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食品安全检测技术 教育部食品营养与安全重点实验室天津科技大学食品工程与生物技术学院张燕yzhang Tel 022 60601430 食品安全的检测对象 农药 兽药 生物毒素 食品添加剂 非食用添加剂 违禁成分 持久性有机污染物 加工产物 致病菌 食品安全检测技术分类 仪器分析 化学分析 生化分析 免疫分析 定性 定量 在线监测 仪器方法的检测流程 样品采集 提取净化索氏提取 液 液 固 液 微波 超声 柱层析等 仪器分析根据目标物的性质选择不同方法 仪器检测技术 痕量无机物定量 无机元素形态分析 气相色谱或液相色谱 电感耦合等离子体质谱联用 电感耦合等离子体质谱 ICP MS 原子发射光谱 AES 原子吸收光谱 AAS 毛细管电泳 质谱 CE MS 气相色谱 串联质谱 GC MS MS 色谱 液相色谱 气相色谱 俄国植物学家Tswett于1901年发现 利用吸附原理分离植物色素 1906年Tswett创立 chromatography 色谱法 新名词 1907年在德国生物会议上第一次向世界公开展示显现彩色环带的柱管 1930年R Kuhn用色谱柱分离出胡萝卜素 色谱分析法的历史 1935年AdamsandHolmes发明了苯酚 甲醛型离子交换树脂 进一步发明了离子色谱1938年Izmailov发明薄层色谱1941年Martin Synge发明了液 液分配色谱1944年Consden Gordon Martin发明纸色谱1952年Martin Synge发明气 液色谱1953年Janak发明气 固色谱1954年Ray发明热导检测器1955年世界第一台商品化气相色谱仪1957年Martin Golay发明毛细管色谱1959年Porath Flodin发明凝胶色谱1960年液相色谱技术完善 高选择性分离单组份定性定量高效能高灵敏度检出限量低至10 1lg的物质 适于微量和痕量分析 色谱法的特点 气相色谱分析 系统构成气路系统 进样系统 分离系统 检测系统工作原理样品高温瞬间汽化 色谱柱分离 检测适用易挥发的小分子有机物难挥发性成分经衍生化检测 气相色谱 分离系统 色谱柱填充柱 毛细管柱色谱柱选择 按样品极性弱极性样品 可选OV 1 SE 30 OV 101 SE 52 SE 54中极性样品 可选OV 17 OV 1701 XE 60 OV 225 OV 210极性样品 可选PEG 20M FFAP OV 275 DEGS 气相色谱 检测系统 氢火焰离子化检测器 FID 破坏型含碳的有机物电子捕获检测器 ECD 非破坏型 选择性电负性强的化合物火焰光度检测器 FPD 破坏型 选择性含硫磷的化合物热导池检测器 TCD 非破坏型 选择性永久性气体 气相色谱在食品安全检测中的应用反式脂肪酸的检测 衍生 FID 苯 氯苯 氯酚类 直接进样 FID 有机氯农药 ECD 有机磷农药 FPD 气相色谱分离与质谱定性定量结合1 对食品中残留物进行分析MS是一个通用型检测器 对大多数有机化合物都有比较好的响应 根据特征离子强度定量多种成分的同时分析 残留分析的趋势之一适合大批量农残检测 2 对未知物分析准确测定未知组分的相对分子质量 气相色谱与质谱的联用分析 增塑剂邻苯二甲酸酯类 食品中42种农药的气相色谱 质谱选择离子测定样品处理方法液液萃取 固相萃取联用 样品中农药经二氯甲烷提取后 Envi Carb柱和Sep Pak NH2柱双柱净化 净化后直接进样分析色谱条件色谱柱 HP 5MS 30m 0 125mm 0 125 m 载气 高纯氦气 流量1ml min 柱温 70 保持2min 以25 min升至150 再以3 min升至200 再以8 min升至260 保持10min 进样口温度 250 进样方式 不分流进样 1 15min后打开分流阀和隔垫吹扫 质谱条件离子源 EI 温度 230 电子轰击能量70ev GC MS接口温度 280 分析特征量42中农药的线性范围 0 001 1 0 g mL样品的加标回收率 89 94 RSD 10 方法的最低检出限 0 001 0 005mg kg S N 3 检测农药种类有机磷 拟除虫菊酯 有机氯 氨基甲酸酯和除草剂检测的样品种类肉类 蛋类 乳品 蔬菜和水果 加速溶剂萃取 气相色谱质谱联用法测定食品中指示性多氯联苯样品前处理加速溶剂萃取 