甘油含量测定.doc

嗯。你都问到这个问题了，具体仪器、操作什么的我就不说了。就说一下思路。强碱条件下甘油和二价铜的络合物显绛蓝色，所以利用甘油的这个特性就可以轻松搞定。主要试剂是AR级的甘油、氢氧化钠、硫酸铜。向氢氧化钠碱化的甘油溶液里加硫酸铜，一定要保证甘油被完全络合，并且保证多余的二价铜都以氢氧化铜沉淀形式存在，但是氢氧化钠也不要加太多。甘油铜可见区最大吸收波长是在630nm。先作个标准系列，绘出吸光度-浓度曲线，然后把待测试样吸光度测出来在标准曲线上一算，浓度就得到了。氢氧化铜解离出来的铜离子在630nm处也有吸收，好在它是一个定值，测出来后从每个甘油的A里面扣掉就行了。甘油含量化学方法有很多，比色法，滴定法甘油在强碱性条件下，与Cu2+定量形成绛蓝色的甘油铜溶液。根据朗伯-比尔定律，溶液吸光度A与吸光物质浓度C成正比：A=kC。甘油配制浓度C1与衍生的分析甘油铜浓度C有如下关系：C=k1C1，k1为稀释系数，则吸光度值与甘油配制浓度有如下正比关系：A=kk1C1+，k、k1为常数，为系统误差。先根据吸光度与甘油配制浓度C1做出关系曲线:，然后确定最佳线性拟合范围，最终得出拟合线性方程，程序化后，用于甘油含量的快速测定。供应 拜发甘油检测试剂盒发布日期：2010-9-21截止日期：2009-5-9拜发甘油检测试剂盒（酶学试剂盒）订货号： 10148270035产品名称： 甘油（Glycerol）产品英文名称： Glycerol包装： Ca.3x11tests产品介绍： 如下产品说明： Glycerol（用于检测食品中的甘油）酶法分析试剂盒（紫外分光光度法）RIDASCREEN（产品编号：0414433）30次检测1.简介酶法分析试剂盒（紫外分光光度法）此法适用于检测食品（啤酒、葡萄汁、醋、蜂蜜、酒精、果酒）、化妆品、药品（溶液、栓剂）、纸板、烟草及生物制品中的甘油。2.原理甘油在甘油激酶的催化下可被ATP磷酸化为3-磷酸甘油酯，ATP转化为ADP；反应式为GKGlycerolATPL-glycerol-3-phosphateADP上式中形成的ADP在丙酮酸激酶的催化下可与PEP作用下生成ATP及丙酮酸酯；反应式为PKADPPEPATPPyruvate丙酮酸酯在L-乳酸酯脱氢酶的作用下可被NADH还原为L-乳酸酯，NADH被氧化为NAD；反应式为L-LDHPyruvateNADHHL-lactateNAD被氧化的NADH的量取决于甘油的量，NADH的吸光度值可在334，340及365nm下测量。3.试剂盒内容物瓶1共有3瓶，每瓶约有2g辅酶及缓冲液的混和物，包括：甘氨酰甘氨酸缓冲液，PH约7.4；NADH约7mg；ATP约22mg；PEP-CHA约11mg；硫酸镁瓶2约0.4ml悬浮物，包括：丙酮酸激酶，约240U；L-乳酸酯脱氢酶，约220U瓶3约0.4ml甘油激酶悬浮物，约34U瓶4为甘油检测对照溶液（甘油检测对照溶液可不需要计算结果），此溶液使用时不需稀释。（效期见标签）4.检测溶液的制备（10次）取出1瓶瓶1，用11ml重蒸水溶解，使用时此溶液需在20-25持续回温约10分钟瓶2不需稀释瓶3不需稀释5.操作者应该注意之事项使用前请仔细阅读，中文翻译件仅供参考瓶1约含500mg碳酸钠，应避免接触皮肤和呼吸器官，其他用于甘油检测的试剂不具有危险性实验之后，用过的试剂可作为实验室废料处理，但必须在当地法规允许的前提下6.储存条件瓶1在2-8下保存（见标签），溶液1在2-8下可保存4天，溶液1使用前需回温至20-25瓶2及3在2-8下保存（见标签）7.