（温伟盛）科技论文

植物提取物配伍发酵对枯草芽孢杆菌溶纤活性的影响温伟盛 吴恩法 廖宏（华南农业大学食品学院，广州 510642）摘要：通过对一系列中草药、水果、蔬菜的提取液并按一定的稀释度对纳豆杆菌共发酵，测定其所得的纳豆激酶的活性大小，筛选出能极大地提高纳豆激酶活性的共发酵材料。结果表明稀释10倍的绞股蓝浸提液和白萝卜汁液，苹果汁原液，苹果、雪梨、和草莓按的比例混合的原汁液对纳豆杆菌的产纤溶酶活的影响较大，几乎为空白对照的两倍，效果明显，其中以绞股蓝的正面作用最为突出。关键词：纳豆菌 发酵 纳豆激酶 纳豆作为一种日本传统功能性保健食品，不仅具有独特的风味和丰富的营养价值，而且还具有许多生理学功能1，例如溶纤活性、抗菌、减少骨质疏松、抗癌、提高蛋白质消化率、调整肠功能等2。纳豆是由纳豆菌发酵大豆生产，发酵过程中纳豆菌产生一种纤溶活性激酶，对中老年人的心血管疾病的预防和治疗具有很好的保健功效。本试验试图通过从一系列中草药、水果、蔬菜的提取液中与纳豆枯草芽孢杆菌共发酵，试图从中筛选出可促进纳豆菌产纳豆激酶的材料，为进一步研究提供科学基础。1 材料与方法11 材料与设备纳豆枯草芽孢杆菌(MBS04-6)，华南农业大学食品学院微生物实验室保存。市售的中草药（姜黄、绞胶蓝、白果、山楂、银杏叶、桃仁、益母草、黄精、五味子）、水果（苹果、雪梨、葡萄、草莓、西瓜、橙、香蕉）和蔬菜（大白菜、芹菜、蒜头洋葱、番茄、胡萝卜、白萝卜）。凝血酶（三九集团昆明白马制药有限公司）、冷干人纤维蛋白原（上海莱士血制品有限公司）及其他国产分析纯试剂。12 实验方法121培养基营养琼脂培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NaCl0.5%,琼脂2%，121、20min灭菌。种子培养基：蛋白胨1%，酵母膏0.5%，NaCl0.6%,葡萄糖0.5%；121、20min灭菌。基础培养基：可溶性淀粉2%，蛋白胨1%，CaCl20.02%,MgSO40.04%,KH2PO40.1%,K2HPO40.1%； 121、15min灭菌。发酵培养基（豆乳培养基）：豆乳10mL+基础培养基10mL+蒸馏水20mL（分别灭菌后在无菌条件下加入并混合）122 工艺流程 菌种活化扩大培养接种植物汁液提取稀释 巴氏灭菌黄豆清洗精选浸泡打浆过滤豆乳灭菌基础培养基 测NK活性 摇瓶发酵保藏冻干13 实验方法 131 纳豆枯草芽孢杆菌的保存与活化纳豆枯草芽孢杆菌斜面菌种置于4冰箱里保存，并且每23个月转种保藏一次。菌株使用前先用营养琼脂培养基活化培养24小时。132 扩大培养无菌条件下挑取斜面菌种两环到装有50mL(250mL三角瓶)种子培养基的三角瓶中，37、200rpm摇瓶培养24小时。133 豆乳、中草药、水果及蔬菜提取液的制取 豆乳：将大豆洗净，除去杂质，用蒸馏水浸泡12小时后，放进打桨机（每次500ml蒸馏水、50g干大豆），打豆桨后过滤两遍，105、5min灭菌。中草药：每种取10克，放入水100mL，温火褒半小时，然后把所得的药液过滤，后把滤液过滤，再把滤液按梯度稀释原溶液10倍，100倍，加上本身的原溶液，各取出10mL放入试管中，即得到三支都为某种中草药的10ml的原溶液、1：10的稀释液、1：100的稀释液。用塞子塞好，75水浴30秒。水果或蔬菜：每种称取一定量，加入相等质量的蒸馏水放入到打桨机内打桨，再把所得液过滤。