固相萃取联用 加速溶剂萃取条件压力 10Mpa 1500psi 温度 125 加热时间 6min 稳定时间 5min 清洗体积 占萃取池体积的60 吹扫时间 120s 静态循环次数 2次 固相萃取柱 酸性硅胶柱和碱性硅胶柱联用 色谱条件HP 5MS毛细管色谱柱 30m 0 125mm 0 125 m 进样口温度 300 升温程序 初始温度100 保持2min 以15 min升温至180 以3 min升温至240 再以10 min升温至285 保持10min 载气 氦气 流速1ml min 进样 不分流进样 1 L质谱条件电子轰击 EI 离子源 70eV 接口温度 280 离子源温度 250 四级杆温度 100 定量方式 选择离子监测 SIM 分析特征量最低检测限 水产品0 1051 0 1286 肉松0 1003 0 1146 g kg添加回收率 86 4 125 1 RSD在1 1 19 6 之间检测的目标有害物质20种多氯联苯检测的样品种类水产品 肉松 高效液相色谱法 高效液相色谱仪的应用 分离热不稳定和非挥发性的 离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质 苏丹红三聚氰胺合成色素生物毒素敌敌畏双酚A GB T5009 99 2003食品容器及包装材料用聚碳酸酯树脂卫生标准的分析方法我国的卫生标准规定碳酸酯树脂和成型品中酚 蒸馏水 回流6h 的溶出量不大于0 05mg kg 是采用滴定的方法对溶液中游离的酚进行定量计算 欧盟欧盟2002 72 EC法则规定双酚A在塑料食品接触材料中的迁移限量为3mg kg 欧盟采用液相色谱对双酚A的迁移量进行检测 检出限为0 2 0 7mg kg 美国美国食品与药品管理局 FDA 规定双酚A可作为食品接触材料的原料使用 EPA 1993 规定最大可接受剂量或者参考剂量是0 05mg kg bw 日本 食品卫生法 规定聚碳酸酯食品容器中的双酚A溶出限量为2 5mg kg 液质联用HLPC MS 以液相色谱作为分离系统 质谱为检测系统 样品在液相色谱部分分离 经质谱离子化 质量分析器将离子碎片按质量数分开 经检测器得到质谱图 色谱和质谱优势结合 应用广泛 适用于高沸点 大分子 强极性和热稳定性差的化合物的分析 适于复杂基质样品 特别是食品 生物样品中的农兽药残留的定性定量分析 利于多组分分析 样品前处理液液萃取 固相萃取 样品经过乙腈和二氯甲烷提取后 过C18固相萃取柱净化色谱条件色谱柱 AgilentSB C18 211mm 10mm 1 18 m 柱温 50 进样量 20 L 流动相A 0 1 甲酸 10mmol L乙酸铵 流动相B 乙腈 流速 0 13mL min 梯度洗脱条件 0 4min A由99 变化至50 4 15min A由50 变化至40 15 20min A由40 变化至20 20 25min A由20 变化至1 25 30min A保持1 30 35min A由1 变化至99 后运行8min 液相色谱 质谱联用对复杂食品基质中407种多农药残留量的测定 质谱条件电离源模式 电喷雾离子化电离源极性 正模式雾化气 氮气雾化气压力 2 18 105离子喷雾电压 4000V干燥气温度 350 分析特征量407种农药的线性范围为0 5 500 g L RSD 10 检测目标有害物多效唑 乙草胺等407种农药检测的样品苹果 蜂蜜 谷物和肉类 多环芳烃FDA提出有威胁的多环芳烃主要有16种 欧盟指令2005 69 EC对轮胎橡胶中的8种PAHs的含量提出了法规上的要求 8种物质之和不超过10mg kg 其中 BaP 苯并芘 不得超过1mg kg 电泳技术和现代微柱分离相结合的分析技术高分辨率 高速度 样品用量少 成本低非常适合水溶性或醇溶性成分的多组分分离分析应用领域化学 生命科学 临床医学和药学 特别是药物分析和分离方面得到广泛的应用 目前在食品中功能成分的分析和添加剂的检测等方面有广泛的应用 高效毛细管电泳色谱 色谱条件毛细管柱 有效长度为 45cm内径 50um缓冲液 硼砂20mmolL 1 SDS5mmolL 1pH7 8检测波长 214nm分离电压 15KV分析特征量样品添加回收率 97 102 RSD 5 线性范围 0 125mgmL 1至1mgmL 1最低检出限 0 05mgmL 1 高效毛细管电色谱 分析实例1 高效毛细管电泳法短时内同时测定咖啡因 