样品处理直接取用无色，透明，中性的溶液或按稀释表格稀释后进行检测，体积为2.000ml过滤混浊溶液除去样品溶液中的二氧化碳气体加入氢氧化钠或氢氧化钾来调节酸溶液的PH值约为8对于深颜色的样品溶液可不需稀释或者用PVPP或酰胺配成较高浓度的溶液如：1g/100ml粉碎或均质固体和半固体样品，用水抽提或溶解，而后过滤，通过Carrez澄清液可脱去其中的混浊物或色素用Carrez试剂可脱去样品中的蛋白质用热水抽提样品中的脂肪（抽提温度需在脂肪的溶解度之上），冷却后可分离出脂肪，将余下物质转移至容量瓶中并加水至刻度，冰浴15分钟而后过滤，热水抽提后用Carrez溶液澄清8.过程1.波长：340nm，Hg365nm或Hg334nm2.比色杯：光径1.0cm3.温度：20-254.最终体积：3.020ml5.对照空气（光路上无比色杯）或对照水读取读数6.样品溶液：1-40ug甘油/检测（体积为0.100-2.000ml样品体积）7.具体操作见如下表格移液 空白（ml） 样品（ml）溶液1样品溶液重蒸水悬浮物2 1.000-2.0000.010 1.0000.1001.9000.010混和，直至前反应完全反应后，约5-7分钟，读取吸光度值A1，而后加入下列物质：悬浮物3 0.010 0.010混和，等反应进行完全后（约5-10分钟），立即读取样品和空白的吸光度值A2如果在15分钟后反应尚未停止，则在2分钟的间隔内继续读取读数，直至此值不再变化。分别测样品与空白的吸光度值差，而后用样品吸光度值差减去空白吸光度值差可以得到如下公式A=（A1A2）Sample（A1A2）blank若想得到一个足够精确的结果，则测得的吸光度的单位至少为0.100单位。如果吸光度值差A在334及340nm下测得的值高于1.000或在365nm下测得的值高于0.500，如此则表明样品溶液中甘油的浓度较高。需根据稀释表格进行样品的稀释9.计算根据以下公式计算浓度VMWC=-A（g/l）dv1000V=最终体积（ml）V=样品体积（ml）MW=被检测物质的摩尔质量D=光径（cm）=NADH的消光系数340nm=6.3（1mmol-1cm-1）Hg365nm=3.4（1mmol-1cm-1）Hg334nm=6.18（1mmol-1cm-1）甘油含量计算遵循如下公式3.02092.1C=A1.000.10010002.781=A（g甘油/l样品溶液）如果样品溶液是稀释使用的，在计算结果时需乘以稀释系数F。当分析固体或半固体时，测量前需称一定重量配制样品溶液，其结果需按下式计算C甘油（g/l样品溶液）C甘油=100（g/100g）W甘油（在样品溶液中）10.检测操作说明被检样品中甘油含量在1ug至40ug之间。为了得到一个足够的吸光度值差，样品溶液的浓度最好稀释在0.04g/L至0.4g/L之间。稀释表格每升样品溶液中甘油估计量 用水稀释 稀释倍数0.4g0.4-4g4.0-40g40g -191991999 1101001000如果测得的吸光度值A较低，例如低于0.100，则样品溶液需重新配制，可由下列几种解决方法1.可多称出些样品或不要过分稀释。2.加入到比色杯中的溶液体积可增加至2.000ml，当然为了得到相同的最终体积（样品和空白），加入的水的体积就要相应减少。所加入的新溶液的体积在计算时是要考虑进去的。11.技术信息加入悬浮物2（PK/L-LDH）后等待前反应进行完全后是非常必要的。12.特性此法特异性适于甘油的检测。13.灵敏度和检测限1.最小的吸光分辨率为0.005个吸光单位，相应的最大样品体积为2.000ml，340nm下测量，则样品的甘油浓度为0.1mg/L；若样品体积为0.100ml，则样品的甘油浓度为2mg/L。2.340nm下，吸光度值差为0.020可导出检测限为0.4mg/L，相应的最大体积为2.000ml。