db e t w e e n2 3 7 8 y e a r s M D 4 6 9 6 3y e a r s w e r er e s e a r c h e d T h ep r o p o r t i o no fT h l 7c e l l si n p e r i p h e r a lb l o o dl y m p h o c y t e sw a sd e t e c t e db yf l o wc y t o m e t r y F A C S a n d R T P C Rw a su s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o n1 e v e l So fI L 一1 7a n dR O RYtm R N A i np e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l1 4m lv e n o u sb l o o df r o me a c hs u b j e c t w a sa n t i c o a g u l a t e dw i t hh e p a r i nb e f o r eo p e r a t i o n D a t aa r ed e s c r i b e d u s i n gt h em e a na n ds t a n d a r dd e v i a t i o n m e a n S S t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e o ft h ed i f f e r e n c e sb e t w e e nt h ep a t i e n tg r o u pa n dt h eh e a l t h yc o n t r o lg r o u p w a se s t a b l i s h e du s i n gP a i r e d Tt e s t PP 0 0 5w a sc o n s i d e r e dt ob e s i g n i f i c a n t T h es t a t is t i c a lp a c k a g eu s e df o rt h ea n a l y s i sw a sS P S S1 7 0 R e s u l t s 1 T h eF A C Sr e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ep r o p o r t i o no fT h l 7c e l I si n p e r i p h e r a lb l o o dl y m p h o c y t e sw a sm a r k e d l yh i g h e ri nE S C Cp a t i e n t s 2 4 0 士0 5 5 w h i l et h a t i nh e a l t h yg r o u pw a s 0 8 4 士0 4 1 P O 0 1 2 T h er e s u l to fR T P C Rd e t e c t i o no fP B M Cr e v e a l e dt h a tt h ee x p r e s s i o n l e v e l So fR O RYta n dI L 一1 7m R N Ai nP B M Ci nE S C Cp a t i e n t sw a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti nh e a l t h yg r o u p P O 0 1 T h e r ew a sa p o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fR O RYta n dI L 一17m R N A a n dE S C C r 2 0 5 5 1 P 0 0 1 3 T h el e v e lo fT h l 7c e l l s R O RYta n dI L 一1 7m R N Ai n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y i nE S C Cp a t i e n t sw i t hm e t a s t a s i Sc o m p a r e dt ot h el e v e li nt h eg r o u pw i t h o u t m e t a s t a s i S P 0 0 5 C o n c l u s i o n T h ep r o p o r t i o no fT h l 7c e l1 Si np e r i p h e