山梨酸 苯甲酸 糖精的含量 样品前处理C18固相萃柱富集净化色谱方法毛细管柱 熔融石英毛细管有效长度75cm 内径75um缓冲液 50mMNaAc HAc 10 ACN pH5 0分离电压 20KV检测波长 254nm 高效毛细管电色谱 分析实例2 固相萃取和毛细管区带电泳法测定磺酰脲除草剂 分析特征量线性范围 0 2 50mgL 1 最低检测限 0 05 0 10mgL 1样品添加回收率 65 103 RSD 5 检测的目标物醚磺隆 醚苯磺隆 苯磺隆 噻磺隆 甲磺隆和绿磺隆检测的样品饮用水 高效毛细管电色谱 分析实例2 CE与MS相结合可为复杂的生化 环境等样品的定性 定量分析提供强有力的工具M Hugener等采用CEC ESI MS对食品中的色素和芳香葡萄糖苷酸进行分析Gucek等采用毛细管电色谱 电喷雾质谱 CEC ESI MS 对肽的混合物进行分析 检测灵敏度可达到阿摩尔 attomole 级 毛细管电色谱质谱联用技术 电感耦合等离子体质谱 上世纪80年代初建立的一种将等离子体与四级质谱仪相连接的分析仪器 电感磁场与氦气作用产生高达7000K的高温等离子体 基本上能使所有元素电离成单电荷的离子 然后进入质谱仪 定性和定量检测各种一定质荷比的离子 灵敏度高 一般检出限可达ppb级线性范围宽 一般浓度范围跨越五个数量级选择性高 元素之间测定相互干扰少操作快速 并能进行多元素分析有同位素信息在一定质量数范围内 仪器能提供稳定均匀的响应 电感耦合等离子体质谱 主要特点 应用 ICP MS已广泛应用于生物样品 环境样品 药物样品 食品样品和稀土元素等方面的分析研究利用ICP MS测定饲料中的铜 锌 铁 锰 铬 镉 铅 砷和硒等微量元素 回收率在86 115 检出限达到10 9级 其他类串联质谱检测新技术 全二维气相色谱 飞行时间质谱 全二维气相色谱飞行时间质谱仪把分离机理不同而又互相独立的两根色谱柱通过一个调制器 以串联方式结合成二维气相色谱 优点 提供更高的峰容量组分的分离和检测灵敏度提高 采用适当的色谱操作条件 可以得到包含结构信息的二维结构谱图 辅助定性 全二维气相色谱 飞行时间质谱的应用 精油组成成分的分析Adahchour等采用顶空固相微萃取和GC GC对大蒜挥发性香味成分进行了分析 发现了大蒜中更为详尽的具有芳香活性的组分 环境 生物和食品样品中的应用Liu等用GC GC方法在4min内完成了15种农药的分离 并将GC GC用于人血清中农残的研究 季克良等采用GC GC方法 酱香型白酒分出963个峰 浓香型白酒分出674个峰 清香型白酒分出484个峰 其他类串联质谱检测新技术 超高效液相色谱 飞行时间质谱UPLC采用了1 7 m的小粒径色谱柱填料 与传统的HPLC相比有更好的分离效率 峰容量以及灵敏度 pg fg级 其他类串联质谱检测新技术 高分辨飞行时间质谱能够测定化合物的精确质量 并具有MS MS功能 两者联用成为复杂体系分离分析以及化合物结构鉴定的良好平台 快速检测技术 快速检测技术与仪器分析技术共同构成食品安全检测技术体系 1 以免疫检测为主的快速检测技术成为食品安全监管中的主要应用技术2 便携式 高集成度的快速检测装备是食品安全快速检测技术研发重点3 以芯片技术为代表的新型高通量快速检测技术发展迅速 免疫分析技术 原理基于抗原 抗体的特异性识别和结合反应的分析方法 通过对抗原或抗体进行标记 酶 荧光物质 放射性同位素标记等 利用标记物的信号放大作用 与现代测试技术相结合 对样品中特定的目标物进行定性定量检测 方法建立 半抗原合成人工抗原合成抗体制备方法建立样本前处理方法方法评价特点特异性强 灵敏度高方便快捷 分析容量大 检测成本低可提供系列化的产品以及技术 产品可以商业化 免疫分析检测技术 酶联免疫分析技术 ELISA 抗原抗体特异识别反应与酶的催化放大作用相结合 酶的相应底物呈颜色反应 颜色深浅与待测标本含量成比例 标准曲线定量 1 双抗体夹心法 特点 非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原 而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇 2 间接法 3 竞争法 免疫分析检测技术 膜载体免疫分析 试纸条定性检测技术 其特点是以微孔膜作为固相载体 标记物可用酶或各种有色微粒子 