14.线性从1ug甘油/检品（0.4mg甘油/L样品溶液，样品溶液V=2.000ml）到40ug甘油/检品（0.4g甘油/L样品溶液，样品V=0.100ml）15.精确性用同一样品溶液做平行测定时，其吸光度值差会有0.005至0.010的差异，样品体积为0.100ml，340nm下测量，相应的甘油浓度约为2-5mg/L；若样品是经过稀释的，则在计算结果时需乘以稀释倍数。16.干扰信息来源ATP和PEP的缓慢水解同NADH的缓慢氧化均可导致缓慢的蠕变反应；空白和样品的吸光度值可不必逐一立即检测。17.检测过程中的干扰1.根据过程中所给定的时间甘油若能转化完全，则可断定没有干扰发生。2.反应结束后，可加入一些甘油重新检测（定性或定量）：如果加入标准物质后，吸光度值会随之改变，则可断定没有干扰发生。3.操作过程中的错误和干扰可通过两个样品体积的平行实验测得（如0.100ml和0.200ml）：测得的吸光度值差应与样品体积成比例关系。当测定固体样品时，可称取不同质量（如1g和2g）于同一100ml容量瓶中，测得的吸光度值差及样品的质量应与样品的体积成比例关系。4.样品所含物质带来的可能干扰可通过加入内标来控制：除去样品、空白及标准的检测外，样品加检测对照溶液也要检测的，测得的吸光度值差可计算干扰。5.通过回收试验可测定可能的损失：分别测定加入标准与不加入标准的样品，在误差范围之内可定量测定附加物。18.Carrez试剂的澄清作用移取液体样品于盛有60ml重蒸水的100ml容量瓶中或称取足够重量的样品于100ml容量瓶中加入60ml重蒸水仔细加入5mlCarrez-溶液（85mM，3.60gK4Fe（CN）6*3H2O/100ml）和5mlCarrez-溶液（250mM，7.20gZNSO4*7H2O/100ml）用氢氧化钠调节溶液PH于7.5-8.5，加入每一溶液后需充分混和，加水至容量瓶刻度，混和并过滤19.应用举例1.果汁中甘油的检测稀释样品其浓度约在0.4g/L以下（见稀释表格）过滤混浊果汁，取用透明或淡色溶液用于检测当分析深色果汁时（如：草莓汁和红葡萄汁）需要先脱色具体操作在10ml果汁中加入0.1g酰胺粉末或PVPP搅拌1分钟后过滤取透明溶液用于检测，该溶液可带有轻微颜色2.酒中甘油的检测根据稀释表格将样品进行稀释实际上红酒不需脱色也可进行检测3.啤酒中甘油的检测取5-10ml啤酒用玻璃棒搅拌约1分钟，除去其中的二氧化碳气体根据稀释表格稀释脱去二氧化碳气体后的样品4.烟草制品中甘油的检测充分混合并绞碎样品精确称取1g样品于100ml容量瓶中加入约70mL水磁力搅拌约1小时20-25下，而后加水至刻度，混和并过滤移取25ml滤液于50ml容量瓶中加入5mlCarrez-溶液，5mlCarrez-溶液及10ml氢氧化钠溶液，在加入每一溶液后均需充人混和加水至刻度混和并过滤，取滤液用于检（0.100ml-0.500ml）5.化妆品中甘油的检测6.发酵产品及生物培养基中甘油的检测置样品（可先经过离心）于80水浴中15分钟以停止酶的反应离心并取上层溶液（可根据稀释表格稀释）用于检测另外可用高氯酸或Carrez溶液脱除蛋白质琼脂培养基需先均质，而后按以上方法进行操作。名称：甘油检测试剂盒编号：EK-GCROL货号：100001001Cas No：70购买：Glycerol Assay Kit(70 次测定)简介:甘油是一种非常重要的物质，广泛的应用于工业生产中，在食品工业中，常被作为保湿剂、增香剂和增色剂等使用，以改良食品的质量。甘油是酿酒酵母发酵过程中的副产物,也是灰质葡萄孢新陈代谢过程中的一个重要产物，甘油是高品质果酒的一个成分，高品质的葡萄汁中不含有(或只含有痕量或微量)甘油，浓度大约为1%(v/v)，若葡萄汁中含有甘油则意味着产品中使用了品质不好的原料。