r a lb l o o dl y m p h o c y t e sw a s m a r k e d l yh i g h e ri nE S C Cp a t i e n t st h a nt h a ti nh e a l t h yc o n t r o lg r o u p w h i c h i n d i c a t e dt h a tT h l 7o v e re x p r e s s i o nm i g h te x i s ti nE S C Cp a t i e n t s T h e p o s i t i v ei n f l u e n c eo fe x p r e s s i o nl e v e lo fR O RYta n dI L 一1 7m R N Ao nE S C C 4 山东大学硕士学位论文 p a t i e n t sa n dh i g h e re x p r e s s i o no fR O RYta n dI L 一1 7m R N Ai nE S C Cp a t i e n t s t h a nt h a ti nh e a l t h yg r o u pd e m o n s t r a t e dt h a th i g h e re x p r e s s i o no fs p e c i f i c t r a n s c r i p t i o nf a c t o ro fT h l 7c e l I s R O RYtc o u l dp r o m o t et h ee x p r e s s i o n l e v e lo fI L 一1 7 T h ee x p r e s s i o nl e v e lo fR O RYta n dI L 一1 7m R N Ai nl y m p hn o d e m e t a s t a s i sg r o u pw a ss i g n i f i c a n th i g h e rt h a nt h a tw i t h o u tm e t a s t a s i S i n a d d i t i o n t h el e v e lo fT h l 7c e l l Sw i t ht h em a i nt r a n s c r i p t i o n f a c t o r R O RYta n dc y t o k i n eI L 一1 7m R N Aw e r eo v e re x p r e s s e dw i t ht h e p r o g r e s so ft h ee s o p h a g e a lc a r c i n o m a w h i c hr e v e a l e dt h a tT h l 7c e l1S i n v o l v e di nt h ei n v a s i o na n dm e t a s t a s i So fe s o p h a g e a lc a r c i n o m a K e yw o r d s E s o p h a g e a lc a n c e r R O RYt I L 一17 T h l7 5 T G F Bt r a n s f o r m in gg r o w t hf a c t o rb e t a P B S m R N A P h o s p h a t eb u f f e rs a li n es o l u t i o n M e s s e n g e rR i b o n u c l e i cA c i d c D N A c o m p l e m e n t a r yD e o x y r i b oN u c l e i cA c i d T r e g T h l 7 P B M C Tr e g u l a rc e l l I L 一1 7p r o d u c i n gC D 4 Th e l p e rc e l1 p e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l s I F N Yi n t e r f e r o n Y R O RYto r p h a nn u cle a rr e c e p t o rg a m m at 中文名称 焦碳酸二乙酯 t i o n 反转录聚合酶链式反应 白介素 1 7 白介素一6 白介素 i 0 转化生长因子B 磷酸盐缓冲液 信使核糖核酸 互补脱氧核糖核酸 调节性T 细胞 T h l 7 细胞 外周血单个核细胞 Y 干扰素 视黄酸相关孤儿受体Yt S T A T 3 S i g n a lt r a n s d u c e r sa n da c t i v a t o r