定性地判别出样品是否含有某种有害物 含量是否超过规定标准 试纸条技术 酶标记免疫检测 以酶作为示踪标记物 胶体金标记免疫检测 以胶体金作为示踪标记物 免疫分析检测技术 免疫传感器将高灵敏的传感器技术与特异性免疫反应相结合的一种新型生物传感器 利用生物活性物质 如酶 抗原 抗体 细胞 组织等 或分子印迹聚合物作为传感器的识别元件识别元件与样品中的待测物质发生特异性反应 通过适当的换能器将这些反应 形成复合物 发色 发光等 转换成可以输出检测的信号 电压 频率等 特点 选择性及抗干扰能力强 响应快实时监测到表面的抗原 抗体反应 免疫分析检测技术 应用 农药 有机磷 拟除虫菊酯类 有机氯类 氨基甲酸酯类兽药类生物毒素致病菌 将捕获配基密集点阵于某一介质载体上即形成所谓的探针 利用配基与待检测样品中目标分子的特异性结合 再通过各种检测设备对实验结果进行定性或定量分析 主要应用 食品中真菌毒素的检测食品中抗生素残留的检测食品中农药残留的检测食品中病原微生物的检测 蛋白质芯片技术 免疫分析检测技术 定性方法 荧光增白剂 紫外线照射甲醛 二氧化硫 常规化学方法 液液萃取固相萃取技术 SPE 固相微萃取技术 SPME 液相微萃取技术 LPME 快速溶剂萃取技术 ASE 基质固相分散萃取技术 MSPDE 超临界流体萃取技术 SFE 亚临界水萃取技术 SWE 样品前处理技术 食品安全控制 食品安全法实施条例第二十七条食品生产企业应当就下列事项制定并实施控制要求 保证出厂的食品符合食品安全标准 一 原料采购 原料验收 投料等原料控制 二 生产工序 设备 贮存 包装等生产关键环节控制 三 原料检验 半成品检验 成品出厂检验等检验控制 四 运输 交付控制 从农田到餐桌 的全程控制 从种植 养殖到餐桌这一整个食品链条中 每一个环节都是食品安全的关键 原料生产 食品加工 包装 贮运 销售 餐桌 一 原料的安全性控制 二 食品加工过程的质量控制 三 包装 贮运过程的安全控制 食品安全全程控制体系 基础知识 GMP TQC SSOP SCPHACCPISO9000和ISO14000系列行之有效的食品卫生与安全质量控制的保证制度和保证体系 GMP的概念 GMP GoodManufacturingPractice 注重制造过程中产品质量和安全卫生的自主性管理制度 以现代科学知识和技术为基础 应用先进的技术和管理的方法解决食品生产质量问题和安全卫生问题 不仅针对食品企业 应贯穿于食品原料生产 运输 加工 储存 销售 使用的全过程 因此GMP是实现食品工业现代化 科学化的必备条件 是食品优良品质和安全卫生的保证体系 GMP的发展 食品卫生通则 CAC RCP1969 发布以来 一直作为国际上整个食品链 从农场到餐桌 的必要卫生原则 也是各国政府建立食品行业相关法律法规的依据 因此 为了保证食品安全 各国政府根据食品法典 食品卫生通则 相继制订了相关的法律法规 以达到对食品卫生有效控制的目的 中国GMP的发展 1994年 我国卫生部按照 食品卫生法 的规定 参照联合国粮农组织 世界卫生组织 FAO WHO 食品法典委员会 食品卫生通则 CAC RCPRev 2 1985 结合我国国情制订了 食品企业通用规范 GB14881 1994 作为我国食品企业必须执行的国家标准发布 包括19个食品加工企业卫生规范 例如 乳品厂卫生规范GB12693 1990保健食品良好操作规范GB17405 1998 中国食品良好操作规范 食品企业通用卫生规范 GB14881 1994 规定了我国食品企业在原料采购 加工 运输 贮藏 工厂设计与设施的基本卫生要求及管理准则 其包括以下7个要素 中国食品良好操作规范 1 原材料采购 运输的卫生要求 2 工厂设计与设施的卫生要求 3 工厂的卫生管理 4 生产过程中的卫生要求 5 卫生和质量检验的管理 6 产品贮藏 运输的卫生要求 7 个人卫生与健康的要求 GMP的内涵 GMP的中心思想是任何食品质量的形成是设计和生产出来的 而不是检验出来的 因此食品质量体现在从原料到餐桌的全过程中的操作GMP的本质上是以防为主 预防性的 质量管理 必须强调预防为主的原则 在生产过程中建立保证体系 实施全面质量保证 确保食品质量 TQC的概念 为了保证食品质量 则必须实施全面质量管理 TotalQualityControl TQC TQC是以质量为中心 由领导层负责 全员参与的生产经营全过程的管理 全面质量管理中的 全面 