然后按梯度稀释原溶液的10倍、100倍，加上本身的原溶液，各取出10ml放入试管中，即得到三支都为某种水果或蔬菜的10mL的原溶液、1：100的稀释液、1：100的稀释液。用塞子塞好，灭菌温度同上中草药的处理。134 发酵培养无菌条件把10ml提取液加入至装有40ml（250mL三角瓶）发酵培养基的三角瓶中，并接种入种子培养液（2.5mL）。放于37，200rpm摇瓶培养72小时。135 纳豆激酶活性测定1351 试剂0.1M磷酸盐缓冲溶液（pH7.8）纤维蛋白原溶液：用上述缓冲溶液配成，浓度0.4%凝血酶溶液：用上述缓冲配制而成，浓度为10U/mL琼脂粉溶液：用上述缓冲溶液配成，浓度为3%尿激酶溶液：用上述缓冲溶液配制而成不同浓度1352 纳豆激酶的标准曲线的制作将10mL3%的琼脂粉溶液置于微波炉中溶化至透明后，自然冷却到50左右，同时在50水浴中加热纤维蛋白原溶液10mL,待纤维蛋白原溶液呈现乳白色，与冷却至50琼脂粉溶液混合，摇匀，快速加入0.5mL凝血酶溶液，迅速混匀倒入平皿（f=9cm）。凝固后打孔（6孔/皿）。取尿激酶（1万单位/瓶）倍比稀释至5000、2500、1250、625、321.5U后，分别20L流入纤维蛋白平板的小孔内，于37温育18小时后，倒适量10%三氯乙酸溶液于平皿中，作用30分钟终止反应。用游标卡尺测量透明圈相互垂直的两个直径和孔的直径，分别计算两者面积。以透明圈和小孔面积之差（S-s）的对数值为横坐标，尿激酶酶活单位（U）的对数数值为纵坐标作图，即得尿激酶标准曲线和酶活计算公式3。1353 纳豆激酶的活性的测定采用上述方法制作好纤维蛋白平板后，将发酵液加入孔中（20L/孔，每瓶发酵液分别在三个皿上各滴一孔），于37保温18小时后取出，倒适量10%三氯乙酸溶液于平皿中，作用30分钟终止反应。用游标卡尺测量透明圈相互垂直的两个直径。将计算出的透明圈面积代入由标准曲线所得的酶活计算公式，即可得到纳豆激酶活性值4。2 结果与分析21 尿激酶的标准曲线22中草药提取液对MBS04-6的产酶活力的影响如表1可见，不同的中草药浸提液对MBS04-6的产酶活力有较大的影响，同一种中草药其浸提液浓度不同，对发酵液的纤溶性酶活性也有较大影响，五味子的100倍稀释液、绞股蓝原液及10倍稀释液对共发酵液MBS04-6的产酶活力具有正向促进作用，其中绞股蓝10倍稀释液效果最好，发酵液酶活达2143.0 U.mL-1，是对照的4.6倍；而白果、山楂、黄精和益母草对MBS04-6产纤溶酶活性具有明显的抑制作用，有的还完全抑制酶的表达。可能与这些中草药中的某些生物活性物质抑制菌体的生长繁殖，从而影响纳豆芽包杆菌的产酶能力有关。图1：尿激酶标准曲线表1：中草药浸提液对MBS04-6产纤溶酶活性的影响（单位：U.mL-1） 样品稀释倍数五味子银杏叶姜黄绞股蓝白果山楂黄精益母草空白1060.5401145.780.90201.229.69463.881087.19361.60434.82143.0063.500463.881001013.3473.890317.2500069.62463.88 图2：不同稀释倍数的绞股蓝浸提液对MBSO4-6产纤溶酶活性的影响由图3可见，稀释1倍和倍的绞股蓝浸提液能提高产酶活力，尤以稀释10倍的绞股蓝浸提液的影响效果较为明显，其发酵液酶活力达到空白对照的4.6倍。