s信号传导及转录激活因子3 E B E D T A T N F o ft r a n s c r i p t i o n3 e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d e T u m o rn e c r o s iSf a c t o r 溴化己锭 乙二胺四乙酸 肿瘤坏死因子 6 一 山东人学硕上学位论文 食管鳞癌患者外周血中T h l7 细胞的检测及其I 临床意义 刖吾 T h l 7 细胞 Th e l p e r1 7 T h l 7 是一种由初始C D 4 T 细胞分化而来的效应T 细胞 能特异性的产生I L 1 7 i n t e r l e u k i n1 7 I L 一1 7 具有不同于T h l T h 2 细胞的分化 发育调节机制 T h l 7 细胞介导炎性反应 并参与肿瘤 自身免疫性 疾病和移植物抗宿主等疾病的发生和发展 与疾病的转归和预后关系密切n 吨1 R O RYt 是 T h l 7 细胞特异性的转录因子 调控I L 一1 7 的分泌 初始C D 4 T 细胞可以分 化为T h l T h 2 T r e g 和T h l 7 等不同的亚群 在T G F 一1 3 和I L 一6 同时存在时 会促进 C D 4 T 细胞向T h l 7 细胞方向分化 T h l 7 细胞具有独立的分化和发育调节机制 并 特异性地产生I L 一1 7 效应因子H 3 1 T h l7 细胞概述 1 1T h l7 细胞的发现 长期以来 人们将辅助T 细胞按功能分为T h l T h 2 T r e g 和T h l 7 等不同的亚群 并认为T h l 类细胞能够介导组织损伤 但大量的关于自身免疫反应等疾病模型的 研究表明 他们并不起维持和决定性的作用嫡1 在人们对鼠的自身免疫疾病模型 E A E E x p e r i m e n t a la u t o i m m u n ee n c e p h a l i t i s 和C I A C o l l a g e ni n d u c e d a r t h r i t i s 的研究中发现T h l 7 细胞亚型 L a n g r i s h 等阿1 研究证实由I L 一2 3 诱导产 生的I L 一1 7 细胞因子可以导致严重的E A E 而I L 一1 2 诱导的T h l 细胞则不会产生此效 应 因此 人们将这种能够产生I L 一1 7 细胞因子的T 细胞命名为T h l 7 细胞 而直到 人们对T h l 7 转录因子进行分析 发现其特异的R O RYt 不同于其他T 细胞亚群 才 最终确立了其独立地位阳 9 1 2T H l 7 细胞的特异性细胞因子 I L 1 7 细胞因子I L 一1 7 是由分化成熟的T h l 7 细胞特征性分泌的 细胞因子I L 1 7 是一 个包括6 个成员的细胞因子家族 I L 一1 7 A 且P 为通常所说的I L 1 7 另有I L 一1 7 B I L 1 7 C I L 1 7 D 即I L 一2 7 I L 一1 7 E 即I L 一2 5 和I L 1 7 F 其中 I L 1 7 A 和I L 1 7 F 是由T h l 7 细胞分泌的 可以诱导活化T 细胞 巨噬细胞 成纤维细胞和上皮细胞等 产生多种促炎因子和趋化因子 表现出强大的促炎作用 并与多种免疫失调性疾 山东人学硕士学位论文 病相关H 1 0 1 3T h l 7 细胞的特异性转录因子 R O R Y t 有研究证实R O RYt 具有D N A 结合活性 是维甲酸孤儿受体基因 特异性表达 于人和鼠的T H l 7 细胞 孤儿受体家族包括三个成员 分别是R O RYt R O RQ R O R B 有研究发现R O RQ 由T H l 7 细胞表达 与R O RYt 有相似的生物活性n 1 1 T G F 一1 3 和I L 一6 可以增强R O RYtm R N A 的表达 R O RYt 的表达上调依赖S T A T 3 途径 I L 1 7 的大量表达依赖S T A T 4 途径 这两条途径都参与T h l 7 细胞的分化n 2 1 引 2T h l7 分化发育的调节 初始C D 4 T 淋巴细胞识别M H C I 卜抗原肽复合物 由共刺激信号共同作用后活 化 在不同的条件下可分化成T h l T h 2 T h l 7 等不同的T h 细胞亚群 执行不同的生 物学功能 2 1 细胞因子对的T h l 7 分化发育正向调控 2 1 1T G F B 和IL 6 初始C D 4 T 淋巴细胞识另O M H C I I 一抗原肽复合物 由共刺激信号共同作用后活 化 在不同的条件下可分化成T h l T h 2 T h l 7 等不同的T h 细胞亚群 执行不同的生 物学功能 研究发现T G F B 和I L 一6 是T h l 7 细胞分化的启动因子 