是指产品质量形成的全过程 而不是只注重加工过程 从过去的事后检验 把关 为主转变到以改进为主从管 结果 转变为管 因素 找出影响质量的各种因素 抓住主要因素 发动全员 各部门参与 运用科学管理程序和方法 使生产经营所有活动均处于受控状态 TQC的概念 SSOP和SCP SCP SanitationControlProcedure 控制 SSOP SanitationStandardOperatingProcedure 操作 采取有效的卫生控制程序 SCP 能充分保证达到GMP的要求 通过卫生标准操作程序 SSOP 的实施 以消除与卫生有关的危害 制度通过操作实施 SSOP文本是由食品生产企业自己编写 但编写SSOP时应以GMP为基础 以保证可操作性 以法律为依据 通过企业的SSOP实施达到GMP的要求 HACCP的概念 HACCP 指危害分析和关键控制点是 HazardAnalysisandCriticalControlPoint 的缩写 是一套完整的预防性食品安全质量控制体系 HACCP的作用 HACCP通过对原材料 包括加工用水及空气 及整个加工工艺甚至消费者的消费过程进行危险性分析 确定需要控制的关键环节 然后在生产中按照GMP进行重点控制 HACCP法将重点放在对所有的原料和所有的加工步骤都得到严格的质量控制上 以确保最终制成品的安全性 HACCP的基本步骤 1 危害分析和预防措施2 确定关键控制点 CCP 3 确定关键限值4 关键控制点监控5 纠偏行动6 记录 保持程序7 验证程序 HACCP的特点 强调企业自身的作用 而不是依靠对最终产品的检测或政府部门取样分析来确定产品的质量HACCP是一种防预体系 不是零风险 严格按规定加工贮藏 产品将有符合规定的保质期 在问题出现之前就可以采取纠正措施 是积极主动型控制 HACCP在中国 20世纪80年代HACCP传入中国 上世纪90年代初原国家进出口商品检验局科技委的食品专业委 针对出口食品出现的安全问题 开展了 出口食品安全工程的研究 在出口的冻鸡肉 冻猪肉 冻对虾等8种商品中采用HACCP原理进行控制安全的研究 并制订了GMP 这是HACCP在中国首次应用 ISO9000 为适应国际间贸易发展的需要 国际标准化组织 InternationalStandardizationOrganization ISO 于1987年颁布ISO9000质量管理和质量保证标准系列ISO9000是企业产品进入世界市场的通行证1988年我国等效采用ISO9000标准系列 1992年10月13日又修订为GB T19000标准系列 其中GB为国家标准 T为推荐标准 ISO14000 1993年6月 环境管理技术委员会ISO14000系列标准通过制定和实施一套环境管理国际标准来减少人类各项活动造成的环境污染 节约资源 促进社会可持续发展 食品企业不仅要通过GMP认证和ISO9000体系认证 且要通过ISO14000体系认证 拿到产品进入世界市场的 绿色通行证 小结 HACCP是一个食品卫生安全防预控制系统 但不是事后的检测体系 是建立在GMP SSOP SCP和TQC基础上实施的一个预防系统 GMP SSOP SCP和TQC是操作程序或控制程序 是实施HACCP的基础 ISO是条件性的技术标准 是公司之间商务活动的证明书 食品安全全程控制体系 应该包括GMP TQC SSOP SCP HACCP和ISO等内容 一 原料的安全性控制 1 食品原料的安全性问题 1 食品原料生产环境对食品安全影响食品原料生产环境对食品安全生产起决定性的作用 工业三废 农药大气 水体 土壤及动植物的污染原料生产不安全 2 食品原料生产中的农业投入对食品安全的影响各种农业生产资料 如化肥 农药 兽药 种子饲料 3 食品原料生产的过程中 生产管理的方法及生产者的意识对食品原料安全的影响生产者对食品原料安全意识较差 有意使用违禁药物对食品原料造成安全隐患 2 食品原料安全控制研究主要涉及的问题 化肥 农药残留 抗生素 激素与有害物质残留 病疫性生物污染 动植物中的毒素和过敏污染 转基因食品原料 3 食品原料生产安全控制 要实现食品原料安全的控制 首先要建立标准化的种植 养殖体系 必须从土壤 空气和水体等基本条件入手 控制产地生产环境 从种苗供给 种植 养殖过程控制 病虫害防治 到产品收获均采用统一规范 从而使食品原料符合食品生产与食品安全的要求 欧美与日本的苹果生