甘油也常常作为润滑剂用在洗涤液、乳酪和牙膏中，在制烟工业中，通过通常是预先向烟叶上喷洒甘油以保障不会粉碎的目的。原理:甘油在甘油激酶(GK)的作用下被磷酸化，消耗ATP转化成L-3磷酸甘油（L-glycerol-3-phosphate）。(1) Glycerol + ATP (GK) L-glycerol-3-phosphate + ADP上式中形成的ADP在丙酮酸激酶(PK)的催化下可与PEP作用，生成ATP及丙酮酸酯(2) ADP + PEP (PK) ATP + pyruvate丙酮酸酯在L-乳酸酯脱氢酶(L-LDH)的作用下可被NADH还原为L-乳酸酯，NADH被氧化为NAD(3) Pyruvate + NADH + H+ (L-LDH) L-lactate + NAD+被氧化的NADH的量取决于甘油的量，NADH的吸光度值可在340下测量。特异性, 灵敏度, 测量范围和精确度:该实验方法是专门用于测定甘油含量的，对于纯甘油（水中的游离甘油）几乎可以100%检测到。最小可调吸光光度为0.010个吸光单位，样品体积为2.00 mL，若在340nm下检测,此时的甘油浓度为0.171 mg/L。如果最小可调吸光光度为0.020吸光光度，样品体积为2.00 mL，在340nm下检测,此时的甘油检测线为0.342 mg/L。该实验的测量范围为0.8ug-35ug甘油，同一样品分别进行两次测定，其吸光度值会有0.005-0.010吸光单位的变化，对于样品体积为2.00 mL，此时的甘油浓度大约在0.086-0.171 mg/L之间，如果样品是经过稀释的，在计算结果时候需要乘以相应的稀释系数（F）,如果在样品制备阶段，样品的重量是被称量的，如：10g/L,0.02-0.05g/100g的细微差别能够被分辨。干扰:如果甘油在试验规定的时间内（大约5分钟）完成转化过程，通常认为没有干扰发生，然而，通过向已完成反应的试管中添加甘油（0.1mL中添加20ug），进一步的实验表明，吸光度值还会进一步降低。利用附带的内部的标准质控可以对干扰物质进行鉴定。定量回收试验：通过向样品中添加标准质控，计算样品在处理和提取时的损失。如：在最初的提取步骤时添加一定量的甘油。安全性:甘油测定所使用的试剂没有有毒物质。然而浓缩缓冲液中含有作为防腐剂用的叠氮化钠(0.02 % w/v)，需要按照实验室安全操作规程进行试验。试剂盒:Megazyme甘油含量测定试剂盒可以进行70次的测定试验，并提供有全部的试验方法：瓶1: Tris/HCl 缓冲液 (30 mL, 1.0 M, pH 7.4) +氯化镁(30 mM)+叠氮化钠(0.02 % w/v)稳定性> 2年，4C保存。瓶2: 药片(14个) 含有NADH+ATP +PEP稳定性> 2年，4C保存。瓶3: 丙酮酸激酶(600 U/mL)+L-乳酸酯脱氢酶(550 U/mL)悬浮液1.5mL稳定性> 2年，4C保存。瓶4: 甘油激酶悬浮液(1.5 mL, 85 U/mL)稳定性> 2年，4C保存。瓶5: 甘油质控标准液(5 mL, 0.20 mg/mL)+ 0.02 % (w/v)叠氮化钠稳定性> 2年，4C保存。试剂制备:1. 使用瓶1作为稀释液。2. 1.1 mL Tris/HCl缓冲液溶解瓶2中1片药片，大约1-2分钟，足够进行5次试验。一旦药片溶解，NADH吸光度会随着时间的延长而降低，不过溶解的药片保存在4C下大约可以使用4天，或保存于-20C下大约可以使用4周的时间。注意: 在打开瓶子前，首先需要将瓶子中的药片恢复到室温，避免潮气可能吸附到药片上，而影响药片的稳定性。