活化的C D 4 T 细 胞在T G F B 和I L 一6 同时存在的情况下 经由S T A T 3 S i g n a lt r a n s d u c e r sa n d a c t i v a t o r so ft r a n s c r i p t i o n3 信号传导及转录激活因子3 信号通路传导 激活特异性转录因子R O R Yt R O R Yt 使活化的C D 4 T 细胞向T h l 7 细胞分化 分 泌大量I L 1 7 1 4 15 1 调节性T 细胞甚至是某些肿瘤细胞 肿瘤基质细胞均能产生 大量的T G F 一1 3 而I L 6 贝0 由抗原提呈细胞 A P C 如单核巨噬细胞 树突状细胞以 及T h 2 产生 体外培养研究发现 在缺乏T G F 1 3 或加入I L 一6 受体抗体时 均可阻 断对T h l 7 的诱导效应 最终T h l 7 的L l f f J 下调n6 l 2 1 2IL 2 3 和IL 11 3 I L 一2 3 在T h l 7 细胞分化发育的过程中起着重要作用 I L 一2 3 由活化的髓系细胞 如树突状细胞 d e n d r i t i cc e l l s D C s 和巨噬细胞 m a c r o p h a g e s M 巾 产生 能引 起分化的T h l 7 细胞增殖 I L 一2 3 缺陷对T h l 7 细胞的正常产生无任何影响 离开了 T G F 一1 3 和I L 一6 即使高浓度的I L 一2 3 也不能使初始C D 4 T 细胞转化为T h l 7 细胞 7 1 与工L 一2 3 类似 I L 一11 3 也可由活化的髓系细胞产生 对T h l 7 细胞的分化起到促进作 山东大学硕十学位论文 用 8 因此有人认为 I L 2 3 I L 一1B 是T h l 7 细胞存活 增殖的重要因子 而T G F B 和I L 一6 才是促进T h l 7 分化的启动因子 5 1 91 2 1 3IL 2 1 T h l 7 细胞中高表达细胞因子I L 一2 1 I L 2 1 是I L 2 家族的成员之一 具有相同 的Y 链 通过自分泌途径协助T G F 1 3 促进T h l 7 细胞的分化和发育晗0 1 并具有弥补 I L 6 的缺失来诱导R O RYt 和T h l 7 细胞分化的功效瞳1 2 2 细胞因子对的T h l7 分化发育负向调控 T h l 7 细胞分化发育也受到一些细胞因子的负向调控 I L 一1 2 与I L 一2 3 属同家 族 拥有共同的p 4 0 亚基 但在T h l 7 分化过程表现出拮抗的生物学效应 工L 一1 2 为T h l 分化的关键细胞因子 通过激活S T A T l 途径而上调转录因子T b e t 从而促 进T h l 分化 使其分泌的I F N Y 增加 I F N Y 既有抑锘l J T h l 7 分化的作用 还能抑 制已活化的T h l 7 细胞 减少I L 1 7 的产生 I F N Y 通过自分泌作用于T h l 对其增殖 起着放大效果 是T h l 重要的细胞因子 因此 在I F N Y 缺陷可以促进T h l 7 细胞 的增殖和活化 从而使I L 1 7 分泌量提高H 2 幻 与I L 1 2 一样 I L 4 在T h l 7 分化过程中也表现出拮抗的生物学效应 I L 4 通过激活S T A T 6 途径上调G A T A 3 形成正反馈作用于I L 4 的转录 I L 一4 能够维持T h 2 的增殖 同时抑 1 J T h 和T h l 7 的分化和I L 一4 增殖 I L 4 的作用被特异抗体阻断时 I L 一2 3 诱导I L 1 7 大量产生 T G F 一1 3 由调节性T 细胞分泌 是诱导T h l 7 分化的关键 因子 体外实验证实单独的T G F B 使I L 一1 7 的表达水平下调瞳引 3T h l 7 细胞与肿瘤 3 1T h l 7 1 L 1 7 在多种肿瘤中的表达 有研究发现 胃癌患者外周血中T h l 7 细胞的比例较高 显著高于健康对照组 外周血中T h l 7 细胞的比例 差异有统计学意义 并且胃癌患者外周血中T h l 7 细胞 的比例增高的程度与胃癌T N M 分期有关系 I I I 和 期 根据T N M 分期 胃癌患 者外周血中T h l 7 细胞的比例明显高于I 期患者 也显著高于健康对照组 此外 晚 期 I I I I I 和 期 胃癌患者肠系膜淋巴结中T h l 7 细胞水平也明显高于I 期患者 与T h l 7 细胞相关的细胞因子如I L 一1 7 I L 一2 3 p 1 9 和R O RYt 的m R N A 在晚期胃癌患者 肿瘤组织中的表达水平明显增高 细胞因子I L 一1 7 和I L 2 3 在晚期胃癌患者外周血 的浓度也明显高于I 期患者 因此研究者认为T h l 7 I L 1 7 