但稀释00倍的绞股蓝浸提液反而降低纤溶酶活力，可能是因为绞股蓝浸提液浓度降低，其本身的纤溶能力下降，从而使得发酵液整体的纤溶能力降低。23 果蔬汁提取液对MBS04-6的产酶活力的影响 A3D3E3B3A3F3D3E3B3F3图3：几种果蔬汁共发酵液纤溶酶活性（左图：A-香蕉、B-洋葱、D-胡萝卜、E-白萝卜、F-桔子，右图：A-苹果、B-雪梨、C-草莓、O-空白；1、2、3分别表示稀释度为1：1、1：10和1：100；）由表2可知，果蔬汁原液中白萝卜汁和橙汁能对发酵液酶活正向促进作用最强，其酶活分别是对照的2.1倍和1.5倍； 果蔬汁10倍稀释液中，对MBSO4-6 产酶活力起正向促进作用的只有白萝卜和洋葱，而番茄、香蕉、胡萝卜和橙的汁液对纤溶酶活觉有不同程度的抑制作用，其中番茄对产纤溶酶活性的抑制作用最为明显，其发酵液酶活只有空白对照的0.58%；稀释100倍的果蔬汁液中，香蕉汁和橙汁对纤溶酶活性具有正向促进作用，胡萝卜汁具有明显的抑制作用，其余果蔬汁对产纤溶酶活性的影响不太明显。表2： 不同稀释度的不同果蔬汁液对MBSO4-6产纤溶酶活性的影响（U.mL-1）样品稀释倍数香蕉洋葱 番茄胡萝卜白萝卜橙空白11873.304846.54372.811581.78216.95518.31/10124.89613.332.2909.59680.54665.85518.31/1007398.96023.73143.0675.65225.97537.45518.3图4：不同稀释倍数的白萝卜汁液对MBSO4-6产纤溶酶活性的影响（U.mL-1）由图4可见：白萝卜汁液稀释10倍对产酶活力的影响较为明显，达到空白对照的2.1倍。表3：水果汁液对MBSO4-6产纤溶酶活性的影响（U.mL-1）样品稀释倍数苹果雪梨草莓空白图5：水果汁液对MBS04-6产纤溶酶活（三个稀释度汁液共发酵液酶活之和）的影响由表3可见，在高浓度下，苹果和草莓对产纤酶活力有正面影响，在三种浓度下加雪梨汁液的效果都不明显，反而有抑制作用。从总的影响来看，只有加苹果汁液的发酵液酶活大于空白对照的三倍，所以得出苹果是较理想的目的样品。由图6所示，苹果、雪梨、和草莓按1：1：1的比例混合的原汁液对MBS04-6的产纤溶酶活的影响较大，而且发酵液的酶活达到4643 U.mL-1大于只加苹果原液时发酵液的酶活（4250 U.mL-1）。在考虑到发酵液风味的情况下，这种混合汁液也是不错的选择。图6：苹果、雪梨、草莓混合汁液对MBSO4-6产纤溶酶活性的影响3 结果与讨论经过比较和筛选，我们得出稀释10倍的绞股蓝浸提液和白萝卜汁液，苹果汁原液，苹果、雪梨、和草莓按1：1：1的比例混合的原汁液对MBS04-6的产纤溶酶活具有较好的正向促进作用，其共发酵液酶活分别是空白对照酶活的4.6倍、2.1倍、1.66倍和1.8倍。其中以绞股蓝的正面作用最为突出。微生物由于自身存在丰富的酶系而有着在温和条件下分解转化物质的能力。通过微生物与中草药共发酵来进行中药炮制可以比一般的物理化学手段更大幅度地改变药性和，提高药效，降低毒副作用，扩大适应。而果蔬十人们日常生活中不可缺少的食品，它可能含有一种人体内纤溶酶原激活剂，将纤溶酶原激活为纤溶酶，继而起到溶解血栓的作用。这样具有直接溶纤能力的纤溶酶和间接纤溶能力的中草药浸提液和果蔬汁液如果共同作用于人体内的血栓，可以起到双管齐下的良好效果。因此，如果把绞股蓝或果蔬按一定的比例来与纳豆杆菌共发酵可以明显地