3 & 4. 准备瓶3和瓶4种的溶液，第一次打开前，需要充分晃动瓶子，不要让酶吸附在橡皮塞上，然后垂直存放好瓶子。每次使用前还需要充分混合其中的内溶物。5. 准备瓶5溶液。注意:当您怀疑分光光度计的准确性或怀疑样品中的物质抑制了试验，再使用甘油标准质控溶液进行测定，通过测量NADH的消光系数而计算甘油的浓度。实验需要的设备:1. 容量瓶(50 mL, 100 mL和500 mL).2. 比色杯 (1 cm, 3.0 mL).3. 微量移液器4. 连续分配器5. 分析天平6. 分光光度计 340 nm.7. 漩涡混合器8. 定时钟9. Whatman No.1 (9 cm)滤纸操作步骤:波长: 340 nm比色杯: 1 cm light path (玻璃或塑料)温度: 25C最终体积: 2.34 mL样品溶液: 每个比色杯中含有0.8-35ug甘油（存在于0.10-2.0 mL样品溶液中）空白调 0：相对于空气或者水溶液 空白管 样品管蒸馏水( 25C)样品溶液2(NADH/ATP/PEP/Tris/HCl)悬浮液3(PK/L-LDH) 2.10 mL0.20 mL0.02 mL 2.00 mL0.10 mL0.20 mL0.02 mL混合*，在反应大约4分钟后读取溶液(A1)的吸光度值（前反应完成*），在添加下列试剂后继续进行试验悬浮液4(GK) 0.02 mL 0.02 mL混合*，在停止反应后（大约5分钟）读取溶液(A2)的吸光度值，如果反应没停止，在间隔2分钟后，再次测量，直到最终的吸光度值不再变化。* 用塑料棒搅拌或用试管塞封闭严实后轻轻颠倒* 必须在等到前反应完成后再添加悬浮液3(PK/L-LDH)计算:分别对空白管和样品管两次测得的吸光度值进行相减(A1-A2)，这样就获得了Aglycerol，按照常规Aglycerol 的数值至少要在0.100个吸光单位，才能获得满意的试验结果。甘油的含量可以依照下列公式计算:C = V x MW x Aglycerol g/Lx d x v注释:V = 最终体积 mLMW = 甘油分子量 g/mol = NADH在340 nm下的消光系数 = 6300 l x mol-1 x cm-1d = 比色管管径 cmv = 样品体积 mL简化公式:C = 2.34 x 92.1 x Aglycerol g/L6300 x 1 x 0.10= 0.3421 x Aglycerol g/L如果样品在制备过程中被稀释了，计算结果还必须乘以稀释系数F。当被分析的物质为固体或半固体时，甘油含量(g/100 g)依照下列公式计算：甘油含量= C甘油 g/L 样品溶液 x 100 g/100 g样品重量 g/L 样品溶液注意: 使用Mega-CalcTM，该计算方法可以被简化。 制备样品:1. 稀释样品.比色杯中（如：分析0.1 mL的样品）的甘油总含量必须在0.8-25ug之间，因此样品溶液必须被充分的稀释到浓度在0.008 -0.35 g/L之间。估计浓度(g/L) 蒸馏水稀释 稀释系数F< 0.350.35-3.53.5-35> 35 不用稀释1 + 91 + 991 + 999 1101001000如果Aglycerol 的数值太低(如< 0.100)，可以增加称量的样品量或不要进行过分稀释，也可以增加比色管中的样品量到2.00 mL，只要确保样品和蒸馏水的总量在2.10 mL即可。2. 净化样品.a. 溶液:Carrez I溶液：溶解3.60 g亚铁氰化钾K4Fe(CN)6.3H2O (Sigma cat. no. P-9387)到100 mL的蒸馏水中，室温保存。