可能对胃癌的发展起了 山东大学硕 学位论文 促进作用乜4 l 有研究证实 在乳腺癌和结肠癌小鼠模型中 肿瘤高表达的T G F B 可以使I L 一1 7 的表达上调 而且I L 一1 7 对肿瘤的生长有直接促进作用 在体外实 验中发现I L 1 7 同时还抑制了肿瘤细胞的凋亡口5 l 通过对乳腺癌患者H E R 2 的研究 发现 乳腺癌患者中H E R 2 阳性与H E R 一2 阴性外周血中T h l 7 细胞的比例分别为 0 3 1 4 0 7 4 8 明显低于健康对照组外周血中T h l 7 细胞的比例 0 8 4 0 由此可见 I L 1 7 具有多效性 T h l 7 细胞的不同亚型以及其分泌的不同细胞因子 对肿瘤的生长起到促进或抑制的作用 3 2T h l 7 I L 1 7 在炎症相关肿瘤中的表达 有研究发现 多种慢性炎症疾病中可见T h l 7 细胞及其分泌的R O RYt I L 1 7 高表达 表明T h l 7 细胞参与慢性炎症的病理机制 通过对人类肿瘤与小鼠的多种 恶性肿瘤模型的研究 发现慢性炎症是肿瘤的主要诱发因素心7 1 H P 感染诱导的慢 性炎症是胃癌的主要病因 在H P 感染的胃黏膜上可见I L 1 7 表达上调乜引 多种慢 性炎症可导致肿瘤发生 女 J H P 感染 炎症性肠病 前列腺炎 乙肝病毒感染等 H P 感染介导的慢性炎症是胃癌的主要发病原因之一 在H P 感染的胃黏膜上可见 I L 2 3 介导的I L 1 7 高表达 慢性炎症性肠病克罗恩病和溃疡性结肠炎的发生发展 与C D 4 T 细胞的过度激活并释放多种促炎症因子有关 如I L 一6 I L 一2 3 I L 一2 7 T N F 和I L 1 7 这些促炎症因子导致了T H l 7 细胞的分化 肝炎病毒B 和C 感染引起的 肝炎中可见I L 1 7 表达增高 肝炎是肝癌的主要形成原因之一 在呼吸道的慢性 炎症的研究中发现 I L 1 7 高表达 中性粒细胞和T H l 7 细胞大量增生 推测吸烟 等原因引起的呼吸道慢性炎症 与微生物感染相协同 介导肺癌的发生 1 食管慢性炎症反应引起的基底膜改变与食管上皮细胞异常增生相关m 3 上皮 由于某种原因的刺激产生炎症 然后到炎性增生 再发展为不典型增生 进一步 发展为癌 男性慢性食管炎的发病率高于女性 这与食管癌发病率男性高于女性 的特点一致 有食管癌家族史者慢性食管炎检出率也明显高于无食管癌家族史者 有研究表明食管癌的发生规律可能为 正常食管上皮经过某种刺激产生炎症 然后发展到炎性增生 再发展为不典型增生 进一步发展为癌口引 3 3T h l 7 I L 1 7 的促瘤作用 在对人体肿瘤组织的研究中发现I L 1 7 的表达与血管密度有相关性 I L 一1 7 主要通过对血管内皮细胞的趋化作用 上调促血管因子表达和协同其他血管生成 山东大学硕上学位论文 因子促进血管生成 体外实验中I L 1 7 能促进角膜血管的新生 主要通过促进血 管内皮细胞的迁移和血管索的形成起作用 I L 一1 7 可上调成纤维细胞和肿瘤细胞 促血管生成因子的表达口3 l 有实验发现 1 7 份卵巢癌组织中1 1 份I L 1 7 m R N A 表达 阳性 6 份表达阴性 I L 1 7 m R N A 表达阳性者微血管密度显著高于阴性者 1 研究 发现多种血管源性因子如C X C L l C X C L 5 C X C L 6 和C X C L 8 等在I L 一1 7 的作用下表达 上调 这些人非小细胞肺癌 N S C L C 的血管源性因子有促进肿瘤相关的新血管生 成的作用 从而明显增加肿瘤体内微血管的数量和密度 间接地促进肿瘤的生长 转移和浸润 此效应可被相应血管源性因子抗体阻断口5 1 有研究者观察 肝细胞 癌 H C C 患者的预后与T h l 7 细胞分泌I L 1 7 相关 推颍l J J I L 一1 7 可能通过促进肿瘤血 管的新生 进一步促进了肿瘤的病理进展 导致患者生存期缩短 死亡率高 预后 亡士 3 6 Z 1 二 体内实验发现黑素瘤局部浸润的T H l 7 细胞产生的I L 一1 7 能直接刺激这些黑 素瘤细胞及肿瘤间质细胞生长 同时I L 1 7 可以诱导产生I L 6 然后通过活化肿 瘤细胞和基质细胞的S T A T 3 信号途径 提高这些细胞有抗凋亡 促血管生成等作 用的基因的表达口7 J 体外实验中I L 1 7 可增强肿瘤细胞的抗凋亡能力 从而直接 促进肿瘤生长 说明I L 一1 7 对恶性肿瘤的生长可能有促进作用b 朝啪1 这些发现表 明T h l 7 I L 1 7 促进了肿瘤的生长 提示可以通过抗I L 1 7 或抗T G F B I L 6 对恶 性肿瘤的生长和转移起到有效的抑制作用 3 4T h l 7 I L 1 7 的抑瘤作用 有研究者认为 I L 一1 7 对肿瘤具有抑制作用 有实验将鼠结肠腺癌细胞株M C 3 8 细胞行皮下注射后 发现I L 1 7 缺陷鼠的肿瘤比野生鼠生长速度更快 经静脉注射 M C 3 8 细胞后 I L 1 7 缺陷鼠肺部比野生鼠有更多的转移灶 I L 1 7 缺陷鼠的肿瘤引 流淋巴结内N K 细胞 T 细胞的数量均低于野生鼠 使N K 矛 I T 细胞对肿瘤的杀伤能力 降低 因此研究者认为内源性工L 一1 7 可促进抗肿瘤的免疫应答 抑制肿瘤的生长和 转移 但重组的鼠I L 一1 7 对鼠结肠腺癌细胞株M C 3 8 细胞增殖 分化和细胞凋亡没有 明显作用口引 有学者将造血系统的肿瘤细胞 肥大细胞瘤P 8 1 5 和浆细胞瘤 J 5 5 8 L 接种小鼠后 发现工L 一1 7 对这些肿瘤的生长有抑制作用 这种抗肿瘤效应具T 细胞依赖性 推测可能是I L 一1 7 诱导巨噬细胞分泌I L 1 2 I L 1 匕促进T h l 细胞的 分化和诱导细胞毒性T 细胞 C T L s 的活化 这些T 细胞在抗肿瘤的免疫过程中发挥 山东大学硕十学位论文 了重要作用 0 J 有研究发现I L 1 7 可以通过上调I F N Y 的表达 抑N 4 鼠黑素瘤 的发展 T h l 7 细胞L L T h l 细胞更加有效 相E L T h l 细胞处理组 T h l 7 细胞处理组的 小鼠存活时间更长H I L 1 7 缺陷时 I F N Y 的自然杀伤细胞和T 细胞减少 肿 瘤生长及转移活性增加 I L 一1 7 的抗肿瘤效应是通过上调I F N Y 间接表现的 与 传统观点认为的T h l 细胞的抗肿瘤机制相吻合 推测T h l 7 细胞和T h l 细胞在肿瘤免 疫上可能存在多方面联系 需进一步研究证实 I L 2 1 抗肿瘤机制可能是I L 2 1 通过诱导C T L s 活化而发挥抗肿瘤作用乜0 1 T h l 7 细胞中高表达细胞因子I L 2 1 I L 一2 1 不仅促进了肿瘤微环境中C D 8 T 细胞的扩增 同时还抑制了C D 4 F o x p 3 T r e g 细胞在肿瘤微环境中的聚集 从而发挥其抗肿瘤的 功效M 羽 T h l 7 I L 1 7 对肿瘤的作用目前尚无定论 或许需要依据T h l 7 细胞的不同亚型 以及其分泌的不同细胞因子而定 目前 由于T h l 7 细胞处于极其复杂的免疫系统 中 受多种细胞及相关细胞因子的影响 在肿瘤中的产生和调节机制尚不清楚 I L 1 7 在肿瘤中的表达及作用也了解有限 所得的证据尚存在较多相互矛盾的地 方 T h l 7 细胞在肿瘤中的作用更加复杂 需要进一步研究探讨 山东大学硕 l 二学位论文 研究目的 材料和方法 研究目的 通过检测食管癌患者外周血中T h l 7 细胞占淋巴细胞的比例及P B M C 中 R O RYt 及I L 一1 7 表达水平 探讨T h l 7 细胞以及R O RYt 和I L 1 7m R N A 表达的改 变在食管鳞癌中的临床意义 为深入研究T h l 7 细胞在肿瘤免疫中的作用奠定基 础 研究对象 经手术治疗行食管占位切除 胃 食管吻合术 术中行系统性淋巴结清扫并 取病理证实的食管鳞癌患者 所有患者术前均未经化疗或放射治疗 其诊断参照 病理组织分型及2 0 0 9 年国际抗癌联盟 U I C C 与美国癌症联合会 A J C C 联合推出 的国际食管癌T N M 分期 标本来源于山东大学齐鲁医院胸外科2 0 0 9 年8 月至2 0 1 0 年6 月食管鳞癌患者 术前取外周血3 m L 肝素钠抗凝 其中年龄3 4 7 8 平均年龄 6 1 8 7 6 男2 4 例 女1 6 例 按食管癌组织病理诊断分为 低一中分化鳞癌1 0 例 低分化鳞癌9 例 中一高分化鳞癌2 例 中分化鳞癌1 2 例 高分化7 例 其中伴淋巴 结转移者2 8 例 未转移者1 2 例 正常对照组4 0 f f I J 全部为健康志愿者 其中男性2 3 例 女性1 7 例 年龄2 3 6 8 平均年龄4 6 9 6 3 研究方法 1 流式细胞术检测外周血T h l 7 细胞占淋巴细胞的比例 1 1 主要仪器 1 1 1O L Y M P U S 光学显微镜 日本 1 1 2B DF A C S C a n t o T M 流式细胞仪 e B i o s c i e n c e S a nD i e g o C A 1 1 3L D 5 2 A 离心机 北京医用离心机厂 1 1 4 超净工作台 1 1 5 微量加样器及加样管 1 1 6 其他 试管 镊子 移液管 量杯 载玻片 冰箱 固定槽 染色架等 1 2 主要试剂及制备 1 2 1 主要试剂 淋巴细胞分离液 T r i z o l I n v i t r o g e n 公司 细胞因子刺激 剂P M A 莫能霉素 离子霉素 A l e x i sB i o c h e m i c a l s S a nD i e g o C A C D 3 P E C y 5 山东大学硕士学位论文 抗