Carrez II溶液： 溶解7.20 g硫酸锌(ZnSO4.7H2O) (Sigma cat. no. Z-4750) 到100 mL的蒸馏水中，室温保存。氢氧化钠(NaOH, 100 mM)：溶解4 g NaOH到1 mL的蒸馏水中，室温保存。b. 步骤:吸取液体样品到含有大约60 mL蒸馏水的100 mL容量瓶中，或称取足够量的样品到含有大约60 mL蒸馏水的100 mL容量瓶中，缓慢的加入5mL Carrez I 溶液和10mL NaOH溶液(100 mM)，然后充分混合，补液至刻度线，混合并过滤。3. 总则.(a) 液体样品: 清澈的或稍有些颜色的，pH大约为中性的液体样品可以直接检测。(b) 酸性样品: 如果样品为> 0.1 mL的未被稀释的酸性样品（如葡萄酒或果汁），必须用2 M NaOH调节pH到大约7.4，然后在室温中孵育30分钟。(c) 含二氧化碳样品: 样品中含有大量的二氧化碳，如：啤酒，必须用2 M NaOH调节pH到大约7.4，并缓慢的用玻璃棒搅拌。(d) 有颜色的样品: 测试中附加样品空白，如：样品中不含有GK，在这种情况下，样品必须附加样品空白。(e) 重颜色的样品: 如果未经稀释的样品颜色非常深，需要向每10mL的样品中加入0.2g聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP），充分混合5分钟，然后用Whatman No. 1滤纸过滤。(f) 固体样品: 均质或粉碎固体样品，然后加入到蒸馏水中，并过滤。(g) 样品含有脂肪: 需要用超过脂肪沸点的水进行提取，如：将100mL容量瓶加热到60C，然后恢复至室温，并补液至刻度线，放置冷藏箱中15-30分钟，过滤，弃去最初的几mL滤液，选择澄清的或稍有些乳白色的悬浮液进行测试。也可以选择使用Carrez 溶液进行澄清。(h) 样品中含有蛋白: 使用Carrez 溶液去除样品中的蛋白。样品处理事例:(a) 测定葡萄酒中的甘油.通常情况下，测定白/红葡萄酒中的甘油含量都不需要对样品进行处理，只需要依照稀释表格进行稀释即可。如：按照1:20倍稀释0.1mL的样品。(b) 测定啤酒中的甘油含量.使用玻璃棒进行充分的搅拌，去除样品中的二氧化碳，然后进行稀释即可测定。如：按照1:5倍稀释0.1mL的样品。(c) 测定果汁和相关饮料中的甘油含量稀释样品中的甘油含量至少到0.35 g/L，澄清的、中性的样液可以直接进行测试，不需要进行特殊处理。浑浊的液体稀释前首先需要进行过滤。有颜色的样品溶液通常在稀释到适当的甘油浓度即可测定。然而，如果要测定不经稀释的样品液中的甘油浓度，需要依照下列步骤进行脱色：用1 M NaOH调节25mL样品溶液的pH大约至7.4，然后用蒸馏水补液至50 mL，加入0.5g PVPP，充分搅拌5分钟，然后用Whatman No. 1滤纸过滤。使用澄清的或稍有些颜色的提取液进行测试。没有必要进一步稀释，可以直接进行测定。(d) 测定烟草制品中的甘油含量.将样品粉碎成大约0.2 mm的小颗粒，准确的称量1g样品，放入到100 mL容量瓶中，加入大约60 mL蒸馏水，用磁力搅拌器在20-25C下充分搅拌1小时，然后用蒸馏水补液至刻度线，混合并过滤。移取25 mL滤液到50mL容量瓶中，继续加入5 mL Carrez I 溶液、5 mL Carrez II 溶液和10 mL NaOH溶液(100 mM)，每加一种溶液都要充分混合，然后补液至刻度线，混合并用Whatman GF/A玻璃纤维滤纸过滤，没有必要进一步稀释，可以直接进行测定。(e) 测定肥皂中的甘油含量.准确称取1 g粉碎的肥皂粉末，加入50mL 0.1M HCl ，用热磁力搅